全 文 ：文章编号:0490-6756(2002)05-0943-05
对宽叶韭种内分化的随机扩增多态 DNA的分析
倪念春1 ,何兴金2 ,许介眉1
(1.四川大学生命科学学院 ,成都 610064;2.四川师范学院生物系 ,四川南充 637002)
摘要:应用随机扩增多态 DNA(RAPD)技术 , 对葱属粗根组的宽叶韭(Allium hookeri
Thwaites)的 11个居群进行了种内分化研究.结果显示 ,宽叶韭为一单系群 ,支持宽叶韭种的
成立.宽叶韭明显分为两大分支 ,这与宽叶韭的冬季倒苗和冬季不倒苗的两种生活习性完全一
致 ,与宽叶韭的倍性和生境(海拔)密切相关.
关键词:宽叶韭;种内分化;随机扩增多态 DNA标记
中图分类号:Q949　　　文献标识码:A
宽叶韭(Allium hookeri Thw aites)隶属于百合科葱属粗根组(Sect .Bromatorrhiza Ekberg).分布于四
川 、云南西北部和西藏东南部.生于海拔 1500 ～ 4000m 的湿润山坡或林下.斯里兰卡 、不丹和印度的北部也
有分布.四川 、云南 、贵州 、广西和广东等省栽培作蔬菜食用[ 1] .通过对栽培居群的观察发现 ,宽叶韭存在两
种类型:类型 I(冬季倒苗居群)和类型 II(冬季不倒苗居群).近来 ,对宽叶韭做了大量的染色体核型的研究
工作 ,发现宽叶韭存在种内分化现象[ 2 ～ 4] .黄酮化合物的薄层层析研究也显示宽叶韭可能出现了种内分化
现象[ 5] .另外 ,对宽叶韭进行的同工酶和可溶蛋白的研究也证实冬季不倒苗居群密切聚为一大类 ,而冬季倒
苗居群则聚为另一大类 ,且冬季不倒苗居群的分化水平是相当高的[ 6] .随着分子生物学技术的发展 ,近年来
的研究已经显示出 DNA分析技术 ,尤其是随机扩增多态 DNA(RAPD)[ 7]技术在基因组作图 、分类 、遗传变
异 、种间起源和生物多样性研究方面具有很多优势.Susan E.Wilkie 在其文章中证实 , RAPD标记可以成功
地用于研究葱属物种间的系统发育关系[ 8] .我们研究的目的在于利用 RAPD资料的分析来获得宽叶韭种内
分化的依据.
1　材料和方法
1.1　材料
每个居群严格按照居群标准取样 ,即每个供试样品均取自同一居群的 30 个以上个体.变种木里韭(A.
hookeri var.muliense)、近缘种峨眉韭(A .omeiense)和外类群多星韭(A .wallichii)也用于我们的研究中(材
料见表 1).
1.2　方法
1.2.1　DNA提取　将野外采集的鲜叶组织用硅胶干燥后常温保存备用[ 9] .总 DNA 的提取采用改良的
CTAB法[ 10] .
1.2.2　DNA扩增　在 25 μL 的终反应混合物中 ,含有 10 ng 模板 DNA , 1.5 mmol/L M gCl2 , 2.5 mmol/L
dNTP ,1单位 Taq酶 , 1.5 μmol/ L 引物(引物序列见表 2)和 1×反应缓冲液(上海生工).反应混合物上覆盖
20μL 的矿物油后 ,在 PTC-100TM PCR仪上进行扩增反应.反应参数:94℃预变性 3 min;94℃1 min;45℃2
min;72℃2.5 min ,28个循环;最后 72℃延伸 4 min ,缓慢冷却至室温.取 5μL 扩增产物进行 1.8%琼脂糖凝
收稿日期:2002-03-22
基金项目:国家博士点基金资助项目基金
作者简介:倪念春(1976-), 男 , 1999 级硕士研究生.
2002年 10月
第 39卷第 5期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)
Oct.2002
Vol.39　No.5
胶电泳(含EB), 1×TBE作电泳缓冲液 ,DL2000 DNA M arker(Takara biotech)作为分子量标记.电泳结束后
将凝胶置于紫外透射分析仪上观察并拍摄.
