全 文 ：第23卷第11期
2014年11月
武警后勤学院学报（医学版）
Journal of Logistics University of PAPF（Medical Sc ences）
vol.23 No.11
Nov.2014
蕨麻对急性低压缺氧大鼠脑组织保护作用及Caspase3表达
的影响
杨 虎1，张永亮2,3，龚海英2，李灵芝2,3，高宏生2,3（1.武警河北总队医院病理科，河北 石家庄 050081；2.武警
后勤学院，天津 300309；3.天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津 300309）
摘 要：【目的】研究蕨麻对模拟高原低压缺氧环境下大鼠脑组织保护作用及caspase3表达的影响。【方法】78只健康成年雄性
SD 大鼠随机分为常氧对照组、低压缺氧组、蕨麻乙醇提取物高［3.6g·（kg·d）-1］、中［1.8g·（kg·d）-1］、低［0.9g·（kg·d）-1］剂量组
和尼莫地平［0.02g·（kg·d）-1］组，每组13只。除常氧对照组外，其余各组大鼠均在减压舱内模拟海拔7000m缺氧12h。测定
脑含水量变化，HE 染色观察大鼠脑皮质病理改变，透射电镜观察脑皮质神经元超微结构变化，RT-PCR 检测caspase3mRNA
表达，免疫组织化学和Western blotting方法检测caspase3蛋白水平。【结果】与低压缺氧组比，蕨麻乙醇提取物［3.6g·（kg·d）-1］
组大鼠脑皮质形态结构接近常氧对照组，超微结构损伤显著减轻；脑组织的含水量显著降低；脑皮质caspase3mRNA 及其蛋白
的表达明显下调（P < 0.01）。【结论】蕨麻乙醇提取物能够减轻低压缺氧导致的脑水肿，保护脑组织，此作用可能与其下调脑组
织caspase3表达有关。
关键词：低压缺氧；蕨麻；脑水肿；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
【文章编号】2095-3720(2014)11-0893-05 【中图分类号】R965 【文献标志码】A
Brain protective effect ofPotentilaanserinaL and its regulating on the expression of
caspase3inratsexposedtoacutehypobarichypoxia
YANG Hu, ZHANG Yong-liang, GONG Hai-ying, LI Ling-zhi, GAO Hong-sheng(Department of Pathology Heibei
Provincial Corps Hospitalof PAPF, Shijiazhuang050081, China)
Abstract:【Objective】To study the brain protective effect ofPotentilaanserinaL and its regulating on expression of caspase3in rats
exposed to acute hypobaric hypoxia.【Meth ds】78Male SDrats were randomly divided into control group, acute hypobaric hypoxia
group, intervention groups ofPoteilaanserinaL. alcohol extract [3.6g·(kg·d)-1,1.8g·(kg·d)-1,0.9g·(kg·d)-1] and Nimodipine group
[0.02g·(kg·d)-1], and each group with13rats. Each group with13 ats. Pathological and ultrastructural changes in the cerebral cortex
were observed respectively by HE staining and transmission electron microscope，the brain water content was determined. RT-PCR,
Western blotting and immunohistochemistry assays were used for detecting the caspase3mRNA nd prot in.【Result】Compared with
control group，the morphological strcture were improved and the ultrostructure injury were reduced in cortex of rats treated with3.6g·
(kg·d)-1PotentilaanserinaL. alcohol extract. The brain water content reduced significantly. The levels of caspase3mRNA and protein
were down- regulated obviously.【Conclusion】PotentilaanerinaL. alcohol extract could attenuate cerebral edema caused by
hypobaric hypoxia and protect brain from injury. This activity may be related with its effect of down-regulating the expression of
casepase3.
