全 文 ：• 2297 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2013年 8 月第28卷第8期 CJTCMP , August 2013, Vol .28, No. 8
·论著·
通讯作者：李灵芝，天津市河东区成林道222号武警后勤学院药化教研室，邮编：300162，电话：022-60578184，E-mail: llzhx@yahoo.cn
张永亮，天津市河东区成林道222号武警后勤学院训练部，邮编：300162，电话：022-60578101，E-mail: zhang78127@tom.com
蕨麻乙醇提取物对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的
保护作用及相关机制
秦晓静1，吕琪2，张新宁2，陈福泉2，李灵芝2,3，张永亮2,3
（1武警后勤学院附属医院，天津 300162；2武警后勤学院，天津 300162； 3天津市职业与
环境危害生物标志物重点实验室，天津 300162）
摘要：目的：研究蕨麻乙醇提取物对急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法：雄性SD大鼠随
机分为假手术对照组，模型组，蕨麻乙醇提取物干预组，阳性药物组。建立急性心肌缺血再灌注损伤模型，测
定心功能变化，血清学检测乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛
（MDA）、一氧化氮（NO）含量；透射电镜观察超微结构变化，免疫组化检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表
达。结果：与模型组相比，蕨麻乙醇提取物能够明显改善心功能指标及心肌细胞超微结构，降低LDH、CK水平，
减少MDA、NO产生，提高SOD活性，抑制iNOS表达。结论：蕨麻乙醇提取物对急性心肌缺血再灌注所致心肌损伤
具有保护作用，其可能是通过提高机体抗氧化能力，抑制NO生成而实现的。
关键词：蕨麻乙醇提取物；心肌缺血再灌注；氧自由基；透射电镜；诱导型一氧化氮合酶
基金资助：国家自然科学基金项目（N o.30672774，N o.81073152），天津市自然科学基金重点项目
（No.10JCZDJC21100）
Protective effects and mechanism of alcohol extract of Potentilla anserine L. on acute
myocardial ischemia/reperfusion injury in rats
QIN Xiao-jing1, LV Qi2, ZHANG Xin-ning2, CHEN Fu-quan2, LI Ling-zhi2,3, ZHANG Yong-liang2,3
( 1Affiliated Hospital of Logistic University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China;
2Logistic University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China; 3Tianjin Key
Laboratory of Occupational and Environmental Hazard Biomarkers, Tianjin 300162, China )
Abstract: Objective: To study the protective effects and mechanism of alcohol extract of Potentilla anserina L. on acute
myocardial ischemia/reperfusion injury in rats. Methods: Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group
and injury groups which were subdivided into model and diltiazem groups, intervention groups of alcohol extract of Potentilla
anserina L. The index of cardiac functionhaemodynamics was recorded. Activity of LDH, CK, SOD and productions of MDA,
NO in serum were measured. The ultra-construction change of mitochondrion and glycogen in myocardial cell was observed by
electron microscope. The expression of iNOS was evaluated by immunohistochemistry. Results: Pretreatment with alcohol extract
of Potentilla anserina L. could significantly improve homodynamic myocardial functional parameters after I/R injury, degrade
the activities of LDH and CK, reduce myocardial ischemia-reperfusion injury caused by swelling of mitochondria vacuoles,
and inhibit the production of MDA and NO, enhanced the activity of SOD, attenuated the expression of iNOS. Conclusion:
Pretreatment with alcohol extract of Potentilla anserina L. could protect the myocardial function from acute myocardial ischemia
and reperfusion injury in rats, which may be achieved by enhancing the activity of SOD, increasing the clearance of ROS, and
attenuating the production of NO.
