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岩乌头的化学成分及对烟草花叶病毒病的活性



全 文 :农 药
AGROCHEMICALS
第52卷第4期
2013年4月
Vol. 52, No. 4
Apr. 2013
岩乌头的化学成分及对烟草花叶病毒病的活性
黄烈军1,2,葛永辉1,刘开兴1,张建新1,郝小江1
(1.贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室,贵阳 550002; 2.贵州大学 精细化工研究开发中心,贵阳 550025)
摘要:[目的]前期对岩乌头中二萜生物碱成分及抗肿瘤活性的研究,现探索岩乌头中二萜生物碱与烟草花叶
病毒病之间的作用。 [方法]运用硅胶、反相RP-18柱层析、Sephadex LH-20、HPLC等多种色谱手段和方法分
离纯化化合物,采用核磁共振、质谱等现代波谱技术和理化性质鉴定化合物的结构。 利用盆栽法测定了岩乌
头中二萜生物碱对烟草花叶病毒病侵染和增殖的影响。 [结果]分离鉴定6个化合物:circinatum E、fuziline、
14-acetylchasmamine、chasmamine、14-acetytalatisamine、hemsleyanine A。 化合物racemulosine A、sachaconitine、
talatisamine和14-acetytalatisamine对烟草花叶病毒侵入率显著降低;化合物racemulosine A和talatisamine对烟
草花叶病毒的增殖有较好的抑制。 [结论] 6个化合物均为首次从该种植物中分离得到;化合物racemulosine A、
sachaconitine、talatisamine和14-acetytalatisamine等可以作为新型抗病毒剂用于防治烟草花叶病毒病。
关键词:岩乌头;二萜生物碱;化学成分;烟草;烟草花叶病毒;侵染;增殖
中图分类号:S482.2 文献标志码:A 文章编号:1006-0413(2013)04-0295-03
Chemical Constituents from Aconitun recemulosum Effect against TMV
HUANG Lie-jun1,2, GE Yong-hui1, LIU Kai-xing1, ZHANG Jian-xin1, HAO Xiao-jiang1
(1.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002,
China; 2.Center for Research and Development of Fine Chemicals, Guizhou University, Guiyang 550025, China)
Abstract: [Aims] Based on the study on chemical constituents of Aconitun recemulosum and anticacer activity, the
interaction between diterpenoid alkaloids and tobacco mosaic virus(TMV) was studied. [Methods] All compounds
were isolated and purifi ed by many methods, including siliga gel and reversed phase RP-18 column chromatographies,
Sephadex LH-20, and HPLC. And their structures were identified by NMR and EI-MS spectra, and their physical
characters. Using pot-culture method, the effect of diterpenoid alkaloids on invasion and proliferation of TMV disease
was tested. [Results] Six compounds were isolated and identified as circinatum E, fuziline, 14-acetylchasmamine,
chasmamine, 14-acetytalatisamine and hemsleyanine A. The results showed that racemulosine A, sachaconitine,
talatisamine and 14-acetytalatisamine could effectively reduce the infection of TMV; and racemulosine A and talatisamine
had a better inhibition effect on proliferation of TMV. [Conclusions] Six compounds have been isolated from Aconitun
recemulosum for the fi rst time. Compounds thatracemulosine A, 14-acetytalatisamine and talatisamine as newly reported
antiviral compounds could be used to control TMV diseases.