表 1　材料来源
No. 物种 产地 海拔(m) 倍性 类型 凭证标本
103
002
003
004
005
006
011
012
013
014
015
宽叶韭
清音阁 ,峨眉山 , 四川 700 2× I I＊ Xu92-09
弥勒 , 云南 1600 2× I＊＊ Yu96-16
大理 , 云南 1950 2× I Yu96-18
澜沧 , 云南 1500 2× II Yu96-11
龙胜 , 广西 1500 3× II Zhu93005
屏山 , 四川 1100 3× II Zhu1518
西双版纳 , 云南 1000 2× II Yu93-34
中甸 , 云南 3200 2× I Yu96-17
脚盆坝 ,峨眉山 , 四川 1300 2× I Xu91-006
乳源 , 广东 1500 3× II Zhu93004
大飞水 , 大邑 ,四川 1200 2× II Xue93-12
木里韭 中甸 , 云南 3000 2× Xu93-25
675 峨眉韭 峨眉山 ,四川 1000 2× Xu91-01
007 多星韭 昆明 , 云南 2400 2× Xu93-21
　　　　　　　＊冬季不倒苗居群;＊＊冬季倒苗居群
1.2.3　数据分析　只记录重复的带 ,将任一扩增带看作一个性状 ,按带的有无列出二元数据矩阵.遗传距离
矩阵计算采用①RAPDistance 1.04 软件包 ,运算系数为 Jaccard , Sokal &Sneath (2 , 3), Sneath &Sokal ,
Rogers和 Tanimo to , Hamman , Excof fier 和Apostol等;②MEGA 2.0软件 ,运算系数为No.of Differences(表
3为遗传距离矩阵的一个示例).遗传距离矩阵再进入 RAPDistance 1.04软件包 、MEGA 2.0和 PAUP 4.0β8
软件包中进行运算分析.聚类树由 UPGMA程序和 NJ程序运算产生 ,并在 MEGA 2.0中进行靴带分析以确
定其支持率.
表 2　随机引物产生的多态性带
Primers Sequences Total bands Polymorphic bands
S21 5 -CAGGCCCTTC-3 12 7
S22 5 -TGCCGAGCTG-3 18 10
S24 5 -AATCGGGCTG-3 11 7
S75 5 -GACGGATCAG-3 8 5
S105 5 -AGTCGTCCCC-3 23 17
S516 5-CTCTGCGCGT-3 12 10
S2060 5 -AGCACTGGGG-3 21 16
2　结果
共采用Operon公司生产的 7个 10 mer随机引物进行 RAPD分析.获得稳定扩增带 105条 ,每个引物扩
增的带数在 8条(引物S75)到 23条(引物 S105)之间 ,平均每个引物的扩增带数为 15条 ,引物 S516的 PCR
扩增结果见图 1.在 105条扩增带中 , 72条具有多态性 ,占 68.57%.而且 ,所有的 UPGMA树和 NJ树 ,无论
其来自 RAPDistance 1.04软件包 、MEGA 1.02程序 ,还是 PAUP 4.0β8软件包的分析结果 ,均极为类似 ,显
944 四川大学学报(自然科学版) 第 39卷
示宽叶韭为一单系群 ,且宽叶韭明显分为两大分支.图 2为聚类树的一个示例 ,表 3为供试材料的遗传距离
矩阵.
图 1　引物 S516 的扩增反应电泳结果
图 2　据 Jaccard 系数得出的供试材料的亲缘关系聚类图
3　讨论
在研究中 ,用 RAPD技术分析宽叶韭的种内分化问题 ,其遗传距离矩阵和聚类树由 7个随机引物产生.