Key words: Alcohol extract of Potentilla anserina L.; Myocardial ischemia/reperfusion; Reactive oxygen
species(ROS); Transmission electron microscope; iNOS
Fund assistance: National Natural Science Foundation of China (No.30672774, No.81073152), Key Program of
Natural Science Foundation of Tianjin (No.10JCZDJC21100)
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心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia /
reperfusion injury，MI/RI）是动脉搭桥术、冠脉血管
形成术、溶栓疗法等血管再通术，以及心脏外科体外
循环术等临床的常见并发症之一，严重影响着病人的
生命，且限制了临床上一些新疗法的开展。目前认为
参与心肌缺血再灌注损伤的可能机制有如下几点：
氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内
皮细胞（VEC）、一氧化氮（NO）中性粒细胞和细胞
凋亡等[1-3]。中药作为中医学的瑰宝，中药复方含多味
中药，单味药又含有多种成分，因此中药可通过多层
次，多靶点，多环节发挥作用，从这种意义上讲，中
药在心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗中有着自身
的特点及优势[4]。
蕨麻（Potentilla anserine L.），俗称人参果，藏
名“卓老洒曾”，为蔷薇科植物鹅绒萎陵菜的地下块
根，主要产于我国青海、西藏等高寒地带。蕨麻具有
显著的抗缺氧、抗氧化、清除自由基作用[5]。本课题
组前期研究发现蕨麻乙醇提取物对慢性缺氧、急性
缺血的心肌组织均具有保护作用[6-7]。本研究通过建
立大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型，探讨蕨麻乙
醇提取物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，并在
前期研究的基础上进一步研究其保护机制，为开发
蕨麻的药用价值奠定理论基础。
材料与方法
1. 材料
1.1 药物 蕨麻乙醇提取物湿浸膏由本实验室
提取，1g浸膏相当于3.0g生药，含多糖、亚油酸、皂
苷等多种成分。临用前用3‰羧甲基纤维素制成混
悬液；恬尔心（盐酸地尔硫卓）由上海制药厂生产，
30mg/片（批号：050104）。
1.2 试剂 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，
LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，
SOD）、肌酸激酶（creat ine kinase，CK）、丙二
醛（malonaldehyde，MDA）、一氧化氮（nitrogen
monoxidum，NO）试剂盒为南京建成生物工程研究所
产品；戊二醛购自天津福辰化学试剂厂；氨基甲酸乙
酯（乌拉坦）、羧甲基纤维素购自天津科瑞斯公司。
诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，
iNOS）抗体购自Santa Cruz，SP三步法试剂盒购自中
杉金桥。
1.3 动物 清洁级雄性SD大鼠96只，体质量
（250±20）g，军事医学科学院动物试验中心提供，
许可证号：SCK-（军）2002-001。
1.4 仪器与设备 紫外可见分光光度计（日本岛
津），高速低温离心机（德国 Eppendorf公司），MPA-5
多道生理记录仪（第二军医大学），FA2004 电子天平
（上海精科天平）。
2. 方法
2.1 分组与给药 取96只健康雄性SD大鼠随
机分为6组：假手术对照组、模型组、阳性药物（恬
尔心30mg/kg）对照组及蕨麻乙醇提取物0.9、1.8、
3.6g/kg3个剂量组，每组16只。每天灌胃给药1次，连
续灌胃给药14d，假手术对照组、模型组灌胃给予等
容积3‰羧甲基纤维素14d。恬尔心组灌胃给予等容
积3‰羧甲基纤维素钠13d，该组于复制动物模型前
2h 1次灌胃给予药物。
2.2 模型的复制 末次给药后2h复制动物模型，
大鼠腹腔注射乌拉坦1g/kg腹腔浅麻醉，大鼠背位固
定于动物手术台上。连接皮下导联，记录大鼠基础心
电图。沿胸骨左缘3-4肋间开胸，暴露心脏，分离心
包，挤出心脏，在左冠状动脉前降支距左心耳下缘
2mm处穿线，在结扎线下垫一皮筋，迅速结扎左冠
状动脉，随即可见心脏前侧壁颜色变成青紫色，还纳
心脏，闭合胸腔。待大鼠恢复平稳自主呼吸后观察动
物心电图的改变，以Ⅱ导联ST段明显抬高者纳入后