Key words: Aconitun recemulosum; diterpenoid alkaloids; chemical constutuents; tobacco; TMV; invasion; proliferation
毛茛科(Ranunculaceae)乌头属(Aconitum )植物岩乌
头(Aconitum recemulosum Franch),俗名雪上一支蒿,主
要分布于云南、四川、湖北等省区[1]。 现代药理研究证实,
大多数乌头类药材或其炮制的饮片均具有抗炎、免疫抑
制、麻醉止痛、抗肿瘤等作用 [2],但该植物抗烟草花叶病
毒病(tobacco mosaic virus,TMV)的活性没有报道。 本课
题组此前报道了岩乌头中的racemulosine A、racemulosine
B、sachaconitine、14-acetylsachaconitine、hemsleyanine C、
circinasine A和talatisamine等生物碱成分[2-3],现又从该植物
中共分离得到6个化合物,全部为该植物中首次发现的二萜
生物碱类化合物。 本文对先后分离到的13个生物碱进行
了抗TMV活性研究,以期寻找新的抗病毒剂。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
XT-4双目显微熔点测定仪,温度未校正。 旋光由
SEPA-300旋光仪测定。 EI质谱由HP-5973型质谱仪测
定。 红外光谱由Bio-Rad FTS-135红外光谱仪测定。 紫
外光谱由Shimadzu 210双波长紫外分光光度仪测定。
1H、13C NMR和2D NMR图谱在INOVA-400核磁共振仪上
测定,以TMS为内标。 柱层析硅胶(48~75 μm),硅胶H和
薄层层析硅胶(GF254)均为青岛海洋化工厂生产。 反相材
料RP-18(40~63 μm)为Merck公司产品;凝胶为Sephadex
LH-20(25~100 μm)为Amersham Biosciences公司产品
收稿日期:2013-01-13,修返日期:2013-02-06
基金项目:贵州黔西产药用植物岩乌头中生物碱及其生物活性研究(黔科合J字[2009] 2154号)
作者简介:黄烈军(1977—),男,苗族,贵州松桃人,博士,主要从事天然产物与仿生农药研究。 Tel:0851-3804492,E-mail:huangliejun@126.com。
通讯作者:郝小江。 Tel:0851-3804492,E-mail:haoxj@mail.kib.ac.cn。
黄烈军, 葛永辉, 刘开兴, 等. 岩乌头的化学成分及对烟草花叶病毒病的活性[J]. 农药, 2013, 52(4): 295-297.
296 第52卷农 药 AGROCHEMICALS
(Sweden)。 显色剂为改良碘化铋钾溶液,喷洒后直接显色。
岩乌头的干燥根产自贵州省毕节地区,购置于贵阳市
药材市场,并由中科院昆明植物研究所植物化学与西部资
源持续利用国家重点实验室的郝小江研究员鉴定为岩乌
头的根。
1.2 提取与分离及结构鉴定
在前期分离的基础上,采用硅胶柱层析、凝胶柱层
析、RP-18等多种分离手段,进一步分离得到circinatum
E[4](29 mg)、fuziline[5]、14-acetylchasmamine[6](17 mg)、
chasmamine[7](24 mg)、14-acetytalatisamine[8](61 mg)和
hemsleyanine A[9](31 mg)6个化合物,全部为二萜生物碱类
成分,均为该植物首次发现。 结构式见图1。
OCH3)。 化合物与文献[5]报道基本一致。
14-Acetylchasmamine:浅橙色油状物,m/z:493[M]+。
1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:1.06(3H,t,J =7.2 Hz,
NCH2CH3),2.93(1H,s,H-17),3.22(3H,s,1-OCH3),
3.48(3H,s,6-OCH3),3.25(3H,s,16-OCH3),3.30(3H,s,
18-OCH3),2.03(3H,s,14-OCOCH3);13C NMR(CDCl3,
100 MHz),δ:85.0(C-1),25.8(C-2),31.9(C-3),39.0(C-4),
44.5(C-5),82.5(C-6),53.9(C-7),73.5(C-8),46.8(C-9),
44.5(C-10),50.1(C-11),29.6(C-12),44.5(C-13),76.9(C-
14),41.2(C-15),81.6(C-16),61.7(C-17),80.4(C-18),
53.2(C-19),49.2(NCH2CH3),12.8(NCH2CH3),56.1(1-
OCH3),57.6(6-OCH3),56.0(16-OCH3),59.1(18-OCH3),
170.6(14-OCOCH3),21.3(14-OCOCH3)。 化合物与文献[6]
报道基本一致。
Chasmamine:浅橙色油状物,m/z:451[M]+。 1H NMR
(CDCl3,400 MHz) δ:1.05(3H,t,J =7.2 Hz,NCH2CH3),
3.08(1H,s,H-17),3.20(3H,s,1-OCH3),3.30(3H,s,
6-OCH3),3.26(3H,s,16-OCH3),3.26(3H,s,18-OCH3);
13C NMR(CDCl3,100 MHz),δ:85.8(C-1),25.7(C-2),
35.2(C-3),39.2(C-4),48.4(C-5),82.1(C-6),52.3(C-7),
72.4(C-8),50.0(C-9),37.8(C-10),50.0(C-11),28.2(C-
12),45.3(C-13),75.3(C-14),41.2(C-15),81.8(C-16),
62.4(C-17),80.5(C-18),53.7(C-19),49.2(NCH2CH3),
13.5(NCH2CH3),56.3(1-OCH3),57.2(6-OCH3),56.1(16-
OCH3),59.0(18-OCH3)。 化合物与文献[7]报道基本一致。
14-Acetytalatisamine:白色片状结晶(丙酮),m.p.
