全 文 ：基金项目：“十二五”国家科技支撑项目（编号：２０１２ＢＡＤ２３Ｂ０３）
作者简介：殷凯（１９８７－），男，中南林业科技大学在读硕士研究生。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｆａｎｔａｓｙｋｓｋｙ＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ
通讯作者：李湘洲
收稿日期：２０１３－０９－１８
第２９卷第６期
２　０　１　３年１　１月
ＯＯＤ＆ＭＡＣＨＩＮＥＲＹ
食 品 与 机 械
Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２　０　１　３
１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－５７８８．２０１３．０６．０４４
长沙青皮竹多糖脱蛋白质方法研究
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｆｒｏｍ
Ｂａｍ　ｂ　ｕｓａ　ｔｅｘｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．ｐｅｒｓｉｓｔｅｎ　ｓ．Ｂ．Ｍ．Ｙａｎｇ　ｌｅａｖｅｓ
殷　凯
ＹＩＮ　Ｋａｉ
　
李湘洲
ＬＩ　Ｘｉａｎｇ－ｚｈｏｕ
　
张　胜
ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｅｎｇ
　
王乙庚
ＷＡＮＧ　Ｙｉ－ｇｅｎｇ
（中南林业科技大学材料科学与工程学院，湖南 长沙　４１０００４）
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ　４１０００４，Ｃｈｉａｎ）
摘要：研究长沙青皮竹多糖中蛋白质的脱除方法。采用聚酰
胺吸附法对长沙青皮竹多糖中的蛋白质进行脱除，并与
Ｓｅｖａｇ法、三氯乙酸法进行比较。结果表明：聚酰胺吸附法、
Ｓｅｖａｇ法、三氯乙酸法脱蛋白质率分别为５７．７７％，３０．４２％，
４９．５３％；多糖损失率分别为３０．８６％，２１．３３％，４７．４３％。说
明聚酰胺吸附法脱除长沙青皮竹多糖中的蛋白质有较好的
效果，是一种值得推广的方法。
关键词：长沙青皮竹；多糖；脱蛋白质；聚酰胺吸附法
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｆｒｏｍ　Ｂａｍｂｕｓａ
ｔｅｘｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｓ．Ｂ．Ｍ．Ｙａｎｇ　ｌｅａｖｅｓ（ＰＢＬ）ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ
ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｒｅｍｏｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ＰＢＬ，
ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｅｖａｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｄｅｐｒｏｔｅｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｆｏｒ　ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｍｅｔｈ－
ｏｄ，ｓｅｖａｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｅｒｅ　５７．７７％，
３０．４２％，４９．５３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｏｓｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ｗｅｒｅ　３０．８６％，２１．３３％，４７．４３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈｅ　ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｏｎｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂａｍｂｕｓａ　ｔｅｘｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｓ．Ｂ．Ｍ．Ｙａｎｇ；ｐｏｌｙｓａｃ－