续实验，不符合者弃之不用。其中假手术对照组只穿
线不结扎。30min后二次开胸，挤出心脏，剪掉皮筋，
恢复冠脉左前降支血供，还纳心脏，闭合胸腔。
2.3 血流动力学检测 各组大鼠在缺血30min
再灌注30min时，记录左室收缩末压（left ventricular
systol ic pressure，LVSP）、左室舒张 末压（lef t
ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）和左室内
压最大变化速率（the max rate of rise of left ventricular
pressure，±dp/dt max）等血流动力学指标。
2.4 生化指标检测 缺血30min再灌注120min
时，行腹主动脉取血，低温4℃，3 0 0 0r/min离心
10min，分离血清，按照试剂盒说明书用紫外分光光度
法检测LDH、SOD、CK、MDA、NO等血清生化指标。
2.5 透射电镜观察 缺血30min再灌注120min
后，取切断血供的大鼠心脏，在预冷的0.9%氯化钠溶
液中洗净血液，在病变部位切取3mm×1mm×1mm心
肌组织块，放入4%戊二醛固定液中，送河北医科大
学电镜中心后续处理并行透射电镜观测。
2.6 iNOS蛋白免疫化学染色（SP三步法） 心
肌石蜡切片脱蜡至水，0.01mol/L PBS浸洗5min，浸
入枸橼酸盐缓冲液（pH值6.0）中，高压蒸汽抗原热
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组别
假手术对照组
模型组
恬尔心组
蕨麻高剂量组
蕨麻中剂量组
蕨麻低剂量组
LVSP
（mmHg）
87.63±14.43
68.34±11.23△△
80.11±16.01
82.82±11.06*
83.07±14.05*
80.04±15.93
LVEDP
（mmHg）
6.49±1.73
6.24±1.45
1.65±0.40**
2.00±0.46**
2.25±0.42**
1.69±0.45**
+dp/dt
（mmHg/s）
3 761±842
2 161±566△
4 276±1 243**
4 128±984**
4 357±1 061**
4 327±1 094**
-dp/dt
（mmHg/s）
2 550±955
1 718±572△
2 516±946*
2 806±727**
2 831±865**
2 938±986**
表1 各组缺血30min再灌注30min后大鼠的血流动力学
指标比较（x-±s，n=10）
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术对照组比较，
ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。下表同。
修复2min，冷却后，3%H2O2室温孵育10min，PBS浸
洗（5min×3），滴加A液（正常山羊血清），室温孵育
30min，滴加一抗工作液湿盒中4℃过夜，0.01mol/L PBS
浸洗（5min×3），滴加B液（生物素化二抗），37℃孵
育15min，PBS浸洗（5min×3），滴加C液（SP复合物），
37℃孵育30min，PBS浸洗（5min×3），DAB显色剂显色，
自来水充分冲洗，复染胞核，脱水、透明、封片。
2.7 统计学方法 采用SPSS 10.0统计分析软件
处理数据，计量资料以x-+s表示，结果以多组均数
比较用方差分析，组间差异的比较采用LSD法，以
P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1. 蕨麻乙醇提取物对缺血再灌注损伤后心功能
的影响 结果见表1。与假手术对照组相比，LVSP及
±dp/dt max显著下降（P<0.05，P<0.01）。而与模型
组比较，给予高、中剂量蕨麻乙醇提取物可显著升高
LVSP（P<0.05），蕨麻乙醇提取物各剂量组LVEDP、
±dp/dt max与模型组相比均有显著改善（P<0.01）。
组别
假手术对照组
模型组
恬尔心组
蕨麻高剂量组
蕨麻中剂量组
蕨麻低剂量组
相对表达量
1.03±0.24
40.26±4.38ΔΔ
5.63±1.23**
2.26±0.43**
4.87±0.96**
8.36±1.37**
表3 各组缺血再灌注大鼠的iNOS表达比较（x-±s，n=10）
2. 大鼠血清中LDH、CK、SOD活性及MDA、NO
含量的变化 结果见表2。缺血再灌注损伤后，与假
手术对照组比较，模型组大鼠血清中CK、LDH活性
显著升高（P<0.01），MDA、NO含量显著升高，SOD活
力下降（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，给予各剂
量蕨麻乙醇提取物均可显著降低大鼠血清中LDH、CK
活性，减少MDA产生，提高SOD活性（P<0.01）。高、中
剂量组可减少NO产生（P<0.05，P<0.01）。
3. 透射电镜超微结构变化 假手术对照组可