233~236 ℃。 m/z:463[M]+。 1H NMR(CDCl3,400 MHz) δ:
1.06(3H,t,J=7.2 Hz,NCH2CH3),2.93(1H,s,H-17),3.22(3H,
s,1-OCH3),3.25(3H,s,16-OCH3),3.30(3H,s,18-OCH3),
2.03(3H,s,14-OCOCH3)。 化合物与文献[8]报道基本一致。
Hemsleyanine A:浅橙色油状物,m/z:587[M]+。 1H NMR
(CDCl3,400 MHz) δ:1.04(3H,t,J =7.2 Hz,NCH2CH3),
3.14(1H,s,H-17),3.27(3H,s,1-OCH3),3.30(3H,s,18-
OCH3),3.33(3H,s,16-OCH3),3.86(3H,s,4-OCH3),
5.22(1H,d,J=5.2 Hz,H-14);13C NMR(CDCl3,100 MHz),
δ:83.6(C-1),26.5(C-2),28.3(C-3),41.1(C-4),84.1(C-5),
34.6(C-6),45.7(C-7),73.9(C-8),44.8(C-9),47.5(C-10),
50.5(C-11),36.0(C-12),76.6(C-13),80.7(C-14),41.3(C-
15),83.7(C-16),63.5(C-17),78.7(C-18),55.3(C-19),
49.1(NCH2CH3),13.6(NCH2CH3),56.6(1-OCH3),58.2(16-
OCH3),59.5(18-OCH3),166.9(ArCO),122.5(C-1),131.6(C-
2,6),113.8(C-3,5),163.3(C-4)。 化合物与文献 [9]报
道基本一致。
图1 二萜生物碱类化合物的结构
C i r c i n a t u m E:浅橙色油状物,m /z:4 2 3 [ M ] +。
1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:1.02(3H,t,J =7.2 Hz,
NCH2CH3),3.17(1H,s,H-17),3.26(3H,s,1-OCH3),
3.34(3H,s,18-OCH3),4.31(1H,t,J =5.2 Hz,H-14);
13CNMR(CDCl3,100 MHz) δ:84.0(C-1),25.8(C-2),
28.3(C-3),41.1(C-4),84.9(C-5),34.3(C-6),46.6(C-7),
73.6(C-8),45.1(C-9),39.6(C-10),50.5(C-11),27.7(C-
12),40.8(C-13),75.6(C-14),42.5(C-15),72.5(C-16),
63.9(C-17),78.7(C-18),55.4(C-19),49.2(NCH2CH3),
13.6(NCH2CH3),56.4(1-OCH3),59.5(18-OCH3)。 化合物
与文献[4]报道基本一致。
Fuziline:浅橙色油状物,m/z:453[M]+。 1H NMR(CDCl3,
400 MHz)δ:1.09(3H,t,J =7.2 Hz,NCH2CH3),3.16(1H,
s,H-17),3.33(3H,s,16-OCH3),3.35(3H,s,16-OCH3),
3.45(3H,s,6-OCH3),4.40(1H,d,J =5.2 Hz,H-14);
1 3C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:72.1(C-1),29.4(C-2),
30.0(C-3),38.0(C-4),44.0(C-5),84.2(C-6),48.5(C-7),
78.9(C-8),46.5(C-9),40.5(C-10),49.3(C-11),30.6(C-
12),43.6(C-13),75.8(C-14),78.7(C-15),90.3(C-16),
62.6(C-17),80.7(C-18),56.7(C-19),48.5(NCH2CH3),
13.6(NCH2CH3),57.4(6-OCH3),58.0(16-OCH3),59.5(18-
第4期 297
2 抗烟草花叶病毒病活性研究
烟叶为心叶烟 (N i c o t i a n a g l u t i n o s a )和普通烟
K236(Nicotiana tabacum K326),种子购于贵州省烟草科学
研究所;烟草花叶病毒(TMV)U1普通株系,贵州省烟草
科学研究所提供。 对照药剂:质量分数为2%宁南霉素水
剂(ningnanmycin),购于黑龙江强尔生化技术开发发有
限公司。
活性测试样品为racemulosine A(1)、racemulosine B(2)、
sachaconitine(3)、14-acetylsachaconitine(4)、hemsleyanine
C(5)、circinasine A(6)、talatisamine(7)、circinatum E(8)、
fuziline(9)、14-acetylchasmamine(10)、chasmamine(11)、
