全 文 ：羊脂炙品中所含有的其他主要黄酮类成分朝藿定
A、B、C和宝藿苷 I 的转运进行了考察，由于生品与
羊脂炙品中所含有的朝藿定 A、B、C 和宝藿苷 I 的
含量相对较低，加之单体朝藿定 A、朝藿定 B、朝藿
定 C的渗透系数较小〔8〕，因此在上述液相条件下未
能在 Caco-2 细胞接收侧检测到，无法计算其渗透系
数，有待今后用 LC-MS 等高灵敏度的仪器进行测
定，以全面掌握羊脂炙淫羊藿的体内吸收情况。总
之，对羊脂油炮制淫羊藿的增效机理有待于进一步
深入研究。
参 考 文 献
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收稿日期:2012-05-15
基金项目:云南省科技计划项目(2008CD212)
作者简介:张晓南(1981-) ，女，硕士，工程师，主要从事中药材品质检测研究;Tel:15987129114，E-mail:xiaonan1242@ 126. com。
* 通讯作者:符徳欢，Tel:13658867777，E-mail:fudehuan@ 126. com。
·鉴别·
黄草乌及其混淆品 ITS序列的分析鉴别
张晓南，杜春华，符徳欢* ，高 丽，周培军，王 丽
(云南省药物研究所，云南 昆明 650111)
摘要 目的:比较黄草乌及其混淆品滇南草乌 ITS序列的差别。方法:分别提取黄草乌及滇南草乌总 DNA，进
行 PCR扩增、扩增产物直接测序，利用 DNAStar、ClustalX1. 81 及 MEGA4. 0 软件进行序列分析。结果:通过对黄草
乌及其混淆品的 ITS数据矩阵，得到 ITS1 产生 229 个一致位点、19 个变异位点和 13 个信息位点;5. 8S产生 162 个
一致位点、2 个变异位点和 1 个信息位点;ITS2 产生 217 个一致位点、3 个变异位点和 1 个信息位点。除了 5. 8S没
有碱基的转换和颠换，ITS1 存在 2 个碱基转换和 1 个颠换，ITS2 只存在 1 个颠换。黄草乌 2 个居群和滇南草乌 3
个居群的 ITS测序结果经数据矩阵分析后，发现二者 ITS2 区间第 596 个碱基处为鉴定二者的稳定的信息位点，黄
草乌 2 个居群的所有样品在此位点的碱基为(C) ，而滇南草乌 3 个居群的所有样品在此位点的碱基为(A)。结论:
黄草乌与其混淆品滇南草乌的核 rDNA 的 ITS 序列存在碱基的差异，有特定的变异位点，且位点变异表现出 ITS1
大于 ITS2，因此，能在分子水平上将二者分开。
关键词 黄草乌;滇南草乌;ITS序列;分析鉴别
中图分类号:R282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2012)09-1410-04
Study on ITS Sequences of Aconitum vilmorinianum and its Medicinal Adulterant
ZHANG Xiao-nan，DU Chun-hua，FU De-huan，GAO Li，ZHOU Pei-jun，WANG Li
(Yunnan institute of materia medica，Kunming 650111，China)
Abstract Objective:To analyze and compare the ITS sequences of Aconitum vilmorinianum and its medicinal adulterant Aconitum
austroyunnanense. Methods:Total genomic DNA were extracted from sample materials by improved CTAB method，ITS sequences of sam-
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ples were amplified using PCR systems，directly sequenced and analyzed using software DNAStar，ClustalX1. 81 and MEGA 4. 0.
Results:299 consistent sites，19 variable sites and 13 informative sites were found in ITS1 sequences，162 consistent sites，2 variable
sites and 1 informative sites were found in 5. 8S sequences，217 consistent sites，3 variable sites and 1 informative site were found in
ITS2 sequences. Base transition and transversion was not found only in 5. 8S sequences，2 sites transition and 1 site transversion were
found in ITS1 sequences，only 1 site transversion was found in ITS2 sequences comparting the ITS sequences data matrix. By analyzing
the ITS sequences data matrix from 2 population of Aconitum vilmorinianum and 3 population of Aconitum austroyunnanense，we found a
stable informative site at the 596th base in ITS2 sequences，in all the samples of Aconitum vilmorinianum the base was C，and in all the
samples of Aconitum austroyunnanense the base was A. Conclusion:Aconitum vilmorinianum and Aconitum austroyunnanense can be
identified by their characters of ITS sequences，and the variable sites in ITS1 sequences are more than in ITS2 sequences.