见：心肌肌原纤维排列整齐，肌丝清晰，线粒体结构
完整，糖原颗粒丰富，核膜清晰完整，染色质较均匀
分布。模型组：核的一端严重水肿，线粒体糖原显著
减少，大部分线粒体嵴和膜融合或消失，肌纤维部分
排列紊乱，低倍视野下核的一端及肌纤维束之间明
显水肿，肌节排列稍紊乱。蕨麻乙醇提取物高剂量组
心肌线粒体结构与手术对照组相比基本无改变，糖
原含量丰富，肌节排列基本整齐，明显优于模型组。
蕨麻乙醇提物中、低剂量组线粒体膜结构较模型组
亦有显著改善，糖原稍减，但仍较模型组丰富，肌节
大部分排列整齐，部分排列紊乱。给予蕨麻乙醇提
取物可显著改善损伤引起的心肌组织超微结构改
变。恬尔心组肌节排列基本整齐，核的一端糖原颗粒
较模型组显著增多，线粒体有轻度髓样化，线粒体
嵴和膜融合现象较模型组明显减轻，心肌超微结构
较模型组有明显改善。
讨论
心肌缺血再 灌注损伤时可产生大量的氧自由
基，过多的氧自由基可激发链式脂质过氧化反应造
成细胞膜的损伤[8]。体内自由基水平的高低，除了与
其产生的量有关，还与清除的机制有关。SOD是体内
清除自由基的重要物质之一，当体内SOD产生不足或
消耗过多时，可使自由基的水平明显提高，加重组织
组别
假手术对照组
模型组
恬尔心组
蕨麻高剂量组
蕨麻中剂量组
蕨麻低剂量组
LDH
（U/L）
3 137±536
5 838±1 000ΔΔ
4 045±972**
4 488±1 016**
4 767±1 313**
4 378±530**
CK
（UmL/L）
0.52±0.13
4.40±0.50ΔΔ
3.29±0.58**
2.52±0.81**
3.12±0.70**
3.67±0.64**
SOD
（UmL/L）
146.56±8.94
138.89±3.66Δ
140.69±6.06
165.96±4.83**
159.45±5.99**
154.50±4.64**
MDA
（nmol/mL）
2.46±0.93
4.72±0.68ΔΔ
2.48±0.52*
1.91±0.39**
1.92±0.34**
2.12±0.33**
NO
（μmol/mL）
36.84±14.92
46.26±9.37Δ
34.14±4.72**
28.74±3.76**
36.85±7.14*
38.53±6.00
表2 各组缺血再灌注大鼠的LDH、CK、MDA、SOD和
NO比较（x-±s，n=10）
4. iNOS免疫组织化学染色结果 见表3。假手
术对照组大鼠心肌组织iNOS蛋白表达水平很低，
模型组较假手术对照组比iNOS蛋白表达水平升高
近40倍（P<0.01）。与模型组比较，各剂量蕨麻乙醇
提取物可显著降低大鼠心肌组织中iNOS蛋白含量
（P<0.01）。
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的损伤。本实验中给予不同剂量蕨麻乙醇提取物均
可使MDA含量均显著下降，SOD活力显著升高，说明
蕨麻乙醇提取物可通过抗氧化作用减轻缺血再灌注
中由氧自由基升高引起的损伤。
线粒体是心肌细胞的重要产能细胞器，糖原是
心肌细胞提供能量的重要物质。当心肌细胞的功
能受到影响以后，首先表现为糖原含量明显下降，
随之线粒体的功能也下降，超微结构出现一系列改
变，如线粒体的嵴膜融合或者消失，线粒体的数量
也开始下降[9]。本研究中高剂量蕨麻乙醇提取物组
心肌线粒体结构与假手术对照组相比基本无改变，
线粒体数量和糖原的数量也维持在较高的水平，表
明蕨麻乙醇提取物可较好的维持线粒体功能和改
善能量代谢。
NO作为一种调节心血管系统功能重要的细胞信
使分子，其在MI/RI中的“保护作用”和“毒性作用”
越来越受到科研工作者的重视，并逐渐成为心血管
领域的研究热点。内源性NO是在活体组织中由L-精
氨酸（L-arginine，L-Arg）与氧反应，生成胍氨酸时
其胍基被羟化而成的一种血管活性物质，其中NOS
是NO合成的限速酶。心肌组织内的NOS同功酶有两
种，内皮型（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）
和诱导型（iNOS）。eNOS主要由血管内皮细胞产生，
而iNOS主要产生于巨噬细胞中。在缺血再灌注损伤
早期，NO对心肌损伤主要发挥保护作用，而到再灌
注后期，NO的过度生成，特别是iNOS诱导生成的NO
可介导心肌缺血再灌注损伤。在生理状态下，心肌组
织内的iNOS活性很低；而心肌缺血再灌注损伤时，巨
噬细胞内iNOS mRNA表达受到多种细胞因子调控而
上调，立即产生大量iNOS，催化生成大量的NO[10]。
在本研究结果中，蕨麻乙醇提取物可抑制iNOS表达，
从而减少NO的生成，进而抑制了NO所介导的心肌缺
血再灌注损伤。
综上所述，通过本项研究发现蕨麻乙醇提取物
对MI/RI具有明显的保护作用，其机制可能与改善能
量代谢，提高机体抗氧化能力，抑制iNOS表达和NO
的过度生成，及维持线粒体功能有关。为进一步开
发蕨麻的药用价值提供依据。
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