全 文 ：　[收稿日期] 　2009-09-18;2010-03-20修回
　[基金项目] 　贵州省科学技术基金资助项目“信号物质对金线兰逆境蛋白产生的调控作用研究”[ 黔科合 J字(2008)2097]
　[作者简介] 　张奎一(1983-),男 ,在读硕士 ,研究方向:植物生物化学与分子生物学研究。 zhang kui one @163.com
　＊通讯作者:龚　宁。E-m ail:g n2033@126.com
[ 文章编号] 1001-3601(2010)04-0207-0033-02
不同培养基对金线兰愈伤组织诱导的影响
张奎一1 , 2 , 龚 宁1 ,2＊ , 邱 玥1 ,2 , 司庆永1 , 2
(1.贵州师范大学生命科学学院 , 贵州 贵阳 550001;2.贵州省山地环境信息系统与生态环境重点实验室 ,
贵州 贵阳 550001)
　　[摘　要] 应用正交设计法考察不同培养基和 4种植物生长物质对诱导金线兰愈伤组织生长的作用 ,研
究了不同培养基对金线兰愈伤组织诱导的影响。结果表明 , 6-BA 对诱导金线兰愈伤组织生长效果显著 ,2 ,
4-D 、NAA 和 KT 效果不显著;金线兰愈伤组织诱导的最佳培养基为 MS+2 , 4-D 3.0mg/L +6-BA 1.0mg/
L+NAA 0.5mg/L+KT 0.25mg/ L。[关键词] 金线兰;诱导;愈伤组织[中图分类号] S567.9 [文献标识码] A
Effect of Culture Medium on Callus Induction of Anoectochilus roxburghii
ZHANG Kui-yi1 , 2 , GONG Ning1 , 2＊ , Q IU Yue1 , 2 , SI Qing-yong1 , 2
(1.School of Li f e Sciences , Guizhou Normal University , Guiyang , Guizhou 550001;2.Guizhou Key Laboratory for
Mountainous Environmental In formation System and Ecological Environment , Guiyang , Guizhou 550001 , China)
　　Abstract:Culture medium and 4 plant grow th substances w ere studied for their function to callus
grow th o f A.roxburghii by orthogonal design.Results showed that 6-BA had significant effect on induced
callus grow th , while 2 , 4-D , NAA , and K T had not.The optimal culture medium for callus induction of
A.roxburghii.was MS+2 ,4-D 3.0mg/L +6-BA 1.0mg/L +NAA 0.5mg/L +K T 0.25mg/L.
Key words:Anoectochi lus roxburghii ;induct ion;callus
　　金线兰〔Anoectochi lus roxburghi i (Wall.)
Lindl.〕,兰科开唇兰属植物 ,全草入药 ,味甘 、性平 ,
具有清热凉血 、除湿解毒的功效 ,可治疗肺结核 、糖
尿病 、肾炎 、膀胱炎 、重症肌无力 、遗精 、风湿性及类
风湿性关节炎 、小儿惊风 、妇女白带以及毒蛇咬伤等
症 ,是民间珍稀名贵的中草药[ 1] 。除药用外 ,由于株
型矮小 ,叶型优美 ,叶面黑紫色 ,有金黄色带有绢丝
光泽的美丽网脉 ,还是观赏价值极高的室内观叶珍
品 ,具有广阔的开发利用前景 。
金线兰种子自然条件下萌发率很低 ,再加上过
度采集 ,野生资源日益枯竭[ 2] 。在人工培养条件下 ,
诱导愈伤组织生长并使其增殖是实现快繁和分离其
次生代谢产物获取金线兰药用成分的重要途径 ,但
目前罕见金线兰愈伤组织诱导的研究报道。笔者采
用正交试验研究了培养基和 4种植物生长物质对诱
导愈伤组织生长的影响 ,为金线兰愈伤组织诱导和
细胞培养积累资料。
1 材料与方法
1.1 无菌苗的获取
采自贵州省荔波县翁昂乡野生金线兰植株 ,由
贵州师范大学王承录副教授鉴定 ,人工授粉得到成
熟蒴果。种子无菌接种在培养基上萌发获得幼苗 ,
经增殖和壮苗培养 270d后选取壮苗备用 。
1.2 培养条件
选取大小一致 、生长均匀的壮苗为材料 ,分别将
其叶片 、地上茎和根状茎剪切成大小为 0.5 cm 的块
段接种在附加有不同生长物质的和不同梯度的 MS
培养基上 ,每个处理接种 8瓶 ,每瓶 5块 , 40 d后统
计产生愈伤组织的情况 。
以上培养基均加琼脂 8 g/L , 蔗糖 30g/L , pH
值均为 5.8 ,培养条件为光照 12 h/d ,光照度 1 000 ～
1500 lx ,培养室温度(22±2)℃。不同梯度的 MS 培养
基是指大量元素的梯度 ,其他因素不变。
1.3 正交试验设计
试验选取 MS 、6-BA 、2 ,4-D 、NAA 、KT 5因素 ,
浓度设 4水平(表 1)。试验选用 L16(45)表进行正
交设计 ,共有 16个试验处理组合 ,以愈伤组织的产
生率为指标 。在表 1试验的基础上应用表 2进一步
考察 4种生长物质对金线兰愈伤组织诱导的影响。
表 1 培养基正交试验设计因素水平
　Table 1　Level and facto rs of o r thogonal design about
culture medium mg/ L
水平
Level
A(培养基)
Medium