Key words Aconitum vilmorinianum Kom.;Aconitum austroyunnanense W. T. Wang;ITS sequence;Analisis and identify
黄草乌为毛茛科乌头属植物黄草乌 Aconitum
vilmorinianum Kom. 的块根，收载于 2005 年版《云南
省中药材标准》(药材标准号为云 YNZYC-0338-
2010) ，又名草乌、大草乌、昆明堵喇(云南)、昆明乌
头;具有搜风、胜湿活血、止痛的功效，用于治疗风寒
湿痹、中风瘫痪、心腹痛、跌打损伤等症，分布于昆
明、嵩明、玉溪、禄劝、寻甸、马龙等地〔1，2〕。黄草乌
为三乌胶、云南红药胶囊、肿痛搽剂、肿痛气雾剂等
中成药的原料药材之一，因此准确鉴定基原，对于完
善质量标准，保证药材质量的稳定性十分必要。在
云南民间及药材市场上，滇南草乌 Aconitum aus-
troyunnanense W. T. Wang 的块根常与黄草乌混用，
影响了以黄草乌为原料药材的中成药的质量。同
时，滇南草乌分布于景东及新平〔2〕，分布区域较狭
窄，资源非常有限，将其混用所产生的株连性采集对
其物种的生存造成了明显的危害，能够确切鉴别二
者将对这一物种的保护产生十分积极的作用。
核 rDNA 的内转录间隔区(internal transcribed
spacers，ITS)介于 18S 和 5. 8S 之间(ITS1)及 5. 8S
和 26S之间(ITS2)的一段序列(包括 5. 8S rDNA) ，
变异速度较快，可以提供较丰富的变异位点和信息
位点〔3〕。黄草乌及滇南草乌二者的 DNA分子鉴别未
见报道，本文基于 DNA 分子标记技术，研究二者的
ITS序列的差异性，以期为黄草乌类药材的质量控制
及滇南草乌种质资源保护提供可靠的理论依据。
1 材料与仪器
1. 1 材料 采集云南 5 个具有代表性地方居群共
52 个黄草乌和滇南草乌个体，见表 1。每个居群采
集干净健康叶片用变色硅胶干燥后于 － 20 ℃保存，
标本均由中国科学院华南植物研究所研究员杨亲二
鉴定。凭证标本储存于云南省药物研究所天然药物
资源研究中心标本室。
1. 2 仪器 PCR扩增仪(Mastercycler eppendorf )、
电泳仪电源(DYY-6C，北京六一仪器厂)、水平电泳
仪(DYCP-31DN，北京六一仪器厂)、全自动凝胶成
像仪(2F-258，上海嘉鹏科技有限公司)、常温离心
机(eppendorf 5418)、恒温水浴槽(NTT-2000，日本
Eyela)。
表 1 黄草乌和滇南草乌的来源及 ITS
序列 Gengen注册登录号
种名 采集地 个体数 凭证标本号
GenBank
登录号
黄草乌 昆明团结乡(KZS) 10 20090520 JQ350823
晋宁双和乡(SH) 10 20090521 JQ350824
滇南草乌 新平水塘乡帽山(BY) 10 20090465 JQ387580
景东县锦屏镇黄草
岭(H) 12 20090519 JQ350822
镇沅县九甲乡和平
村麦子山(J) 10 20090467 JQ350821
1. 3 试剂 液氮(云南昆明梅塞尔公司)、CTAB
(上海生工生物工程有限公司)、Tris(上海生工生物
工程有限公司)、DNA Marker DL2000 (上海捷瑞生
物工程有限公司)、琼脂糖(上海生工生物工程有限
公司分装)、TaqDNA 聚合酶(Biomed)、dNTP(pro-
mega)、UltrapowerTM DNA stain(BioTeke)、寡核苷酸
引物(上海生工生物工程有限公司及昆明硕阳有限
公司合成)。
2 实验方法
2. 1 总 DNA提取与检测 取液氮研磨粉末(约
0. 1 mL)于 1. 5 mL 离心管中，加入经65 ℃预热的
700 μL CTAB 混合后温浴 1 h，期间不断震摇(10
min摇一次)。待样品冷却至室温，加入 600 μL 氯
仿-异戊醇(24∶ 1)颠倒混匀至溶液成乳浊，放入常温
离心机 10 000 rpm离心 10 min，取上清液，重复上述
步骤一次。加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰上静