Key words:Hypobaric hypoxia;PotentilaansernL; Cerebral edema; Caspase3
蕨麻具有抗缺氧、抗氧化、提高机体免疫力及
抗疲劳作用［1-3］，我们在前期研究中发现蕨麻对于急
[基金项目]国家自然科学基金项目（81471823）；天津市重点项目
（12JCZDJC 34700）；中国博士后基金项目（20100470106）
[收稿日期]2014-08-16;[修回日期]2014-10-02
[作者简介]杨虎，硕士，医师，主要从事高原缺氧及抗缺氧药物研究。
[通信作者]李灵芝，博士，教授，E-mail：13682196000@ 163.com。
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论 著
doi:10.3969/j.issn.2095-3720.2014.11.002
893
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性低压缺氧大鼠脏器损伤［4］、神经细胞缺氧损
伤［5- 7］，内皮细胞缺氧损伤［8，9］、心肌细胞缺氧损
伤［10，11］具有保护作用，可抑制缺氧诱导的细胞凋
亡。研究还发现蕨麻抑制神经细胞凋亡作用与其
下调凋亡通路关键蛋白caspase3表达有关［6］。本实
验模拟相当于海拔7000m高原低压缺氧环境，观察
蕨麻乙醇提取物对高原缺氧大鼠脑组织保护作用
及对caspase3表达的影响。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 药材与试剂：蕨麻乙醇提取物（由本实验室
提取，每g相当于蕨麻生药3g）、尼莫地平片（山西
亚宝药业公司，批号H 14022821）。兔抗caspase3多
克隆抗体（武汉博士德公司）、浓缩型DAB 试剂盒
（北京中杉生物工程公司）。TaKaRa RNA PCR Kit
（AMV ）Ver.3.0试剂盒、DL- 2000Markers（宝生物工
程有限公司）、Trizol Reagent（晶美公司）。
1.1.2 实验动物：成年健康雄性SD 大鼠78只，体质
量（300± 25）g，军事医学科学院动物试验中心提
供，许可证号：SCXK- （军）2002-001。
1.2 方 法
1.2.1 实验分组与给药方法：将78只成年健康SD
大鼠随机分为6组，分别为常氧对照组、低压缺氧
组、尼莫地平组、蕨麻乙醇提取物高剂量组、中剂量
组及低剂量组，每组13只。蕨麻乙醇提取物和尼莫
地平用3‰羧甲基纤维素钠配成混悬液，尼莫地平
组给药剂量为0.02g·（kg·d）-1，蕨麻乙醇提取物3个
剂量组给药剂量分别为3.6、1.8、0.9g·（kg·d）-1；常
氧对照组和低压缺氧组给予等体积3‰ CMC-Na，
每日上午8点定时灌胃给药，给药体积均为2ml，连
续灌胃14d。
1.2.2 低压缺氧模型的建立［12］：除常氧对照组外，
其余各组大鼠均于最后一次灌胃后1h进入缺氧舱
进行低压缺氧，期间维持氧含量 8%~10% ，温度
（25±3）℃，湿度65% ，控制气流流量（0.09~0.1）m3/h。
15min使舱内大气压降至-0.06Mpa（相当于海拔
7000m），实时观察并记录大鼠行为状态；持续缺氧
12h后在15min内使舱内大气压回升至常压，大鼠
出舱，处死，取材。
1.2.3 形态学观察：取大鼠脑皮质用4%甲醛固定，
石蜡包埋，切片，进行HE 染色，光学显微镜下观察
组织形态学改变。
1.2.4 神经元超微结构观察：取大鼠脑皮质用3%戊
二醛固定，常规电镜样品包埋，超薄切片，铀、铅双
重染色，透射电镜下观察神经元超微结构变化。
1.2.5 脑含水量测定：各组大鼠右半脑称重，置
120℃干燥箱烤至恒重，计算含水量：含水量（%）=