B
(6-BA)
C
(NAA)
D
(2 , 4-D)
E
(KT)
1 MS 0 0 0 0　
2 1/2MS 0.5 0.25 1 0.25
3 1/4MS 1.0 0.5 2 0.5
4 1/8MS 1.5 1.0 3 1.0
　贵州农业科学　2010 , 38(4):33 ～ 34　Guizhou Ag ricultural Science s
表 2 4 种生长物质正交试验设计因素水平
　　Table 2　Level and f ac to rs of or thogona l design about 4
plant g row th substance
水平 Level A(6-BA) B(NAA) C(2 , 4-D) D(KT)
1 0.5 0.25 1 0.25
2 1.0 0.5 2 0.5
3 1.5 1.0 3 1.0
2 结果与分析
2.1 培养基和植物生长物质对愈伤组织诱导的影响
试验结果(表 3)表明 ,在接种的材料中叶片和地
上茎没有被诱导成愈伤组织 ,只有根状茎产生了愈伤
组织。4种不同培养基中仅MS培养基上被诱导成愈
伤组织 ,而植物生长物质对金线兰愈伤组织产生的影
响还不能确定。为了更好地了解植物生长物质对金
线兰愈伤组织产生的影响 ,以根状茎为研究对象 ,MS
为培养基按表 2进行正交设计 ,共有 9个试验处理组
合 ,以愈伤组织的产生率为指标 ,结果见表 4。
2.2 4种植物生长物质对愈伤组织诱导的影响
对表 4的试验结果进行极差和方差分析 ,表明 ,
6-BA 对金线兰愈伤组织诱导效果显著 , 2 , 4-D 、
NAA 和 K T 效果不显著 ,4种植物生长物质作用强
弱依次为 6-BA>2 , 4-D>NAA>KT ,它们以最佳
浓度分别为 1.0mg/L , 3.0mg/L , 0.5mg/L , 和
0.25mg/ L ,故金线兰愈伤组织诱导的最佳培养基为
MS+2 , 4-D 3.0mg/ L +6-BA 1.0mg/L +NAA
0.5mg/ L+KT 0.25mg/L 。
表 3 培养基和植物生长物质对金线兰愈伤组织诱导的影响
Table 3　The effect o f culture medium and plant g r ow th substance on ca llus induction by or thagonal te st
处理
T reatment
因素(mg/L)Fac tor
培养基
Medium
6-BA NAA K T 2 ,4-D
叶片 Leaf
接种
个数
Leaf
t ransplanted
产生愈
伤的
个数
Callus
induced
愈伤产
生率/ %
Callus
induced
rate
地上茎 Aerial stem
接种
个数
Stem
transplanted
产生愈
伤的
个数
Ca llus
induced
愈伤产
生率/ %
Callus
induced
ra te
根状茎 Rhizome
接种
个数
Rhizome
t ransplanted
产生愈
伤的
个数
Callus
induced
愈伤产
生率/ %
Ca llus
induced
rate
1 MS 0 0 0 0 40 0 0 40 0 0 40 0 0
2 MS 0.5 0.25 0.25 1 40 0 0 40 0 0 40 2 0.05
3 MS 1.0 0.5 0.5 2 40 0 0 40 0 0 40 3 0.075
4 MS 1.5 1.0 1.0 3 40 0 0 40 0 0 40 0 0
5 1/ 2MS 0 0.5 1.0 1 40 0 0 40 0 0 40 1 0.025
6 1/ 2MS 0.5 1.0 0.5 0 40 0 0 40 0 0 40 0 0
7 1/ 2MS 1.0 0 0.25 3 40 0 0 40 0 0 40 0 0
8 1/ 2MS 1.5 0.25 0 2 40 0 0 40 0 0 40 0 0
9 1/ 4MS 0 1.0 0.25 2 40 0 0 40 0 0 40 0 0
10 1/ 4MS 0.5 0.5 0 3 40 0 0 40 0 0 40 0 0
11 1/ 4MS 1.0 0.25 1.0 0 40 0 0 40 0 0 40 0 0
12 1/ 4MS 1.5 0 0.5 1 40 0 0 40 0 0 40 0 0
13 1/ 8MS 0 0.25 0.5 3 40 0 0 40 0 0 40 0 0
14 1/ 8MS 0.5 0 1.0 2 40 0 0 40 0 0 40 0 0
15 1/ 8MS 1.0 1 0 1 40 0 0 40 0 0 40 0 0
16 1/ 8MS 1.5 0.5 0.25 0 40 0 0 40 0 0 40 0 0
表 4 植物生长物质对金线兰愈伤组织诱导的影响
Table 4　The effec t o f plant g row th substance on callus induction by or thagonal test
组合号
Combination
因素(mg/ L)Facto r
6-BA NAA 2 , 4-D KT
接种个数
Rhizome transplanted
长愈伤的个数
Callus induced
愈伤产生率/ %
Callus induce r ate
1 0.5 0.25 1.0 0.25 40 1 0.025
2 0.5 0.5 2.0 0.5 40 0 0
3 0.5 1.0 3.0 1.0 40 1 0.025
4 1.0 0.25 2.0 1.0 40 4 0.1
5 1.0 0.5 3.0 0.25 40 6 0.15
6 1.0 1.0 1.0 0.5 40 2 0.05
7 1.5 0.25 3.0 0.5 40 2 0.05
8 1.5 0.5 1.0 1.0 40 0 0
