全 文 ：[ 收稿日期] 2002-03-26　　　[ 修回日期] 2002-04-21
E-mail:tgh1973y@yahoo.com
[ 文章编号] 　1000-4718(2002)07-0834-03
艾麻口服液对慢性支气管炎大鼠支气管 TNFα、
ICAM-1蛋白及 mRNA表达的影响
唐光华1 , 　黄启福2 , 　姜良铎1
( 1北京中医药大学东直门医院 , 北京 100700;2北京中医药大学病理学教研室 , 北京 100029)
　　[ 摘　要] 　目的:研究中药复方“艾麻口服液”对慢性支气管炎(chronic bronchitis , CB)支气管 TNFα、ICAM-1 蛋
白及mRNA 表达的影响 ,探讨其治疗 CB 的疗效机制。方法:雄性Wistar 大鼠随机分为假手术(Sham)组 、慢支(CB)组
和慢支+艾麻口服液治疗(CB+AM)组 , 每组 5只。大鼠 CB 模型通过气管内注入低剂量脂多糖制成 , 利用免疫组织
化学和原位杂交法并结合半定量图像分析技术观察各组大鼠支气管 TNFα、ICAM-1蛋白 、mRNA的表达情况。结果:
Sham 组支气管上皮细胞中可见 TNFα、ICAM-1蛋白和 mRNA弱阳性表达;CB组 TNFα蛋白和 mRNA在支气管上皮细
胞 、支气管周围的淋巴滤泡炎性细胞和肺泡间质炎性细胞中可见强阳性表达 , ICAM-1 蛋白和 mRNA 在 CB 组支气
管上皮细胞中可见阳性表达。半定量图像分析显示 , CB组支气管上皮细胞中 TNFα、ICAM-1 蛋白 、mRNA表达明显
强于 Sham 组(P<0.01), CB+AM 组的表达则明显弱于 CB 组(P<0.05)。结论:下调 CB 支气管上皮细胞中 TNFα、I-
CAM-1 mRNA和蛋白的表达 , 从而减轻气道炎症反应是艾麻口服液治疗 CB 有效的部分机制。
[ 关键词] 　脂多糖类;支气管炎;中药;肿瘤坏死因子;RNA , 信使;原位杂交;大鼠
　　[ 中图分类号] 　R562.2+1　　　[ 文献标识码] 　A
　　慢性支气管炎(chronic bronchitis , CB)是严重危
害人民身体健康的常见病和多发病。近年来 ,CB气
道炎症的研究受到了关注。研究显示 ,CB存在明显
的气道炎症 ,它是以中性粒细胞(polymorphonuclear
leukocyte , PMN)气道浸润为主要特征的慢性炎症反
应[ 1] 。气道炎症性疾病中 ,由于炎性因子如 TNFα等
的释放 ,趋化因子 IL -8等的表达[ 2] ,粘附分子如 I-
CAM-1[ 3]等的上调表达 ,中性粒细胞的粘附 、浸润 ,
大量活性氧的产生 、各种蛋白酶的释放 ,最终导致组
织的损伤。因此 ,气道炎症是 CB病生理机制中的一
个关键环节。
目前尚无阻断慢支气道炎症的特效制剂 ,糖皮
质激素对于 CB气道炎症也是疗效不佳[ 4] ,因此 ,研
究治疗慢支气道炎症的有效药物具有重要意义。中
药“艾麻口服液”具有平喘 、止咳 、化痰 、改善微循环 、
抗炎 、抗过敏等药效 ,我们在既往的研究中证实其具
有减轻CB支气管炎症和改善支气管病理损伤的作
用(未发表资料)。本实验是在既往研究基础上 ,观
察其对CB支气管TNFα、ICAM-1蛋白及mRNA表达
的的影响 ,以阐明其部分疗效机制 。
材　料　和　方　法
1　实验用药及主要试剂
艾麻口服液:由北京中医药大学中药学院制剂
室制备 ,主要成分有艾叶挥发油 、麻黄碱 、黄芩总甙 、
丹参素等。精制脂多糖(lipopolysaccharides , LPS),购
自美国 Sigma公司。TNFα、ICAM-1免疫组化及原位
杂交试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司 ,余
试剂均为分析纯 ,北京化学试剂厂生产。
2　主要实验仪器
　　LKB5 型超薄切片机 、VX 型万能显微镜(日本
OLYMPUS)、SPOT 数码相机(美国 DIAGNGSTIC 公
司)、Metamorph图像分析软件(美国 Universal Imaging
Corporation)。
3　动物及分组处理
大鼠 CB模型的复制 ,参照文献[ 5]并有改动 。
雄性Wistar 大鼠 15只 ,由北京大学医学部实验
动物中心提供 ,体重 200 g±10 g ,鼠龄 12周 ,适应性
喂养 3 d后 ,随机分为 3组:慢性支气管炎(简称 CB)
组:5只 ,用 2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻
醉 ,仰卧位固定于操作台 ,常规消毒 ,纵向切开颈部 ,