（1-干重/湿重）×100%。
1.2.6 RT-PCR 检测caspase3mRNA 的表达：取各
组大鼠脑皮质，按常规方法提取总RNA ，逆转录合
成cDNA。caspase3及内参β-actin的基因序列设计
引物由Invitrogen公司合成，按试剂盒说明对逆转录
产物进行PCR 扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶
电泳鉴定，凝胶图像分析系统测出各扩增条带的光
密度值（A ），结果以目的基因的光密度（Af）与内参
β-actin扩增带的光密度（Ab）比值进行统计分析，得
到其RT-PCR 产物的相对含量。caspase3上游：5-
GCACTGGAATGTCAGCTCGCAA- 3，下游：5-GCC
ACCTTCCGGTTAACACGAC- 3，扩增产物长度为
556bp。 β- actin上 游 ：5- TCCTAGCACCATGAA
GATC- 3，下游：5-AAACGCAGCTCAGTTACAG- 3，
扩增产物长度为180bp。caspase3基因的PCR 反应
条件：94℃预变性5 min，94℃变性30s、55℃退火
20s、72℃延伸1min循环30次，72℃延伸5min。
1.2.7 免疫组化检测caspase3蛋白的表达：石蜡切
片采用SP 免疫组化法染色，按试剂盒说明进行操
作，以PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照。图像分
析系统计数各组免疫反应阳性细胞数。
1.2.8Western blotting方法检测caspase3蛋白的表
达：取脑组织匀浆提取蛋白，用Bradford法进行蛋白
质定量，SDS-PAGE 凝胶电泳，转移蛋白至 PVDF
膜，加一抗4 ℃孵育过夜，加入生物素化二抗37℃
孵育1 h。滴加 SP 复合物，室温孵育1 h。DAB 显
色。测出各条带的光密度值，以同一样品caspase3
条带的光密度与β-actin的光密度比值进行统计分
析，得到其蛋白含量的相对值。
1.2.9 统计学处理：实验结果用（x±s）表示，采用
SPSS 13.0软件进行t检验比较组间差异，以P < 0.05
为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 脑皮质形态学改变
低压缺氧组皮质层神经元整体排列紊乱，胞核
固缩、碎裂、核膜皱缩，核染色质粗颗粒状、深染，核
仁消失，轴突断裂或消失。蕨麻乙醇提取物高剂量
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组皮质层神经元结构基本完整，胞浆均匀、淡染，核
染色质细颗粒状，核仁明显，轴突结构正常存在；中
剂量组皮质层神经元形态较低压缺氧组明显改善，
部分神经元胞核固缩、碎裂、核膜皱缩；低剂量组皮
质大部分神经元胞核固缩，仅少数接近正常形态的
神经元散在；尼莫地平组皮质层部分神经元形态结
构接近正常，大部分神经元核固缩，轴突断裂、消失
（图1，见封二）。
2.2 神经元超微结构观察
透射电镜下，低压缺氧组神经元胞质水肿明
显，细胞器数量减少，排列紊乱；线粒体大部分脊和
膜融合、消失；粗面内质网脱颗粒现象严重，可见双
层核膜融合、消失。与低压缺氧组比较，高剂量组
神经元胞质水肿明显减轻，线粒体未见明显病理改
变，未见粗面内质网扩张、脱颗粒现象；尼莫地平组
神经元胞质中度水肿，线粒体部分脊和膜融合消
失，粗面内质网轻度脱颗粒（图2，见封二）。
2.3 脑含水量测定
持续低压缺氧损伤12h后，低压缺氧组大鼠较
常氧对照组脑含水量明显增加（P < 0.01）；与低压缺
氧组比较，高剂量组可明显降低损伤后的脑含水量
（P < 0.01），中、低剂量组及尼莫地平组与低压缺氧