ｃｈａｒｉｄｅ；ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ；ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ
长沙青皮竹 （Ｂａｍ　ｂｕｓａ　ｔｅｘｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｓ．Ｂ．Ｍ．
Ｙａｎｇ）为湖南省优良观赏竹种［１］，原产地为湖南长沙。竹叶
中含有多种对人体有益的活性物质，如黄酮、多糖、氨基酸和
微量元素［２－４］。竹叶黄酮的生物活性和提取分离已经有众
多学者进行了研究报道［５－７］，竹叶多糖由于有增强机体免疫
及抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、降血糖和保护肝脏等作用，近年
来也受到越来越多的关注。
研究多糖的生理活性，首先要获得纯度较高并具有天然
活性的多糖［８］。然而，提取的多糖中通常会含有蛋白质，影
响多糖的纯度，并使其药理研究出现较大偏差［９］。在多糖的
结构鉴定、活性成分等研究环节往往需要较大量的粗多糖脱
除蛋白质操作，粗多糖中脱除蛋白质的方法主要有Ｓｅｖａｇ试
剂法［１０］、三氯乙酸法［１１］、生物酶法［１２］、大孔树脂法［１３］以及聚
酰胺吸附法［１４］等，其中最常用的是Ｓｅｖａｇ试剂法和三氯乙酸
法。生物酶法多采用蛋白质酶降解多糖中的蛋白质，但酶自
身亦是蛋白质，可能在脱除蛋白质的同时又混入新的杂质。
方积年等［１５］反对用大孔树脂，认为其适合分离小分子物质，
如果分离纯化多糖易使多糖活性降低。
聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，它对酚
类、醌类及黄酮类等富含酚羟基的化合物具有较强的吸附性
能［１６－１８］，聚酰胺理化性质稳定，吸附选择性独特，使用周期
长，操作方便，不产生二次污染性质，是一种友好型的分离方
法。但总体而言，该方法应用在多糖纯化方面的报道还较
少。在脱除多糖中游离蛋白质方面，孟利等［１４］曾用聚酰胺
吸附法去除西藏灵菇胞外多糖发酵液中的蛋白质，脱除率为
８１．５９％，总糖回收率达到８７．７５％；张民［１９］采用聚酰胺吸附
法去除枸杞多糖中的蛋白质，蛋白质的含量下降到４．７％，枸
杞多糖的回收率为９８．７％。但是聚酰胺吸附法应用于竹叶
多糖的纯化，尚未见公开报道。
本试验以长沙青皮竹为研究对象，分别采用聚酰胺吸附
法、三氯乙酸法、Ｓｅｖａｇ试剂法去除长沙青皮竹叶多糖中的蛋
白质，以脱蛋白质过程中多糖损失率和蛋白质去除率作为衡
量脱蛋白质效果的考察指标，为竹叶多糖的分离纯化寻求适
宜的蛋白质脱除方法。
６７１
１　材料与方法
１．１　材料与仪器
１．１．１　试验材料
长沙青皮竹竹叶：２０１２年１０月采集于中南林业科技大
学竹园，经该校林学院陈建华教授鉴定为长沙青皮竹
（Ｂａｍ　ｂｕｓａ　ｔｅｘｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｓ．Ｂ．Ｍ．Ｙａｎｇ）。竹叶自然
风干后，用万能粉碎机粉碎，过２０目筛，经乙醇回流脱脂、热
水提取、醇沉离心、冷冻干燥即得青皮竹竹叶多糖。准确称
取适量竹叶多糖，用去离子水溶解，过滤除去不溶物，配制成
５．０ｍｇ／ｍＬ多糖溶液备用。
１．１．２　仪器
冷冻干燥机：ＬＧＪ－１０型，北京松源华兴科技发展有限
公司；
台式高速离心机：ＴＧ１６－ＷＳ型，长沙平凡仪器仪表有限
公司；
可见分光光度计：７２１Ｎ 型，上海精密科学仪器有限
公司。
１．１．３　主要试剂
聚酰胺：柱层析用８０～１００目，浙江省台州市路桥四甲
生化塑料厂；
考马斯亮蓝Ｇ－２５０：上海西塘生物科技有限公司；
其它试剂：均为市售分析纯。
１．２　试验方法
１．２．１　Ｓｅｖａｇ试剂法脱蛋白质　取３支试管，分别加入
４ｍＬ粗多糖溶液，各滴加１ｍＬ　Ｓｅｖａｇ试剂（氯仿∶正丁醇
＝４∶１），恒 温 （３５ ℃）振 荡 ３０ ｍｉｎ，４　０００ｒ／ｍｉｎ 离 心
１５ｍｉｎ，取上清液，再滴加１ｍＬ　Ｓｅｖａｇ试剂，振荡离心，重复
操作４次，直至有机相与水相界面处不再出现白色胶状物，
测定上清液中蛋白质及多糖的含量。
１．２．２　三氯乙酸法脱蛋白质　取３支试管，分别加入４ｍＬ
多糖溶液，各滴加４ｍＬ　３％三氯乙酸溶液，摇匀，于４℃冰箱
中静置１２ｈ，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液，测定其蛋
白质及多糖的含量。
１．２．３　聚酰胺吸附法脱蛋白质　聚酰胺去除杂质后，准确
称取１０．０ｇ，上柱压实平整。将２５ｍＬ多糖溶液经过恒流泵
注入柱床，静置１２ｈ后，用５倍体积的去离子水洗脱，收集洗
脱液，旋转蒸发浓缩至２５ｍＬ，分别测定浓缩液中的蛋白质
与多糖含量。同时考察５．０，７．５，１２．５，１５．０ｇ聚酰胺对多糖
