全 文 ：天 津 中 医 药
Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine
2013年 4月第 30卷第 4期
Apr． 2013,Vol．30 No．4
蕨麻对低压缺氧大鼠脑组织
脑 红 蛋 白 表 达 的 影 响 *
张 盈 1，李灵芝 2,3，杨 虎 2，龚海英 2，张永亮 2,3
（1．天津医科大学药学院，天津 300070；2．武警后勤学院，天津 300162；
3．天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室，天津 300162）
·实验研究·
摘要：[目的]建立大鼠高原低压缺氧模型，研究大鼠脑组织中脑红蛋白（Ngb）表达及蕨麻乙醇提取物干预的影
响。[方法]将 50只健康成年雄性 SD大鼠随机分为 5组：正常对照组、低压缺氧模型组、蕨麻乙醇提取物 0.9、1.8和
3.6 g/kg组，每组 10只。分别按 0.9、1.8和 3.6 g/kg剂量将蕨麻乙醇提取物溶于 1 mL 0.3%羧甲基纤维素钠溶液。每天
于固定时间（8∶00）灌胃给药 1次，正常对照组、低压缺氧模型组同时给予等体积 0.3%羧甲基纤维素钠。连续灌胃
14 d。各组大鼠在最后 1次灌胃后 1 h置于低压缺氧舱在海拔 7 000 m低压缺氧 12 h。缺氧结束后，用免疫组织化学
方法检测 Ngb在脑组织中的表达定位，用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR法）检测皮质 Ngb mRNA水平，用West－
ern blot方法检测皮质 Ngb表达量。[结果]低压缺氧模型组大鼠皮质 Ngb蛋白免疫反应阳性细胞数增加，胞浆、胞核
均可见棕黄色颗粒状免疫反应阳性产物，海马各区未见 Ngb表达；脑皮质表达 Ngb mRNA及蛋白水平较对照组明显
升高（P＜0．01）；与模型组相比，蕨麻乙醇提取物 3.6 g/kg组大鼠脑皮质中 Ngb mRNA及蛋白水平明显升高（P＜0．01）。
[结论]低压缺氧可刺激脑组织表达 Ngb，蕨麻乙醇提取物在低压缺氧时可通过促进 Ngb的表达，发挥脑保护作用。
关键词：低压缺氧；蕨麻；脑红蛋白
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1519（2013）04-0224-04
*基金项目：国家自然科学基金资助项目（81073152），天津市
自然科学基金重点项目（10JCZDJC21100），中国博士后基金
资助项目（20100470106）。
作者简介：张 盈（1987－），女，硕士研究生，主要从事高原缺
氧及抗缺氧药物研究。
通讯作者：李灵芝，E-mail：llzhx@yahoo.cn；张永亮，E-mail：
zhang78127@tom.com。
低氧时机体会产生一系列独特的应激蛋白以
适应低氧造成的不利状况。脑红蛋白（Ngb）是一种缺
氧条件下神经元应激表达的一种携氧球蛋白，同血
红蛋白、肌红蛋白一样具有储存、运输氧的功能 [1]，
应激状态下具有清除氧自由基等作用 [2]，可以减轻
缺氧性脑损伤程度。研究证实蕨麻具有显著的抗缺
氧[3-4]、抗氧化[3-5]，清除自由基[6]，笔者的前期研究发
现蕨麻对神经细胞损伤具有保护作用 [7]，且能够减
轻低压缺氧大鼠脑水肿 [8]，本实验进一步观察了大
鼠在模拟海拔 7 000 m高原缺氧环境中 Ngb表达的
变化及蕨麻乙醇提取物干预的影响，初步探讨蕨麻
的脑保护作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药材与试剂 蕨麻乙醇提取物（由本实验室
提取，每克相当于生药 2 g）；0.3%羧甲基纤维素钠
（CMC-Na，科锐思公司）。羊抗 Ngb多克隆抗体（santa
cruz Inc）；兔抗 Caspase-3多克隆抗体（武汉博士德
公司）；正常兔（山羊）血清，SP-9003（SP-9001）免疫
组化染色试剂盒，浓缩型 DAB试剂盒（购自北京中
杉生物工程公司）。TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.