9 1.5 1.0 2.0 0.25 40 0 0
　注:以上试验选取根状茎为研究对象。
　No te:Rhizome w as transplanted in this table.
3 结论与讨论
愈伤组织的诱导是一个复杂的生理过程 ,受培
养基和植物生长物质共同的调控。本试验按正交试
验设计方法先进行了培养基 、6-BA 、NAA 、KT 、2 ,4-
D 5因素 4水平组合的 16个处理 ,考察愈伤组织诱
导情况 ,结果表明 ,基本培养基的影响作用最大。然
后应用正交试验设计 ,选取 6-BA 、NAA 、K T 、2 ,4-D
4因素 3水平组合的 9 个处理 ,考察愈伤组织诱导
情况发现 , 6-BA 对愈伤组织诱导产生效果显著 ,
2 , 4-D 、NAA 和 KT 效果不显著 。在铁皮石斛愈伤
组织诱导研究中发现添加 6-BA ,浓度以 1.0mg/L
时诱导愈伤组织效果最好[ 6] 。在波棱瓜叶片为外植
体愈伤组织诱导研究中发现 ,添加 1.0mg/L 6-BA 、
1.0mg/ L2 , 4-D和 2.0mg/L NAA的培养基愈伤组
织诱导时间短 ,生长快 ,质地致密颗粒状 ,有光泽 ,培
养 20 d后愈伤组织诱导率高达 93.3%[ 7] 。在大花
蕙兰茎尖为外植体愈伤组织诱导研究中发现 ,添加
·34· 　　　　　　　　　　　　 　　　　　贵 州 农 业 科 学 2010 , 38 卷
[ 文章编号] 1001-3601(2010)04-0208-0035-04
转基因牧草作为生物源农药的研究进展
王 啸1 , 2 , 邱树毅1 , 王嘉福3＊
(1.贵州大学 化学与化工学院 发酵工程与生物制药省重点实验室 , 贵州 贵阳 550003;2.贵州大学 精
化中心/绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室 , 贵州 贵阳 550025;3.贵州大学 动物科学学
院 农业生物工程省重点实验室 , 贵州 贵阳 550025)
　　[摘　要] 牧草在农牧业生产中占有十分重要的地位 ,将转基因生物源农药引入牧草的研究越来越多。从 3个方面综述了转基因牧草在农药学领域中的应用研究进展 ,第一 ,通过基因工程手段改良牧草品种 ,从
而提高牧草的抗病性 、抗虫害以及耐除草剂性能;第二 ,将有关药用蛋白的基因导入牧草中 ,得到转基因药用牧草 ,如免疫牧草 、治疗牧草 、诊断牧草等 ,在此基础上 ,更进一步研制出成熟的牧草反应器;第三 ,牧草品种
多 ,其基因资源十分丰富 ,从牧草中发掘优良基因资源 ,用于其他作物的转基因研究 ,也正在成为广大学者研
究的热点之一。[关键词] 牧草;转基因牧草;免疫牧草;治疗牧草;生物源农药[中图分类号] S188 [文献标识码] A
Research Progress on Transgenic Forage with Biogenic Pesticide
WANG Xiao1 , 2 , Q IU Shu-yi1 , WANG Jia-fu3＊
(1.Guizhou Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy , School of Chemistry and Chemical
Engineering , Guizhou University , Guiyang , Guizhou 550003;2.Center for Fine Chemicals/ Key Laboratory of
Green Pesticide and Agricultural Bioengineering o f Education Ministry , Guizhou Universit y , Guiyang , Guizhou
550025;3.GuizhouKey Laboratory of Agricultural Biotechnology , School of Animal Sciences , Guizhou University ,
Guiyang , Guizhou 550025 , China)
　　Abstract:Fo rage plays an impo rtant role in agricul tural and livesto ck product ion.Research about
t ransgenic forage varieties wi th biogenic pest icide has being paid mo re at tention to by researchers.The
paper review ed applicat ion research prog ress of transgenic forage in pe sticide sphere by int roducing that the
pest resistance and to lerance to w eed killer o f forage varieties could be improved by genetic engineering ,
t ransgenic medical forage variet ies such as immune forage , the rapeutic forage and diagno st ic forage could
be bred by int roducing medical pro tein gene into fo rage variet ies , and abundant gene resources in forage
varie ties could be used in transgenic engineering of othe r crops.