置 20 min后，离心(10 000 rpm，10 min)。小心倒掉
上清液，70%乙醇洗沉淀 2 次，晾干。加入 50 μL双
蒸灭菌水及 5 μL RNaseA，37 ℃温浴 30 min。加入
130 μL 70%乙醇和 0. 2 mol /L乙酸钠 6 μL，颠倒混
匀，离心(10 000 rpm，10 min) ，倒掉上清液，70%乙
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醇洗 2 次，晾干，溶于 60 μL灭菌双蒸水中，－ 20 ℃
保存。反应后，取 5 μL PCR反应产物与 2. 5 μL 6 ×
loading buffer、1 μL UltrapowerTM DNA stain混合后于
1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2. 2 ITS序列的扩增 采用 ITS通用引物〔4〕，序列
如下:ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，ITS5:
5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3。PCR 扩 增
反应体系为 25 μL，含 2. 5 μL 10 × PCR Buffer、Mg2 +
2. 0 μL(25 mmol /L )、模板 2. 0 μL (30 ～ 90 ng)、1
μL Taq酶(1 U /L)、dNTP 2. 5 μL(2. 5 mmol /L)、引
物各 2. 0 μL(5 μmol /L) ，灭菌双蒸水补足至 25 μL。
置于 eppendorf PCR 扩增仪中，94 ℃，预变性 4 min
后，按下列参数进行 30 个循环:94 ℃ 1 min，55 ℃
30 sec，72 ℃ 1 min;最后72 ℃延伸 7 min。
2. 3 测序 PCR产物直接用于测序反应，测序工
作在上海生物工程有限公司的 ABI-PRISM3730
DNA自动测序仪上完成。每个物种的 ITS 序列采
用正反两个方向测序。
2. 4 数据处理 运用 DNAStar 软件对材料的正反
相序列进行拼接。ITS 序列排列用 ClustalX1. 81 软
件完成，并经过手工调整后，以弯喙乌头 Aconitum
campylorrhynchum 为外类群〔5〕，用系统发育分析软
件 MEGA4. 0 进行序列数据计算和系统发育树构
建。
3 结果与分析
3. 1 ITS 序列差异 本实验对黄草乌的 2 个居群
和滇南草乌的 3 个居群共 52 个样品进行 PCR 扩
增，结果扩增测序成功的有 33 个样品作为实验分
析。ITS的界限是根据 Genebank上 Aconitum campy-
lorrhynchum (登录号 AY571359)来进行界定的。并
且 18S、26S片段在注册到 GenBank 之前已被删除。
二者的 ITS1，5. 8S rDNA 和 ITS2 序列分别注册到
GenBank，其序列号分别为:黄草乌(JQ350823，
JQ350824) ，滇 南 草 乌 (JQ387580，JQ350822，
JQ350821) ，见表 1。两个种不同产地的 ITS 长度及
GC含量见表 2。黄草乌与滇南草乌的 ITS 全序列
(包括 ITS1，5. 8S rDNA 和 ITS2)的长度范围为 623
～ 632 bp，5. 8S rDNA 为 164 bp，长度无变异，ITS1
和 ITS2 的长度和 GC 含量随居群和种的不同而有
差异，详见表 2。
表 2 黄草乌和滇南草乌各居群 ITS序列长度及 GC含量
编号
ITS1 + 5. 8S + ITS2
长度
/bp
GC含量
/%
ITS1
长度
/bp
GC含量
/%
5. 8S
长度
/bp
GC含量
/%
ITS2
长度
/bp
GC含量
/%
KZS 630 60. 11 247 61. 13 164 53. 56 219 63. 85
SH 623 ～ 630 60. 31 240 ～ 247 61. 61 164 53. 59 219 ～ 220 63. 89
BY 629 ～ 631 59. 82 248 ～ 249 60. 93 164 53. 05 217 63. 59