3.0试剂盒，DL-2000 Markers（宝生物工程有限公
司）；Trizol Reagent（晶美公司）。
1.1.2 主要仪器 PT-0200PCR仪（美国MJResearch
公司）；超速低温离心机（德国 Eppendorf 公司）；
E - 510 型多功能显微镜 Olympus 照相机（日本
Olympus公司）；RM2135型组织切片机（德国 Leica
公司）；M-20紫外线投射仪（UVP基因有限公司）；。
1.1.3 动物与分组 雄性 Sprage -Dawley 大鼠
50 只，体质量（300±25）g，军事医学科学院动物
实验中心提供，许可证号：SCXK-（军）2002-001。随
机分为正常对照组（C）、模型组（M）、低压缺氧＋蕨
麻乙醇提取物高（H）、中（I）、低（L）剂量组（3.6、1.8、
0.9 g/kg），每组 10只。
1.2 方法
1.2.1 给药方法 用 0.3% CMC-Na配制蕨麻乙醇
提物溶液，H 组、I 组、L 组分别按 3.6、1.8、0.9 g/kg
DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2013.04.14
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的剂量给予蕨麻乙醇提取物溶液，给药体积均为 1mL，
常氧对照组和缺氧模型组给予等体积的 0.3%
CMC-Na溶液，连续灌胃给药 14 d。
1.2.2 高原低压缺氧模型建立 参照文献[8]。除正
常对照组外，各组大鼠在最后 1次灌胃后 1 h置于
低压缺氧舱在海拔 7 000 m低压缺氧 12 h，实验过
程中维持氧含量 8%~10%，温度（25±3）℃，湿度65%，
控制气流流量 0.09~0.1 m3/h。大鼠出舱，处死，取脑
组织待测。
1.2.3 RT-PCR 检测脑组织中 Ngb mRNA 表达水
平 引物设计：根据 Genbank中大鼠 Ngb基因序列
设计引物，由 Invitrogen公司合成。
Ngb 上游：5 -CTC TGG AAC ATG GCA CTG
TC-3，下游：5-GCA CTG GCT CGT CTC TTA CT-
3，扩增产物长度为 413 bp。
RT-PCR反应：大鼠脑组织用 Trizol试剂提取
脑组织总 RNA，取 1 μL 总 RNA，按逆转录试剂盒
说明合成 cDNA第一条链，取 5 μL逆转录产物进行
PCR，反应条件如下：94 ℃预变性 1 min，95 ℃
1 min、57 ℃ 45秒、72 ℃ 1 min循环 28次，72 ℃延伸
10 min。
PCR反应产物检测：用凝胶成像分析系统测出
各扩增条带的光密度值（A），以同一样品 Ngb扩增
带的光密度（Af）与 β-actin扩增带的光密度（Ab）比
值进行统计分析，得到其 RT-PCR产物的相对含量。
1.2.4 免疫组织化学方法检测脑组织中 Ngb 蛋白
表达 脑组织石蜡切片脱蜡至水，高压抗原热修复
20 min。3%H2O2室温孵育 10 min以消除内源性过
氧化物酶的活性。滴加正常兔（山羊）血清，室温孵
育 10 min。滴加一抗工作液（按 1∶200稀释），4 ℃过
夜。滴加生物素化二抗，37 ℃孵育 1 h。滴加 SP复合
物，37 ℃孵育 30 min。DAB显色，脱水、透明、封片。
1.2.5 Wstern blot方法检测脑组织中 Ngb蛋白含量
取脑组织匀浆提取蛋白，采用 Bradford法对样本
进行蛋白质定量后进行 SDS2PAGE 凝胶电泳并转
移蛋白至 PVDF膜，加一抗 4 ℃孵育过夜，加入生物
素化二抗 37 ℃孵育 1 h。滴加 SP复合物，室温 1 h。
DAB显色。测出各条带的光密度值，以同一样品
Ngb条带的光密度与 β-actin的光密度比值进行统
计分析，得到其蛋白含量的相对值。
1.2.6 统计学处理 采用 SPSS 18.0 软件分析，计
量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用
单因素方差分析，以 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-PCR检测结果 与正常对照组相比，低压
缺氧模型组大鼠脑组织内 Ngb mRNA 表达增加显
著（P＜0．01）；尼莫地平组 Ngb mRNA表达与低压缺
氧模型组差异无统计学意义，3.6 g/kg蕨麻提取物组
大鼠脑皮质的 Ngb mRNA 表达较低压缺氧模型组
显著增加（P＜0．01）；蕨麻提取物中、低剂量组与低压
缺氧模型组差异无统计学意义，见图 1，表 1。
2.2 免疫组织化学检测结果 Ngb为主要在胞浆
表达的蛋白。常氧对照组皮质有少量 Ngb表达，阳
性反应产物呈浅棕色颗粒。海马各区未见 Ngb表
达。低压缺氧模型组大鼠皮质 Ngb蛋白免疫反应阳
性细胞数增加，胞浆、胞核均可见棕黄色颗粒状免
疫反应阳性产物，海马各区未见 Ngb表达。与低压
缺氧模型组比，3.6 g/kg 蕨麻提取物组 Ngb 蛋白免
疫反应阳性细胞明显增加，免疫反应阳性反应产物
为棕色颗粒。海马 CA1、CA2区有少量棕黄色颗粒。
见图 2。
2.3 Western blot 检测结果 与正常对照组相比，
低压缺氧模型组 Ngb表达明显上调（P<0.01），与低
压缺氧模型组相比，3.6 g/kg 蕨麻提取物组 Ngb 蛋
C：正常对照组；M:低压缺氧模型组；L、I、H依次为蕨麻提取物 0.9、
1.8、3.6 g/kg组
图 1 各组大鼠脑组织 Ngb mRNA表达水平
Fig.1 Expression of Ngb mRNA in rat brain tissue of each