Key words:forage;t ransgenic forage;immune fo rage;therapeutic fo rag e;biogenic pesticide
　　牧草分布广泛 ,种类繁多 。全球草地面积是农
田面积的 2倍多 ,在美国 ,牧草是仅次于杂交玉米的
第二大农作物种植品种[ 1] 。据有关调查 ,我国野生
牧草有1 27科879属共421 5种 ,常见的牧草种类
　[收稿日期] 　2010-01-27;2010-04-06修回
　[基金项目] 　贵州省科技厅农业攻关项目“牧草基因资源发掘及种子分子鉴别关键技术研究与应用”[ 黔科合 N Y字(2009)3082]
　[作者简介] 　王　啸(1978-),男 ,讲师 ,在职博士 ,研究方向:牧草基因克隆 、生物农药。 E-mai l:w angzi8903@126.com
　＊通讯作者:王嘉福(1962-),男 ,教授 ,研究方向:动植物分子生物学和基因工程研究。 E-mai l:jfw ang@gzu.edu.cn
6-BA ,浓度以 1.0mg/L 时诱导愈伤组织效果最
好[ 8] 。在甘草子叶为外植体愈伤组织诱导研究中发
现 ,添加 1.0mg/L 6-BA和1.0mg/L 2 ,4-D的培养
基为最适培养基 ,其愈伤组织诱导率达 100%[ 9] 。
根据上述结果 ,初步选定金线兰愈伤组织诱导
的最适培养基为 MS +2 , 4-D 3.0mg/L +6-BA
1.0mg/L+NAA 0.5mg/L +K T 0.25mg/ L。
[ 参 考 文 献]
[ 1 ] 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志[ M] .北
京:科学出版社 , 2000:220.
[ 2 ] 陈 浴 ,林坤瑞 ,管其宽 ,等.金线莲生物学特性及生境
特点的研究[ J] .亚热带植物通讯 , 1994 , 23(11):18.
[ 3 ] 徐吉民.正交法在医药科研中的应用[ M] .北京:医药
科技出版社 , 1987:36.
[ 4] 陈自力.花叶开唇兰组织培养快速繁殖的研究[ J] .林
业勘察设计(福建), 2003(2):46-49.
[ 5] 黄慧莲 ,刘贤旺.金线莲种子诱导成苗的研究[ J] .中
药材 , 2002 , 25(1):3-5.
[ 6] 王 云 , 张二芹 ,高婉丽 , 等.铁皮石斛组织快繁研究
[ J] .河北农业科学 , 2008(5):31-34.
[ 7] 柳福智, 陈 垣, 王龙强 ,等.不同培养基对波棱瓜愈伤
组织诱导的影响[ J] .甘肃农业科技 , 2008(9):24-25.
[ 8] 张 瑜 , 付 艳 ,殷奎德.大花蕙兰的组织培养和次生
代谢物质的调控[ J] .农业生物技术科学 , 2006 , 22
(9):56-58.
[ 9] 胡海英 , 吴晓玲 ,梁新华.胀果甘草愈伤组织诱导培养
[ J] .药物生物技术 , 2004 , 11(3):170-172.
(特约编辑:王丽丽)
　贵州农业科学　2010 , 38(4):35 ～ 38　Guizhou Ag ricultural Science s