中蛋白质的清除情况，平行试验３次。
１．３　测定方法
１．３．１　多糖含量的测定　采用苯酚－硫酸法［２０］。在体积
一致的前提下，多糖损失率计算公式见式（１）。
Ｒ１ ＝ １－
ｃ１
ｃ０（ ）×１００％ （１）
式中：
Ｒ１——— 多糖损失率，％；
ｃ０——— 脱蛋白质前溶液中多糖含量，ｍｇ／ｍＬ；
ｃ１——— 脱蛋白质后溶液中多糖含量，ｍｇ／ｍＬ。
１．３．２　 蛋白质含量的测定 　 采用考马斯亮蓝法［２１］。在体
积一致的前提下，蛋白质脱除率计算公式见式（２）。
Ｒ２ ＝ （１－
ｄ１
ｄ０
）×１００％ （２）
式中：
Ｒ２——— 蛋白质脱除率，％；
ｄ０——— 脱蛋白质前溶液中蛋白质含量，ｍｇ／ｍＬ；
ｄ１——— 脱蛋白质后溶液中蛋白质含量，ｍｇ／ｍＬ。
２　结果与分析
２．１　聚酰胺用量对脱蛋白质效果的影响
聚酰胺不同用量脱蛋白质效果的比较见表１。由表１可
知：聚酰胺的用量对于脱除竹叶粗多糖中蛋白质的效果影响
显著。随着聚酰胺用量的增加，洗脱液中所含的蛋白质不断
降低，表明聚酰胺吸附蛋白质的量呈增大趋势；但在吸附蛋
白质的过程中，多糖损失率也呈增大趋势。当聚酰胺用量超
过１０．０ｇ以后，蛋白质脱除率的效果趋于平衡，而多糖损失
率增加明显。因此聚酰胺用量控制在１０．０ｇ为宜。由此也
可推导出０．５ｍｇ／ｍＬ的多糖液与聚酰胺用量的最佳比例是
２５ｍＬ∶１０．０ｇ，即液固比为２．５∶１（Ｖ∶ｍ）。
表１　不同质量聚酰胺脱蛋白质效果的比较
Ｔａｂｌｅ　１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ　ａｂｏｕｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（ｎ＝３）
聚酰胺用量／ｇ 蛋白质脱除率／％ 多糖损失率／％
５．０　 ４９．６８　 ２２．８６
７．５　 ５３．４０　 ２６．８６
１０．０　 ５７．７７　 ３０．８６
１２．５　 ５９．３４　 ３３．７１
１５．０　 ６０．９９　 ３７．９０
２．２　３种方法脱除蛋白质效果的比较
以２．１获得的最佳聚酰胺用量，对青皮竹粗多糖进行蛋
白质脱除，３种脱蛋白质方法的效果比较见表２。由表２可
知：从多糖损失率的角度而言，３种方法中三氯乙酸法处理后
多糖损失率最大，Ｓｅｖａｇ试剂法多糖损失率最小。而从蛋白质
表２　３种脱蛋白质方法的效果比较
Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄｓ（ｎ＝３）
方法 蛋白质脱除率／％ 多糖损失率／％
Ｓｅｖａｇ试剂法 ３０．４２　 ２１．３３
三氯乙酸法 ４９．５３　 ４７．４３
酰聚酰胺吸附法 ５７．７７　 ３０．８６
７７１
提取与活性 　 ２０１３年第６期
脱除效果考察，则三者蛋白质脱除率依次为聚酰胺吸附法＞
三氯乙酸法＞Ｓｅｖａｇ试剂法。
３　讨论与结论
聚酰胺是一种吸附型色谱，它可以根据物质中所含的氨
基、羟基、氢键与共轭双键的多少对物质进行吸附。一方面，
由于蛋白质分子中富含氨基和氢键，因此蛋白质分子可以被
聚酰胺吸附，并且去离子水不能将其从聚酰胺色谱柱上洗脱
下来［１４］；另一方面，虽然多糖是一种多羟基结构的物质，但
多糖易于形成分子内氢键导致它与聚酰胺形成氢键的能力
减弱［１９］。因此，蛋白质吸附在聚酰胺色谱柱上，而多糖则被
去离子水洗脱下来，从而达到将多糖与蛋白质分离的目的。
在以往多糖的分离纯化过程中多采用Ｓｅｖａｇ法脱蛋白，
但Ｓｅｖａｇ法往往要重复多次才能达到脱除蛋白质的目的，且
操作所使用的有机溶剂为氯仿、正丁醇等，对操作人员的安
全有一定影响，而且萃取蛋白后的有机试剂无法完全回收使
用，客观上对环境也会产生一定的污染。三氯乙酸酸性较
强，在使蛋白质变性的同时也易使多糖结构发生变化［２２］，如
果在此工艺下继续纯化多糖，还需对多糖溶液进行中和，也
会对多糖的鉴定造成局部影响。
而聚酰胺法在设定的条件下，一次脱除蛋白的效果就优
于Ｓｅｖａｇ试剂法和三氯乙酸法，并且聚酰胺可循环使用。同
时，使用去离子水作为溶剂，对比其他方法使用有机溶剂或
者酸性较强的溶剂而言，对操作人员和环境均无负面影响。
因此聚酰胺脱蛋白质是一种值得推广的方法。
本研究结果还发现，聚酰胺在脱除蛋白的同时，对长沙
青皮竹多糖也有一定的影响，损失率为３０．８６％，且损失率随
着聚酰胺用量的增加而增加，较文献［１４］、［１９］报道的西藏
灵菇胞外多糖、枸杞多糖损失率都要高。推测长沙青皮竹多
糖中应有部分多糖在结构上缀有蛋白，导致聚酰胺对这部份
多糖也有吸附作用，这一现象为今后开展长沙青皮竹多糖的
结构鉴定提供了一些研究思路，相关研究结果将另文报道。
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第２９卷第６期 殷　凯等：长沙青皮竹多糖脱蛋白质方法研究