group
Marker C M L I H
Ngb
β-actin
表 1 各组大鼠脑组织 Ngb mRNA及 Ngb蛋白表达水平
Tab.1 Expression of Ngb mRNA and Ngb protein in rat
brain tissue of each group
组别 Ngb mRNA水平 Ngb 蛋白表达水平
C 0.31±0.01 0.11±0.03
M 0.48±0.02 2.01±0.13
L 0.30±0.06 1.94±0.12
I 0.41±0.06 2.09±0.06
H 0.60±0.12 2.61±0.12
注：C：正常对照组；M:低压缺氧模型组；L、I、H依次为蕨麻提取
物 0.9、1.8、3.6 g/kg。
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白表达显著增高（P<0.01），蕨麻提取物中、低剂量组
Ngb蛋白表达无明显改变。见图 3。
3 讨论
Ngb作为一种携氧球蛋白，能够在大脑急性缺
氧状态下应激性释放自身所携带的氧，以减轻脑组
织因缺氧而引起的损害。Ngb能够可逆地结合氧，其
与氧的结合能力近似于肌红蛋白，但高于血红蛋白[1]，
Ngb在氧分压高的时候可结合氧气，在氧分压低的
时候则可释放氧气，故 Ngb能够在血氧浓度较低
时，转运氧通过血脑屏障，提高脑组织对氧的利用
率，维持细胞内的氧分压。Ngb可促进氧向线粒体扩
散或直接介导氧向线粒体传递，促进三磷酸腺苷
（ATP）的产生，维持神经元的正常功能。关于低氧是
否能诱导 Ngb表达发生改变，目前尚未达到共识。
Hundahl 等 [9]和 Mammen 等 [10]研究发现短期低氧和
长期慢性低氧环境对 Ngb在脑中及视网膜中的表
达并无影响，提示单纯低氧因素对不影响活体内 Ngb
的表达。但李江等[11]在急性重复低氧小鼠脑皮质观
察到低氧组小鼠皮质神经元的 Ngb表达较对照组
显著升高，而低氧预适应组小鼠皮质神经元的 Ngb
表达又高于低氧组。笔者的研究证实在海拔 7 000 m
缺氧 12 h后，大鼠皮质 Ngb mRNA和 Ngb蛋白水平
均明显增高[8]，表明单纯低氧因素可以引起脑组织
神经元 Ngb表达的变化。
Moens 等 [12]研究发现，不同脑区中 Ngb mRNA
阳性细胞的密度不同，大脑皮质阳性细胞的密度明
显高于海马、小脑和丘脑，这与不同脑区对缺氧损
伤的敏感性不同相一致。Melton等[13]研究发现脑遭
受缺血缺氧损伤时，其相应区域神经元 Ngb表达量
明显上调，且在脑内不同区域的表达程度与该区域
对缺血缺氧的敏感程度呈负相关，即神经元 Ngb含
量越高其对缺氧的耐受力越好，反之则差。如在缺
氧状态下皮质中表达量为海马的 4倍。本研究免疫
组化研究结果也显示：常氧对照组脑组织海马区未
见 Ngb表达，在皮质有低表达，模型组经低压缺氧
暴露后海马神经元并没有像皮质一样有大量 Ngb
应激性的表达，因此在组织形态学上也表现为海马
损伤较皮质严重。这与 Moens等的研究结论相符。
Wang等[14]研究表明缺血缺氧可诱导脑组织表
达 Ngb，从而减轻脑损伤，Ngb过表达的转基因鼠可
耐受脑梗死，而 Ngb基因敲除则可加重脑损伤。提
示 Ngb参与了脑缺氧后神经元的适应性保护过程。
因此当组织缺氧时若能设法促使 Ngb水平提高，则
将有助于减轻组织缺氧损伤。
本研究结果显示，大鼠预先以蕨麻 3.6 g/kg进
行干预后再行缺氧，脑组织 Ngb mRNA及蛋白表达
水平均较缺氧模型组上调，免疫组织化学染色证实
皮质 Ngb蛋白表达水平上调尤其显著，与前期研究
发现的脑组织切片中观察到的损伤程度相一致 [8]。
提示蕨麻乙醇提取物可能通过促进 Ngb表达，增强
神经元对缺氧的耐受能力，减轻神经元损伤，对神
经元起到保护作用。
采用过表达 Ngb的 PC12细胞研究发现，高水
平的 Ngb可以明显减少过氧化氢（H2O2）诱导的活
性氧簇累积及脂质过氧化产物的生成[15]。Fordel等[16]
采用 H2O2建立视网膜缺氧/复氧损伤模型，研究结
果发现 Ngb蛋白的水平与 H2O2的水平呈负相关，
提示 Ngb能够对抗 H2O2的氧化损伤。在既往的研
究中发现，蕨麻乙醇提取物具有明显的抗氧化作
用，能够减轻体外培养神经元缺氧损伤 [7]及低压缺
氧小鼠脑组织损伤[17]，提示蕨麻在缺氧时可能上调
脑组织 Ngb表达增加缺氧组织的氧供或降低神经
元的氧耗，以维持其生理功能，使脑组织对缺氧产
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Expression of neuroglobin in brain of rats exposed to hypobaric hypoxia and effects of Potentilla anserina L.
ZHANG Ying1，LI Ling-zhi2，3，YANG Hu2，GONG Hai-ying2，ZHANG Yong-liang2，3
（1．Pharmacy College of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2. Logistics College of Armed Police, Tianjin 300162,
China；3 Tianjin Key Laboratory of Occupational and Environmental Hazards Biomarkers, Tianjin 300162, China）