分离皮下 ,暴露气管 ,4号针头穿刺气管 ,注入浓度为
1 g/L(0.9%的生理盐水稀释)的脂多糖 200 μL ,从第
8 d开始 ,每天用 0.9%生理盐水 2 mL 灌胃 ,共 21 d;
假手术(简称 sham)组 5只 ,除气管注入液以生理盐
水代替 LPS外 ,余处理同 CB 组;慢性支气管炎+艾
麻口服液治疗(简称 CB+AM)组:5只 ,按 CB组方法
复制动物模型 ,从第8 d起每天给予艾麻口服液 2mL
(含生药 2 000 g/L)灌胃 ,共 21 d 。
·834· 中国病理生理杂志　Chinese Journal of Pathophysiology　2002 , 18(7):834-836
4　观察指标
肺组织石蜡切片 ICAM-1及 TNFα免疫组织化
学染色和原位杂交。
自大鼠右肺中叶距肺门 1/3 处矢状面横贯取
材 ,在 4℃生理水中漂洗干净 ,立即投入含有 0.1%
DEPC水处理的4%的甲醛溶液中固定 ,用超薄切片
机切成 5 μm 厚的切片。贴于免疫组化及原位杂交
专用载玻片上。加入干燥剂后 ,密封保存于 4℃冰箱
中备用。
免疫组化及原位杂交方法按照试剂盒说明书进
行(具体步骤略),组织化学染色均用DAB显色 ,蛋白
及mRNA表达阳性结果的判定标准为:表达细胞的
胞浆中出现棕黄色颗粒 ,颜色越深 ,表示表达强;如
细胞中未出现棕黄色颗粒 ,则表达为阴性 。蛋白及
RNA表达平均吸光度(A)测量方法为:在图像分析系
统上(在 20倍光镜下),每张切片随机选取直径在
200μm 至300 μm的支气管 5支 ,测定管内上皮层细
胞区域的吸光度(A),取其平均值间接作为该只大鼠
的蛋白和 mRNA表达量 。
5　统计学处理
各组数据均值以 x ±s表示 ,用SAS统计软件包
进行方差分析和 q 检验 。
结　　果
1　TNFα蛋白及mRNA表达检测
TNFα蛋白和 mRNA 在 sham组支气管上皮细胞
中可见弱阳性表达;在 CB 组的支气管上皮细胞 、支
气管周围的淋巴滤泡炎性细胞及肺泡间质炎性细胞
中可见强阳性表达 。半定量图像分析示:CB组在支
气管上皮细胞中的表达明显强于 sham 组;CB+AM
组中在支气管上皮细胞中也是阳性表达 ,表达强度
明显弱于 CB组(P <0.05)。各组大鼠支气管上皮细
胞平均吸光度(A)结果见表 1;CB组和 CB+AM 组
TNFα蛋白及mRNA表达分别见图 1和图 2(图 1 、2 ,
见加页Ⅲ)。
表 1　艾麻口服液对 CB大鼠支气管上皮 TNFα蛋白及 mR-
NA表达的影响
Tab 1 　The effect of AM on the protein and mRNA expression of
TNFαin the bronchial epithelium of rats with chronic bron-
chitis( x±s.n =5)
Group
Average A
mRNA Protein
Sham 0.112±0.012 0.068±0.008
CB 0.154±0.013＊ 0.097±0.011＊
CB+AM 0.131±0.009# 0.079±0.006#
　＊P<0.01 vs sham;#P <0.05 vs CB.AM:Aima recipe , a
traditional Chinese medicine.
2　ICAM-1蛋白及mRNA表达
ICAM-1蛋白和mRNA在 sham组的支气管上皮
细胞中可见弱阳性表达;在 CB组支气管上皮细胞
中呈阳性表达。半定量图像分析示:ICAM-1 蛋白
和mRNA 在 CB组支气管上皮细胞中的表达明显强
于 sham组 , P<0.01;CB+AM 组则明显弱于 CB 组 ,
P<0.05。各组大鼠支气管上皮细胞平均吸光度
(A)结果见表 2。
表2　艾麻口服液对 CB 大鼠支气管上皮 ICAM-1 蛋白及
mRNA表达的影响
Tab 2 　The effect of AM on the protein and mRNA expression of
ICAM-1 in the bronchial epithelium of rats with chronic
bronchitis( x±s.n=5)
Group
Average A
mRNA Protein
Sham 0.096±0.004 0.046±0.006
CB 0.150±0.018＊ 0.110±0.012＊
CB+AM 0.127±0.005# 0.087±0.009#
　＊P<0.01 vs sham;#P <0.05 vs CB.