结果显示:(1)宽叶韭是一个单系群 ,靴带支持率为 73 ,确证了宽叶韭种的成立;(2)宽叶韭明显分为两大类
群.参照前人的研究 ,例如核型研究[ 2 ～ 4] ,黄酮类化合物薄层层析研究[ 5] 以及同工酶和可溶性蛋白研究[ 6] ,
我们确信宽叶韭中确实出现了明显的种内分化.通过对电泳结果的观察 ,我们发现宽叶韭不同居群的扩增带
型及带数差异较大 ,排除 DNA 不纯和不同个体 DNA 浓度差别等实验技术误差后 ,我们认为这是由于宽叶
韭的有性生殖退化 ,仅以无性生殖进行繁殖 ,一个居群实为一个无性系 ,个体间遗传特性一致 ,居群间则出现
了较大的差异 ,即无性生殖加速了宽叶韭的种内分化.还有 ,现有的宽叶韭各居群均属于栽培类型 ,在栽培进
程中 ,由于不同地区的土壤 、气候等外界条件的差异 ,也加速了宽叶韭的种内分化.
945第 5期 倪念春等:对宽叶韭种内分化的随机扩增多态 DNA的分析
通过对栽培居群的观察 ,我们发现宽叶韭具有两种生活型 ,即冬季不倒苗居群(类型 I I)和冬季倒苗居群
(类型 I).类型 II包括所有的三倍体居群(屏山居群 、乳源居群和龙胜居群)和部分二倍体居群(清音阁居群 、
澜沧居群 、大飞水居群和西双版纳居群).类型 I包括部分二倍体居群 ,如弥勒居群 、大理居群 、中甸居群和脚
盆坝居群.这与宽叶韭各居群的形态特征可相互印证.形态上 ,冬季倒苗的各个居群都表现出叶片柔弱 、窄而
短小 、叶片表面几乎不具光泽;冬季不倒苗类型则植株表现高大 、叶宽 、质地较硬 、叶表面具有一定光泽.通过
研究 ,从聚类树中可以看出类型 I和类型 II分成了两大分支 ,类型 I 和类型 II 在其分支内部不管相对位置
如何变化 ,但始终都彼此紧密聚合 ,形成一个分支 ,然后才与另一类型所形成的分支聚合而成宽叶韭的大分
支.因此 ,我们认为通过 RAPD数据的分析可以确定其生活型的分化.
表 3　据 Jaccard系数算出的供试材料的遗传距离矩阵
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 002 - 0.11 0.22 0.26 0.22 0.51 0.21 0.23 0.18 0.23 0.19 0.30 0.34 0.40
2 003 12 - 0.26 0.22 0.26 0.48 0.23 0.19 0.24 0.25 0.21 0.28 0.29 0.36
3 004 23 27 - 0.13 0.21 0.54 0.24 0.35 0.32 0.22 0.14 0.23 0.39 0.41
4 005 27 23 14 - 0.23 0.54 0.22 0.33 0.38 0.18 0.16 0.19 0.39 0.37
5 006 23 27 22 24 - 0.54 0.24 0.31 0.32 0.20 0.16 0.21 0.37 0.43
6 007 54 50 57 57 57 - 0.51 0.46 0.47 0.51 0.50 0.54 0.48 0.57
7 011 22 24 25 23 25 54 - 0.30 0.30 0.25 0.25 0.26 0.34 0.38
8 012 24 20 37 35 33 48 32 - 0.22 0.32 0.30 0.31 0.34 0.42
9 013 19 25 34 40 34 49 31 23 - 0.33 0.31 0.42 0.39 0.41
10 014 24 26 23 19 21 54 26 34 35 - 0.11 0.16 0.34 0.38
11 015 20 22 15 17 17 52 26 32 33 12 - 0.18 0.34 0.36
12 103 31 29 24 20 22 57 27 33 44 17 19 - 0.30 0.35
13 671 36 30 41 41 39 50 36 36 41 36 36 31 - 0.42
14 675 42 38 43 39 45 60 40 44 43 40 38 37 44 -
　　在我们研究中 ,所有的三倍体居群(屏山居群 、乳源居群和龙胜居群)都位于类型 II分支内部 ,显示出宽
叶韭的倍性变异可以通过 RAPD数据分析检出.从物种进化来看 ,三倍体来源于二倍体.在适应性能上 ,三
倍体植株生长势和分生能力明显大于二倍体植株.由于我们所研究的所有三倍体居群都属于冬季不倒苗类
型 ,又加之绝大部分葱属植物具冬季休眠习性 ,所以我们认为冬季不倒苗习性是后期出现的.且 RAPD 扩增
反应所得的电泳图谱也显示冬季不倒苗类型的遗传基因要复杂些 ,因此宽叶韭中冬季不倒苗类型是分化程
度较高的类型.RAPD分析结果与可溶性蛋白组分的双向电泳结果完全吻合[ 6] .