14-acetytalatisamine(12)和hemsleyanine A(13)共计13个
化合物。
2.1 二萜生物碱类化合物抗TMV侵染活性
采用盆栽半叶枯斑法,测定化合物质量浓度、岩乌头
总碱和对照药物在质量浓度为30 mg/L时的抗TMV侵染
活性。
选长势一致的心叶烟,将质量浓度为30 mg/L的供试
化合物溶液和宁南霉素水剂分别与TMV汁液按体积分数
50%混合,钝化0.5 h后,磨擦接种于处理右半叶片,TMV汁
液与溶媒体积分数50%混合摩擦接种于左半叶,每处理
3株,重复3次,置光照培养箱培养,3~4 d出斑完全后调查
心叶烟枯斑数,计算枯斑抑制率[10]。
抑制率(%) = 对照枯斑数-处理枯斑数×100
对照枯班数
测试结果(见表1)表明化合物1、3、6、7、11、12的抗
TMV活性均好于阳性对照药剂,部分二萜生物碱具有显
著的抗TMV侵染和治疗效果,其中化合物1、3、7、12对
TMV侵染活性的抑制率均高于60%。
表1 二萜生物碱类化合物抗TMV侵染活性
化合物质量浓度/ 抑制率/ 化合物质量浓度/ 抑制率/
(30 mg·L-1) % (30 mg·L-1) %
粗提物(氯仿) 29.8±3.6 8 -
1 83.9±3.5 9 28.7 ± 4.8
2 41.7±4.6 10 -
3 70.4±3.6 11 -
4 23.6±4.5 12 66.2 ± 3.6
5 56.5±5.5 13 -
6 47.9±4.7 宁南霉素 42.6 ± 3.4
7 81.0±3.6
2.2 二萜生物碱类化合物对TMV增殖的抑制活性
由于病毒在寄主体内增殖的表征为病毒外壳蛋白
(TMV CP)的积累,同时也是病毒在寄主体内移动的标志,
所以我们采用盆栽离体叶圆片法测试化合物在系统寄主
K326普通烟中对TMV增殖的抑制活性,并分别采用双抗夹
心酶联免疫法(DAS-ELESA)检测TMV CP的含量[10],从而
判断化合物对TMV增殖的抑制情况。
采用盆栽离体叶圆片法,测定化合物和对照药物在
质量浓度为20 mg/L时对TMV增殖的抑制情况。 样品对
叶片处理48 d后,通过酶标仪检测叶圆片内外壳蛋的含
量(OD405)的数据(已经扣除空白的OD405值)。 结果(见表2)
表明:用具有抗TMV抑制活性的化合物处理过的叶片内
TMV CP的积累量明显比对照组少,部分化合物可以抑制
TMV的增殖。 其中化合物1、7对TMV增殖的抑制活性高
于阳性对照药,化合物3、5、12对TMV增殖的抑制活性与阳
性对照药剂相当,与抑制TMV侵染的活性结果基本一致。
按公式计算TMV抑制率。
TMV抑制率(%) = 1- 处理的TMV质量浓度 ×100
  阳性对照的TMV质量浓度
表2 化合物1~13的OD405值以及TMV抑制率
化合物质量浓度/    平行检测次数
OD405
抑制率/
(20 mg·L-1) 1 2 3 4 %
1 0.304 0.299 0.312 0.308 0.305 61.7
2 0.677 0.687 0.652 0.646 0.665 16.8
3 0.404 0.397 0.437 0.411 0.412 48.4
4 0.733 0.702 0.712 0.697 0.711 11.1
5 0.398 0.411 0.394 0.401 0.401 49.8
6 0.664 0.632 0.702 0.689 0.671 16.0
7 0.287 0.301 0.299 0.328 0.303 62.0
8 0.854 0.839 0.873 0.884 0.862 -7.8
9 0.732 0.772 0.711 0.689 0.726 9.2
10 0.912 0.867 0.859 0.882 0.88 -10.0
11 0.879 0.856 0.893 0.862 0.872 -9.0
12 0.434 0.412 0.457 0.428 0.432 45.9
13 0.978 0.845 0.856 0.823 0.875 -9.4
空白对照 0.169 0.201 0.178 0.183 0.182
阴性对照 0.311 0.456 0.436 0.465 0.417 47.8
阳性对照 0.83 0.782 0.772 0.811 0.798
3 结论与讨论
通过对岩乌头中二萜生物碱类化合物进行抗TMV
活性筛选,从中发现了racemulosine A、sachaconitine、
circinasine A、talatisamine、8-deacetylyunaconitine和
14-acetytalatisamine的抗TMV活性均好于阳性对照药。 其
中部分二萜生物碱类化合物具有显著的抗TMV侵染活性,
特别是化合物racemulosine A、sachaconitine、talatisamine和
14-acetytalatisamine的活性尤其显著,对TMV侵染活性的
抑制率在60%以上;化合物racemulosine A和talatisamine对
TMV增殖的抑制活性明显比阳性对照药好。 表明此类化
合物具有被开发为新型的天然抗病毒剂的潜力。
参考文献:
[1] 中国植物志编辑委员会. 中国植物志[M]. 北京: 科学出版社,
1979, 27: 232.