H 625 ～ 630 60. 31 243 ～ 247 61. 97 164 53. 66 218 ～ 219 63. 44
J 629 ～ 632 60. 31 246 ～ 247 61. 85 164 53. 66 219 ～ 221 63. 33
注:KZS. 昆明团结乡黄草乌，SH. 晋宁双和乡黄草乌，BY. 新平水塘乡帽山滇南草乌，H. 景东县锦屏镇黄草岭滇南草乌，J. 镇沅县九甲乡
和平村麦子山滇南草乌
3. 2 ITS 序列鉴别位点分析 通过 ITS 数据矩阵
(见表 3) ，得到 ITS1 产生 229 个一致位点，19 个变
异位点，13 个信息位点;5. 8S产生 162 个一致位点，
2 个变异位点，1 个信息位点;ITS2 产生 217 个一致
位点，3 个变异位点，1 个信息位点。除了 5. 8S 没有
碱基的转换和颠换，ITS1 存在 2 个碱基转换和 1 个
颠换，ITS2 只存在 1 个颠换。本次研究通过对黄草
乌 2 个居群和滇南草乌 3 个居群的 ITS 测序结果经
数据矩阵后，黄草乌与滇南草乌 ITS 序列存在碱基
的差异，有特定的变异位点，且位点变异表现出
ITS1 大于 ITS2，发现二者在 ITS2 区间第 596 个碱基
处为稳定的信息位点，黄草乌 2 个居群的所有样品
在此位点的碱基为(C) ，而滇南草乌 3 个居群的所
有样品在此位点的碱基为(A)。
表 3 ITS序列特征
项目 ITS1 5. 8S ITS2
长度范围 /bp 240 ～ 249 164 217 ～ 221
保守位点数 /bp 229 162 217
变异位点数 /bp 19 2 3
信息位点数 /bp 13 1 1
转换 / si 2 0 0
颠换 / sv 1 0 1
3. 3 系统发育分析 基于 ITS 全长序列用 MEGA
4. 0 除权配对法(UPGMA)构建的系统发育树，见图
1。采用 DNAStar软件进行系统发育分析表明，来自
不同居群的黄草乌样品同源性在 98 %以上，来自不
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同居群的滇南草乌样品的同源性均在 98%以上，同
时又具有一定的变异性。弯喙乌头(A. campylor-
rhynchum )作为外类群基于树根底部。系统发育树
的置性度虽然低，但是，产于晋宁双和乡、昆明团结
乡共 2 个居群的黄草乌 SH、KZS 各样品的 ITS 序列
聚为一支，产于镇沅县九甲乡和平村麦子山、景东县
锦屏镇黄草岭、新平水塘乡帽山共 3 个居群 J、H、
BY各样品 ITS 序列聚为另外一支。黄草乌及其混
淆品滇南草乌分别聚为独立的分支，表明二者具有
一定的遗传差异。
图 1 黄草乌和滇南草乌 5 个居群 33 个样本 ITS序列的系统聚类图
注:KZS 1 ～ 8. 昆明团结乡黄草乌，SH 1 ～ 7. 晋宁双和乡黄草乌，BY 1 ～ 5. 新平水塘乡帽山滇南草乌，H 1 ～ 5. 景东县锦屏镇黄草岭滇南
草乌，J 1 ～ 8. 镇沅县九甲乡和平村麦子山滇南草乌
4 讨论
被子植物核 rDNA的 ITS 区包括 5. 8S rDNA 在
内的总长度为 600 ～ 700 bp，其中 5. 8S rDNA的长度
非常保守，一般为 163 bp 或 164 bp，在有些类群中
根本没有变异，而在另一些类群中有 1 ～ 6 个变异位
点〔6〕。黄草乌及其混淆品滇南草乌的 rDNA5. 8S 存
在 2 个变异位点，在变化范围内，说明二者的 rD-
NA5. 8S比较保守。
本文选取了黄草乌 2 个居群共 20 个样品和滇
南草乌 3 个居群共 32 个样品进行实验及数据分析，
发现在 ITS2 区间第 596 个碱基为鉴别二者的稳定
信息位点，通过对黄草乌和滇南草乌的已鉴定标本
干燥叶片的 DNA 提取进行 PCR 测序分析后，证实
了这个位点的稳定性。在通过 ITS 序列测序结果构
建的 UPGMA聚类树上可以看出，黄草乌各居群样
品和滇南草乌各居群样品分别聚为两个独立的分
支。因此，ITS 可以作为黄草乌及其混淆品滇南草
乌的分子鉴别手段。
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