在我们的研究中 ,所有的类型 I居群(除了脚盆坝居群)均位于高海拔地区(从 1600m 到 3200m),他们
均在冬季枯萎倒苗.另一方面 ,所有的类型 II 居群均位于低海拔地区(从 700m 到 1500m).我们认为类型 II
的生活性状冬季不倒苗出现晚于类型 I.因为:(1)在我们研究中 ,所有的三倍体居群均属于类型 II 分支;(2)
绝大多数葱属植物具冬眠习性.我们都知道基因加倍(多倍化)的出现会增强多倍体植株的适应能力 ,使其在
特殊生境下存活.而同时葱属的绝大部分植株均冬眠.结合这两方面的因素 ,我们认为冬季不倒苗的生活习
性的出现晚于冬季倒苗的生活习性;且多倍化可能是宽叶韭进化趋势的主流 ,而无性生殖则加速了宽叶韭的
种内分化.
在所有的聚类分析结果中 ,木里韭总是首先与宽叶韭聚在一起 ,然后再与峨眉韭和多星韭聚合 ,仅
UPGMA分析中稍有不同(这是因为 UPGMA方法的原因);与此同时 ,木里韭并不进入宽叶韭分支内部 ,这
显示 RAPD资料支持木里韭与宽叶韭具有较近的亲缘关系 ,木里韭作为宽叶韭的变种处理是合理的.
近来 ,大量的分析软件被用于 DNA数据分析 ,但每一种软件均有其独特的理论基础和应用领域.因此 ,
我们必须谨慎选择用于研究的分析软件.目前对 RAPD的数据分析 ,比较常用的是 UPGMA(无权重配对算
术平均数法),其基本原理是运用 Jaccard相似系数.与其类似的是 NTSYS(数量分类系统),还有使用 SAS
统计分析软件包中 Cluster程序等方法.在检测不同个体和居群之间的遗传变异时 , RAPD 标记可看作是有
用的孟德尔特征.RAPD标记具有显/隐性 ,所以对于自交的种类 RAPD谱中某多态位点一般是纯合的 ,扩增
946 四川大学学报(自然科学版) 第 39卷
产物的频率可以作为等位基因的频率;对于异交的种类 , RAPD谱中某一多态位点可能是杂合的 ,扩增产物
存在的频率只能作为 RAPD表型频率来定义.对于已知的等位基因频率 ,可用 Nei指数来计算群体的基因多
样性.
参考文献:
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Random Amplified Polymorphic DNA Analysis on Intraspecific
Differentiation of Allium Hookeri
NI Nian-chun1 , HE X ing-j in2 , XU J ie-mei 1
(1.College of Life Science ,Sichuan University ,Chengdu 610064 ,China;
2.Department of Biology ,Sichuan Teachers College ,Sichuan Nanchong 637002 ,China)
Abstract:The random amplified polymorphic DNA (RAPD)phenotypes generated by 7 primers w ere sco red in
11 populations of Allium hookeri .A series of computing indexes were applied to obtain genetic distance matrixes.
N J tree and UPGMA tree were produced by RAPD istance package 1.04 , MEGA 2.0 and PAUP 4.0β8 soft-
ware package.All the t rees w ere same to each other.The results show ed that A .hookeri was a monophyletic
g roup which supported the existence of species of A .hookeri and all the populations of A .hookeri were divided
into tw o g roups which w ere identical w ith the habitus of wi thering in the winter and not w ithering in the winter
and highly related to ploidy and habi tat(altitude).The results are basically comparable with those obtained from
studies on morphology , cy tology , biochemistry and phy tochemist ry.A significant intraspecific differentiat ion a-
mong the populations of A .hookeri was confirmed by the use of RAPD analy sis.Dif ferent iation level of not w ith-
ering in the w inter populations is higher than that of w ithering in the w inter ones.
Key words:Allium hookeri ;int raspecif ic dif ferent iation;RAPD markers
947第 5期 倪念春等:对宽叶韭种内分化的随机扩增多态 DNA的分析