讨　　论
慢性支气管炎属于气道炎症性疾病 ,由于慢支
气道中中性粒细胞数显著升高 、过度激活导致蛋白
水解酶 、髓过氧化物酶 、氧自由基及细胞因子的释
放[ 6] ,从而造成支气管肺组织损伤 ,气道防御力下
降 ,下呼吸道细菌定殖 ,呼吸道感染反复发作。慢支
气道炎症的启动是由于各种生物或理化刺激导致气
道TNFα等促炎因子的释放 ,从而上调 IL-8 、ICAM-
1等因子表达 ,从而引起以中性粒细胞为主的炎细胞
定向聚集于气道 。
慢支气道炎症中 ,TNFα是一个重要的促炎因子。
研究显示 ,TNFα特异性的中和抗体可以保护动物抵
抗流感嗜血杆菌内毒素所致的气道损伤[ 7] ,这说明
TNFα在慢支炎症机制中起重要作用。 ICAM-1(细
胞间粘附分子-1)是体内重要的粘附分子 ,其主要
功能是介导中性粒细胞与内皮细胞的加强粘附 ,富
集中性粒细胞到炎症区 ,参与细胞内信号转导 。 I-
CAM-1表达的增加常能促进或加剧多种疾病的发
生和发展 ,如 ICAM-1的表达被下调或细胞因子诱
导的 ICAM-1 的表达被抑制 ,炎症反应即减弱 。运
用 ICAM-1的单抗可显著抑制 LPS 或 TNFα诱导的
人中性粒细胞的粘附和聚集作用[ 8] 。因此 ,减轻慢
支气道中TNFα的分泌 , ICAM-1的表达是阻断或减
轻慢支气道炎症及支气管肺组织损伤的一个重要环
节。
·835·
中药复方制剂“艾麻口服液”能减轻慢支支气管
炎症和改善支气管病理损伤 ,其治疗慢支的部分机
制是否与调低慢支气道 TNFα和 ICAM-1 蛋白及
mRNA表达 ,从而减轻支气管炎症是本次实验的重
点。本实验的结果显示 ,艾麻口服液确能降低慢支
支气管上皮细胞中 TNFα、ICAM -1 蛋白及 mRNA 的
表达(P <0.05),同时也能减轻支气管周围的淋巴滤
泡中的炎性细胞和肺泡间质中的炎性细胞中 TNFα
蛋白和 mRNA 表达。结果提示 , “艾麻口服液”治疗
慢支有效的部分机制是减少支气管上皮细胞及气道
炎性细胞中炎症因子 TNFα表达 ,从而减少中性粒细
胞向气道中趋化 ,减轻气道炎症及其所造成的支气
管肺组织损伤。
目前尚无治疗慢支气道炎症的特效药物 ,因此 ,
研究相关制剂 ,提高慢支气道炎症防治水平 ,具有重
要意义。本实验的结果为研制治疗慢支等气道炎症
性疾病有效中药复方制剂提供了一定的实验依据 。
[ 参　考　文　献]
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Effect of Aima recipe on the protein and mRNA expression of TNFαand
ICAM-1 in the bronchus of rats with chronic bronchitis
TANG Guang-hua1 , HUANG Qi-fu2 , JIANG Liang-duo1
(1Beijing Dongzhimen Hospital , Beijing University of Traditional Chinese Medicine , Beijing 100700 , China;
2Department of Pathology , Beijing University of Traditional Chinese Medicine , Beijing 100029 , China)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:To study the effect of Aima recipe(AM), a traditional Chinese medicine , on the protein
and mRNA expression of TNFαand ICAM-1 in the bronchus of rats with chronic bronchitis(CB).METHODS:15
male Wistar rats were randomly divided into three groups:control group , chronic bronchitis(CB)group , CB plus AM
group.The protein and mRNA expression of TNFαand ICAM-1 were assayed by immunohistochemistry and in situ hy-
bridization methods.RESULTS:TNFα, ICAM -1 protein and mRNA were more strongly expressed in the area of
bronchial epithelium in the CB group compared with control group (P <0.01), treatment with AM significantly de-
creased their expressions(P <0.05).CONCLUSION:Downregulating the expressions of TNFαand ICAM-1 mRNA
and protein in the area of bronchial epithelium may be one of the mechanisms underlying therapeutic effect of AM on
chronic bronchitis.
[ KEY WORDS] 　Lipopolysaccharides;Bronchitis;Chinese herbs;Tumor necrosis factor;RNA , messenger;In
situ hybridization;Rats
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