Abstract: [Objective] To establish the model of rat exposed to hypobaric hypoxia, and detect the expressions of neuroglobin (Ngb) in
brain and study the effect of Potentilla anserina L. on it. [Methods] Fifty adult healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided
into five groups with ten rats per group: control group, hypobaric hypoxia model group, hypobaric hypoxia+ Potentilla anserina L. alcohol
extract(3.6, 1.8, 0.9 g/kg). The Potentilla anserina L. alcohol extract were dissolved in 1 mL 0.3% sodium caboxylmethylcellulose solution
according to the dosage of Potentilla anserina L. alcohol extract (3.6, 1.8, 0.9 g/kg), and then was given orally to the rats at the fixed time
(8∶00) once every day, for 14 successive days. At the same time, 1 mL 0.3% sodium carboxymethylcellulose solution was given orally to
the rats in control group and hypobaric hypoxia model group. All of the rats without the control group were underwent hypobaric hypoxia
under 0.06 kPa（7 000 m）in decompression chamber for 12 hours. After the hypobaric hypoxia was finished, the position of neuroglobin in
brain of rats was observed by immunohistochemistry staining. The levels of neuroglobin mRNA and its protein were detected respectively
by methods of RT-PCR and Western blot. [Results] The number of positive cells in immune response to Ngb protein increased in the
cortex in hypobaric hypoxia model group compared with control group. The positive substances of immune response appeared as brown
yellow particles were observed in the cytoplasm and nuclei of the neurons of cortex in rats in hypobaric hypoxia model group while the
expression of Ngb protein was not observed in the hippocampus. The levels of mRNA and protein of Ngb in the cortex of rats in hypobaric
hypoxia model group increased compared with control group. The levels of mRNA and protein of Ngb significantly increased in the cortex
of rats in 3.6 g/kg Potentilla anserina L. alcohol extract group compared with hypobaric hypoxia model group. [Conclusion] Hypobaric
hypoxia can stimulate brain to express neuroglobin. The Potentilla anserina L. alcohol extract can promote the expression of neuroglobin
and then protect the brain from hypobaric hypoxia injury.
Key words: hypobaric hypoxia; potentilla anserine L.; neuroglobin
生耐受与适应；同时帮助清除脑组织由于急性缺氧
产生的活性氧，减轻脑组织损伤。
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（收稿日期：2012-12-26）
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