全 文 ：图 1　单次灌胃给药 W3的血浆药物浓度-时间曲线 (n= 5)
3　讨论
　　本试验中血浆处理采取丙酮直接沉淀蛋白 , 水浴蒸干后甲
醇溶解进样。曾尝试采取有机溶剂萃取 ,由于回收率极低 , 故未
采用。用三氯醋酸沉淀蛋白后发现回收率较低 , 可能是由于三
氯醋酸的酸性较强以及沉淀蛋白的吸附作用所致;用乙腈沉淀
蛋白时 , 血样内成分复杂 ,分离效果不佳。因此最终采用丙酮沉
淀蛋白 , 方法简便快速。
　　本法排除了代谢产物的干扰 , 分离效果好 , 专属性强且血
浆中杂质或内源性物质均不干扰测定。 HPLC法所测得的 t1/2
以及药时曲线中产生双峰现象与同位素示踪法 [ 8]没有明显的
差异。蜈蚣三七提取物 ig给药可能对胃肠有一定的刺激性 ,使
吸收功能下降 , 经过一段时间的适应之后 , 胃肠吸收逐渐增强 ,
功能恢复正常 , 因此出现两个高峰。药物的体内双峰现象一般
与药物在体内的肠-肝循环或肠-胃循环有关 , 这也可能是 W3
的体内双峰现象产生的另一原因 。药时曲线第 2峰的出现 ,必
然影响药物作用强度及消除过程。对双峰现象的研究可为临
床制定更周密的给药方案提供科学依据 , 以提高疗效 、减少不
良反应。另外 , W3的血浆消除半衰期 t1/2为 2.6 h～ 3.3 h, 在
体内运转较快 ,提示该药物可考虑制备成缓释剂 , 以延长药物作
用时间。 HPLC法所测得的其它药代动力学参数与同位素示踪
法有一定的差异初步推测为动物种属及品系差异以及采用不
同方法灵敏度差异产生的原因。
参考文献
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鹅掌草总皂苷的抗肿瘤活性研究＊
韩林涛 1 ,黄　芳 1, 2＊＊ ,殷勇冠 3 ,莫志贤 3
(湖北中医学院 1中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室 ,武汉　430065;
2基础医学部 中药教研室 ,武汉　 430065;3南方医科大学 中医药学院 ,广州 　510515)
　　摘　要　目的:研究鹅掌草总皂苷的抗肿瘤活性。方法:用 MTT法检测鹅掌草总皂苷对不同肿瘤细胞生长抑制作用;用流式
细胞术(FCM)检测鹅掌草总皂苷对细胞凋亡的影响。结果:鹅掌草总皂苷对肝癌细胞 Bel-7402、宫颈癌细胞 HeLa、肺癌 A259均有
一定的抑制生长的作用 , 并有一定的剂量依赖关系;浓度在 20μg/ml及 40μg/ml时有促进细胞凋亡的作用 , 对不同细胞株的结果相
似。结论:鹅掌草总皂苷具有抑制肿瘤细胞生长作用 , 诱导肿瘤细胞死亡的主要途径是凋亡。
　　关键词　鹅掌草;抗肿瘤;MTT法 ;流式细胞术
　　鹅掌草(AnemoneflaccidaFr.Schmidt)系毛茛科银莲花属
多年生植物 , 该属植物约有 150种左右 [ 1, 2] , 其中鹅掌草在湖北
省西部有广泛的分布 [ 1] 。 银莲花属植物的生物活性主要为抗
肿瘤与抗炎 , 三萜皂苷是抗肿瘤与抗炎的活性部位 [ 3～ 6] 。现代
药理研究表明 , 鹅掌草皂苷类成分主要生物活性有抗炎 、解热
镇痛等等 [ 7, 8] , 而其抗肿瘤作用未见报道 ,本文研究了鹅掌草总
皂苷对多种肿瘤增殖的影响及诱导肿瘤细胞凋亡作用。
25中药药理与临床 2009;25(1)
＊ 基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30870255)　　　　＊＊通讯作者
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2009.01.014
1　材料与方法
1.1　 试验药物　鹅掌草总皂苷 ,自制 , 鹅掌草采于湖北省九
峰地区 , 由中国科学院武汉植物园袁晓博士鉴定。取鹅掌草根
茎 0.5kg, 粉碎(过 60目筛),加入 8倍量甲醇浸渍 2小时 ,室温
下超声提取 , 每次 1小时 , 共提 3次 , 滤过 , 合并滤液 , 减压回收
溶剂 , 水浴上浓缩至无甲醇味 , 加水混悬 ,以等量的乙酸乙酯 、水