[2] 葛永辉, 穆淑珍, 张建新, 等. 岩乌头根部的生物碱类成分及其
抗PAF活性[J]. 2009, 34(15): 1935-1937.
黄烈军,等:岩乌头的化学成分及对烟草花叶病毒病的活性
(下转第311页)
第4期 311
按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行
测定。
3.5 计算
将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中
螺虫乙酯峰面积分别进行平均。 试样中螺虫乙酯的残留
量R(mg/kg),按式(2)计算。
R = FA
·mSt·CF
FSt·mA
(2)
式中:F St为标样溶液中螺虫乙酯峰面积的平均值,F A
为试样溶液中螺虫乙酯峰面积的平均值,m St为标样的质
量(g),m A为试样的质量(g),C F为标样中螺虫乙酯的质量分
数(%)。
4 螺虫乙酯的残留分析方法2
试样用乙腈提取、分散固相萃取净化,采用高效液相色
谱串联质谱法测定烟草中螺虫乙酯的残留量[4]。
4.1 仪器和试剂
仪器:Agilent 1200高效液相色谱仪;API4000三重四
极杆串联质谱仪、Analyst1.4.2数据采集处理系统(美国应
用生物系统公司)。
试剂:甲醇(色谱纯);乙腈(色谱纯);氯化钠(分析纯);
无水硫酸镁(分析纯);PSA吸附剂;螺虫乙酯标样,已知质
量分数(购自美国Sigma公司)。
4.2 色谱条件
色谱柱:Waters Atlantis dC18,150 mm×2.1 mm(i.d.不
锈钢柱),3 μm;柱温:25 ℃;流速:0.2 mL/min;进样量:
10 μL;流动相A:水;流动相B:乙腈;流动相洗脱梯度:
5%B(体积分数)于1 min内线性升至95%,于9 min内线性
降至70%,于2 min内降至5% B并保持6 min。
在上述色谱操作条件下,螺虫乙酯的保留时间约为
3.1 min。
4.3 质谱条件
离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正离子扫描;
监测模式:多反应监测;电喷雾电压:5 500 V;雾化气压力:
0.413 MPa;辅助加热气压力:0.345 MPa;驻留时间:50 ms;
离子源温度:500 ℃。
4.4 测定方法
准确称取2.0 g烟末,置于50 mL离心管,加入10 mL水
静置10 min,加入10 mL乙腈,超声1 min,依次1 g氯化钠
4 g无水硫酸镁,再超声2 min,于4 000 r/min离心10 min后,
静置1 min。 移取上清液1 mL于1.5 mL离心管中,加入
150 mg无水硫酸镁和25 mg PSA,超声2 min,于6 000 r/min
离心2 min,取上清液200 μL并用流动相稀释至1 mL,经
0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC-MS/MS分析。
4.5 标准曲线的建立
采用空白样品提取液配制一系列质量浓度标准溶液,
进样量为10 μL,进行HPLC-MS/MS分析,采用外标法定量,
螺虫乙酯的峰面积为纵坐标(y),其相应质量浓度为横坐标
(x,μg/L)进行线性回归分析,得线性方程为y=2.76e4x+2.97e4,
其相关系数为0.999 8。 在线性范围内,最低检出量质量浓度
1~100 μg/L,检出限为0.008 mg/kg。
5 小结
目前关于螺虫乙酯的原药、制剂和残留物分析方法,
国内外尚未有统一的标准。 采用高相液相色谱法对螺虫
乙酯的有效成分进行分析,具有简便、快捷、准确等特点,
在重复性、精密度等方面取得较为理想的效果,为以后的
标准制定提供一些参考依据。
参考文献:
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责任编辑:赵平
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张孟迪,等:螺虫乙酯分析方法述评