组无明显差异（P > 0.05）。见表1。
表1各组大鼠脑组织含水量（x±s，n= 10）
组别
常氧对照组
低压缺氧组
蕨麻低剂量组
蕨麻中剂量组
蕨麻高剂量组
尼莫地平组
剂量[g·(kg·d)-1]
-
-
0.9
1.8
3.6
0.02
脑含水量(%)
68.04±0.006
75.05±0.036①
75.04±0.057
74.06±0.071
67.18±0.010②
72.25±0.057
①与常氧对照组比较，P < 0.01；②与低压缺氧组比较，P < 0.01
2.4 脑组织caspase3mRNA 表达
以caspase3特异性引物进行RT-PCR ，各实验
组与对照组均可获得556bp的扩增条带，低压缺氧
后，与常氧对照组相比，低压缺氧组大鼠脑组织内
caspase3mRNA 表达增加显著（P < 0.01）；同低压缺
氧组比较，蕨麻乙醇提取物高、中、低组与尼莫地平
组caspase3mRNA 均明显降低（P < 0.01）（图3A 、图
3B）。
556bp
180bp
C：常氧对照组，M ：低压缺氧组，L：蕨麻低剂量组，I：蕨麻中剂量组，
H ：蕨麻高剂量组，N：尼莫地平组
图3A caspase3RT-PCR 电泳图
①
②②
②②
①与常氧对照组比较，P < 0.01；②与低压缺氧组比较，P < 0.01
图3B 蕨麻对低压缺氧大鼠脑皮质caspase3mRNA
表达的影响
2.5 各组caspase3蛋白水平
免疫组化检测结果显示：caspase3蛋白主要在
胞浆表达，常氧对照组仅有少量表达，阳性物质呈
浅棕色。低压缺氧损伤后，与常氧对照组相比，大
鼠脑组织内caspase3蛋白表达明显升高（P < 0.01），
阳性反应产物呈深棕黄色颗粒（图4A ，封二）。蕨麻
乙醇提取物中、高剂量组与尼莫地平组与低压缺氧
组比较，大鼠脑组织caspase3蛋白表达显著降低，
单位面积内阳性细胞数有统计学差异（P < 0.01），见
图4B。Western blotting检测结果显示：低压缺氧后，
caspase3蛋白水平明显升高，蕨麻高、中、低剂量组
及尼莫地平组caspase3蛋白水平明显下调（图5A 、
图5B）。
②
①
②
②
②
C：常氧对照组；M ：低压缺氧组；L：蕨麻低剂量组；I：蕨麻中剂量组；
H ：蕨麻高剂量组；N：尼莫地平组；①与常氧对照组相比，P < 0.01；
②与低压缺氧组相比，P < 0.01
图4B 蕨麻对低压缺氧大鼠脑皮质caspase3蛋白表达的
影响（SP 染色，×200）
性
细
胞
数
（个
）
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C：常氧对照组；M ：低压缺氧组；L：蕨麻低剂量组；I：蕨麻中剂量组；
H ：蕨麻高剂量组；N：尼莫地平组
图 5A Westernblotting检测低压缺氧大鼠脑皮质
caspase3蛋白表达
①
②
②
②
②
①与常氧对照组相比，P < 0.01；②与低压缺氧组相比，P < 0.01
图5B 蕨麻对低压缺氧大鼠脑皮质caspase 3蛋白
表达的影响
3 讨 论
初次进入海拔3000m以上高原地区，大多数人
会因海拔高度造成的气压差、空气稀薄、干燥及强
紫外线照射而产生一系列临床症状和机能代谢变
化，主要表现为前额和双颞部跳痛、胸闷气短、恶心
呕吐、食欲不振、意识恍惚、认知力下降等，一般3
~5 d症状明显，以后逐渐减轻，1周左右消失，但也
有少数人群症状加剧并发展为高原肺水肿或高原
脑水肿。脑组织对缺氧耐受性差，长时间的低压缺
氧可导致神经元变性，细胞凋亡增加。本实验结果
显示，大鼠在相当于海拔7000m高度缺氧12h后，
脑含水量明显增加，脑皮质切片HE 染色也发现细
胞整体排列紊乱，胞核固缩、碎裂、核膜皱缩，核染