饱和正丁醇依次萃取 3次 , 合并水饱和正丁醇提取液 , 蒸干 ,水
溶解 , 过滤 ,滤液上 D101大孔树脂 , 依次用水 、 70%、 95%乙醇
洗脱;收集 70%乙醇洗脱部分 ,回收乙醇并水浴蒸干 , 得鹅掌草
总皂苷 26.5g, 得率 5.3%。精密称取鹅掌草总皂苷 10mg, 先用
DMSO溶解 ,再用 PBS稀释至所需浓度 ,备用。
1.2 　试剂 　二甲基亚砜 DMSO、胰蛋白酶 、氯霉素 、青霉素 、
EDTA(Amresco公司);RPMI1640(GIBCO公司);MTT、PI(Sig-
ma公司);胎牛血清 、新生牛血清(三利生物制品厂)。
1.3　 细胞株　 肝癌细胞 Bel-7402、宫颈癌细胞 HeLa、肺癌
A259均由武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供。
1.4　 仪器　 SHELLRBCO2恒温细胞培养箱(Sheldon);CK2-
TRC-3倒置显微镜(Olympus);SHZ-82A恒温震荡器(国华企
业);SUNRISE酶标仪(TECAN公司);FACSCalibur流式细胞仪
(BD公司)。
1.5　方法　
1.5.1　鹅掌草总皂苷对体外培养肿瘤细胞形态的影响 　 Bel-
7402、HeLa、A259培养于含 10%新生牛血清的 RPMI1640培养
液中 , 5%CO2, 37℃培养箱内常规传代培养 , 取对数生长期细胞
用于试验。培养 24小时后 , 加入不同浓度总皂苷 , 阴性对照组
加入等体积含等量 DMSO的 PBS溶液(下同), 培养 12小时后 ,
在 Olympus倒置显微镜下观察细胞形态变化。
1.5.2　鹅掌草总皂苷对体外培养肿瘤细胞生长的抑制作用 　
取对数期细胞制成细胞悬液 , 稀释至浓度为 2.5×103 ～ 50 ×
103 /ml,接种于 96孔培养板内 ,每孔 200μl, 24h后倾出培养液 ,
加入含不同浓度提取液的培养液 , 终浓度分别为 5、 20、 80、
100μg/ml,每一浓度组均设 4孔。对照孔加含等量 DMSO的培
养液 , 空白调零组加 200μl培养液(不含细胞)。在加药后 24h
加入 MTT溶液 20μl, 继续培养 4h,小心倒去培养液 ,加入 200μl
DMSO, 在酶标仪上测定各孔 A值 , 测定波长为 492nm, 按下列
公式计算抑制率(IR):IR(%)=(1-给药孔平均 A值 /对照孔
平均 A值)×100%。
1.5.3　鹅掌草总皂苷对细胞凋亡的影响　细胞生长 24h以
后 , 分别加入 MTT试验有效浓度总皂苷继续培养 12h。 0.25%
胰酶消化细胞 , 经 PBS清洗后 , 离心去上清 ,用 70%的冰乙醇固
定。检测前离心 , 用 PBS清洗后 , 弃上清液。后加入 1ml染色
液(含 PI0.1mg/ml、RNase0.1mg/ml), 室温避光 20min, 过 300
目尼龙网后上机 , 用 CELLQuest软件分析 , 测定凋亡细胞的比
例。
2　结果
2.1　鹅掌草总皂苷对体外培养肿瘤细胞形态的影响　加入
鹅掌草总皂苷的 Bel-7402、HeLa、A259细胞均有不同程度的受
损现象。各组随总皂苷浓度增加细胞密度明显降低 , 细胞的体
积逐渐变小 , 变形 ,某些细胞出现皱缩 、变圆 、甚至脱落现象。
2.2　鹅掌草总皂苷对体外培养 3种肿瘤细胞生长的抑制作用
　结果见表 1。
　　表 1　鹅掌草总皂对 3种肿瘤细胞生长的抑制作用( x±s, n=6)
分组(μg/ml) Bel-7402 HeLa A259
空白 0.433±0.176 0.585±0.216 0.537±0.176
对照 2.412±0.211 2.611±0.235 2.722±0.196
2.5 2.477±0.222 2.767±0.257 2.854±0.228
5 2.412±0.211 2.511±0.235 2.775±0.196
10 2.245±0.265 2.311±0.288 2.522±0.296
20 1.668±0.225＊ 1.787±0.239＊ 1.897±0.235＊
40 1.317±0.195＊＊ 1.455±0.231＊＊ 1.521±0.265＊＊
　　与对照组比较＊P<0.05, ＊＊P<0.01
　　从试验结果可看出:鹅掌草皂苷高浓度对 3种肿瘤细胞均
有抑制生长作用 ,与对照有显著性差异。
2.3　鹅掌草提取物对体外培养肿瘤细胞凋亡的影响 　结果
见表 2及图 1。
　　表 2　鹅掌草总皂苷对 3种肿瘤细胞凋亡的影响 (凋亡率%)
提取部位 Bel-7402 HeLa A259
对照 2.07 2.32 2.21
低浓度 20μg/ml 9.33 6.68 5.27
高浓度 40μg/ml 26.44 17.60 18.14
　　从表 2及图 1中可以看出:鹅掌草皂苷 MTT有效浓度对 3
种肿瘤细胞均有促进凋亡作用 , 与阴性对照有显著性差异;对
Bel-7402细胞促进细胞凋亡作用最强。
3　讨论
　　近年来研究表明银莲花属植物具有一定的抗肿瘤作用 , 如
多被银莲花(竹节香附 、两头尖)总苷能抑制癌的生成;口服总
皂苷 200 mg/kg, 对艾氏腹水癌 、肉瘤 S180、宫颈癌的抑制率分
别为 49%, 59%, 84%以上 [ 9] 。多被银莲花素 A30μg/ml对腹
水型肝癌(AH)细胞抑制率为 81%, 在体外能显著抑制小鼠
S180和腹水型肝癌细胞的 DNA、RNA和蛋白质的合成 , 其抑制
率随时间的延长(12 ～ 48 h)而增加 , 它对 DNA合成 48 h的
LD50为 21μg/ml。经多被银莲花素 A作用后 , 腹水型肝癌细胞
的 DNA合成不能恢复 , 故其抑制似属 DNA模板损伤型 [ 9 , 10] 。
腹腔注射多被银莲花素 A(10 mg/kg)连续 5 d, 能提高小鼠血浆
cAMP含量的 61%, 从而防止细胞癌变及抑制其分裂作用 [ 11] 。
西南银莲花总皂苷中含有的 8种齐墩果酸糖苷 , 其中有 3种在
体外可明显抑制肺癌 、卵巢癌 、结肠癌 、乳腺癌 、肾癌 、前列腺癌
及黑色素瘤等癌细胞的生长 [ 3];体外实验活性最强的齐墩果酸-
3-O-β-D-吡喃木糖基(1※ 3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1※ 2)[ β -D-吡
喃葡萄糖基(1※ 4)] -α-L-吡喃阿拉伯糖苷 , 腹腔注射和灌胃给
药均对小鼠肉瘤 S180有抑制作用 [ 4] 。值得注意的是 , 与鹅掌
草皂苷相类似的成分对人正常成纤维细胞的 IC50比对肿瘤细
胞的高 10-35倍 , 所以鹅掌草皂苷类成分对正常细胞可能不具
毒性作用 ,但应做进一步研究验证 [ 5] 。
　　本研究中 MTT试验发现鹅掌草总皂苷对体外三种肿瘤细
胞生长均有一定的抑制作用 , 以用流式细胞术检测鹅掌草总皂
苷 MTT有效浓度下对细胞凋亡的影响 , 检测结果与 MTT结果
基本一致 。因此 , 鹅掌草总皂苷抑制肿瘤细胞生长的可能途径
是诱导肿瘤细胞凋亡。其抗肿瘤作用机理还需深入研究。
26 中药药理与临床 2009;25(1)
图 1　鹅掌草总皂苷对 3种肿瘤细胞凋亡的影响
A.Bel-7402细胞株阴性对照;B.HeLa细胞株阴性对照;C.A259细胞株阴性对照;D.Bel-7402细胞株高浓度;E.HeLa细胞株高浓度;F.A259细胞
株高浓度;G.Bel-7402细胞株低浓度;H.HeLa细胞株低浓度;I.A259细胞株低浓度
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谭宏棣 ,孙　懿 ,覃斐章 ,周燕文 ,黄仁彬＊＊
(广西医科大学药理学教研室 ,南宁　 530021)
　　摘　要　目的:观察柿叶总黄酮(PLF)对大鼠心肌缺血再灌注(MIR)损伤的保护作用。方法:采用在体大鼠结扎冠状动脉左
前降支 30min后再灌注 60 min造成心肌缺血再灌注模型。在结扎前 30 min分别用不同剂量 PLF进行预处理。测定血清中丙二醛
27中药药理与临床 2009;25(1)
＊ 基金项目:广西科学基金(桂科自 0832013Z)　　　　＊＊通讯作者