色质粗颗粒状、深染，核仁消失，轴突断裂或消失，
说明模拟高原缺氧造成了大鼠脑损伤，预先给予蕨
麻乙醇提取物可明显降低脑组织含水量，改善神经
元的组织结构，表明蕨麻对低压缺氧导致的脑损伤
具有保护作用。
缺氧会造成自由基的大量堆积，引起细胞凋亡
的发生，导致神经元氧化损伤。caspase基因家族与
细胞凋亡关系密切，其含有的半胱氨酸蛋白酶，介
导即将死亡的细胞发生高效特异的蛋白水解作
用。促凋亡因子caspase3是半胱氨酸蛋白酶家族
重要成员之一，也是凋亡途径的重要蛋白酶，在各
种因素启动的凋亡程序中发挥最后的枢纽作用，是
细胞凋亡的最终执行者，决定了细胞凋亡的形态学
及生物化学改变。正常情况下caspase3以无活性的
酶原形式存在于胞浆中，但在凋亡信号的刺激下可
水解成四聚体结构，并参与一系列的细胞凋亡变化
过程，包括降解细胞内的蛋白底物，导致凋亡抑制剂
失活，促使染色质聚集及凋亡小体形成等，因此
caspase3的活化是细胞凋亡通路中心环节［13，14］。
QIN等［5，6］采用体外培养大鼠海马神经元缺氧模型
研究证实，神经元缺氧时，Cyt c、 aspase3和caspase9
mRNA 及蛋白表达均升高，促进神经细胞凋亡发生，
蕨麻提取物干预后可通过下调上述基因及蛋白表
达水平，抑制神经元凋亡。课题组前期研究也发
现，在低压缺氧条件下，蕨麻可以通过影响血管舒
缩因子、上调脑红蛋白的表达，减轻缺氧导致的大
鼠脑海马组织病理改变［4，12］。
本研究结果显示，低压缺氧组脑皮质层神经元
caspase3mRNA 及其蛋白的表达显著升高，预先给
予蕨麻乙醇提取物，可下调caspase3mRNA 及其蛋
白的表达，改善缺氧性脑损伤，提示蕨麻在低压缺
氧状态下的脑保护作用可能与其下调脑组织
caspase3表达有关，蕨麻可能通过抑制caspase3表
达，阻止神经细胞凋亡的发生，从而对神经元起到
保护作用。
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等发现，过表达OGG 1可通过直接结合并活化顺乌
头酸酶，抑制H 2O 2孵育对人肺泡上皮细胞线粒体的
损伤[14]。Lee等报道SUN 423肝瘤细胞含极低水平
OGG 1，而在该细胞中过表达OGG 1可有效改善线粒
体呼吸功能，抑制ROS 生成[15]。以上提示，HIT 上调
OGG 1表达是提高线粒体低氧耐受能力的机制之一。
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蕨麻对急性低压缺氧大鼠脑组织保护作用及Caspase3表达的影响
(正文见第S93页）
A (常氧对照组)：神经元排列规则，细胞完整，轴突清晰可见，胞浆淡染均质，核仁清晰易见；B (低扭缺氧组)：祌经元整体排列紊乱，
胞核固缩、碎裂、核膜皱缩，轴突断裂或消失；C (蕨麻高剂量组)：神经元结构基本完整，胞浆均匀、淡染，核染色质细颗粒状，核仁明
显，轴突结构正常存在，D (尼莫地平组〉：部分神经元形态结构接近正常，大部分神经元核固缩，轴突断裂、消失
图1各组大鼠脑皮质病理变化�HE染色，X200)
A (常氧对照组)：细胞器数量多，线粒体、粗面内质网及高尔基体结构正常；B (低压缺氧组)：线粒体肿胀，脊和股融合消失；
C (蕨麻高剂量组)：胞质水肿减轻，线粒体结构邀本正常；D (尼莫地平组)：部分线粒体脊和膜融合消失，粗面内质网轻度脱颗粒
图2各组大鼠皮质神经元超微结构变化（透射电镜，X20 000)
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A�常氧对照组；B:低压缺氧组，C:蕨麻3.6 g/kg组；D:尼莫地平组
图4A蕨麻对低压缺氧大鼠脑皮质CaSpaSe3蛋白表达的影响�SP染色，X200)