全 文 ：第 4 卷
以刃 5年
第 5期
9 月
中山大学学报 ( 自然科学版 )
AC A TSC I E N A RUMn N A T LJRA I LUM UN WE RS l f
,
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基于 。 p D N A t rn L 一F 序列数据分析海南陆均松
种群的冰期后扩张 `
苏应娟 , , 王 艇 , , 陈国培 , , 2 , 孙宇飞 ’ , 江 宇 , , 邓 锋` , 王伯荪 ,
( 1
. 中山大学生命科学学院 , 广东 广州 51 02 75
2
. 中国科学院武汉植物园 , 湖北 武汉 43 0 74 )
摘 要 : 针对热带树种陆均松 acD ixdr um p~ i d
。 巨ulse fen l、 分布在海南的 12 个天然种群进行取样 , 测定了叶绿
体 DN A ( c四NA ) tnr L F 非编码区序列 。 序列长度介于 86 8 一 876 帅 , 显示出长度多态性 。 碱基组成 A + r 含量较
高 , 百分比值为 研 . 17 % 一 醉 . 95 % 。 通过统计简约算法共鉴定出 so 个单倍型 。 根据种群间分化度 F二 ( 二 0 . 0 ) 、
基因流 助凡 (介于 1 . 92 一 2 . 50) 、 AMvo A ( 24 . 17 % 的遗传变异发生在种群间 , 尸 > 0 . 05 ) 以及邻接树中单倍型的分
支式样 , 发现海南的陆均松种群尚未发生遗传分化 。 另一方面 , 依统计简约算法构建的单倍型网图具 “ 星状 ”
特征 , 而且邻接树中多数单倍型合并于树的顶端。 这些基因谱系结果提示海南陆均松种群在近期历史上发生过
种群扩张 。 ajT ilna 的 D 检验和错配分析结果也支持这种推测 。 结合地质和古袍粉学证据 , 认为残存于 “ 避难所 ”
的陆均松种群在全新世时 , 伴随全球气候转暖 , 在海南岛内可能实行了扩张 。
关键词 : 陆均松 acD咧um 娜~ 1 de l月 u l犯nfe ls ; 。 pND A t I’n l , F非编码序列 ; 单倍型 ; 遗传分化 ; 种群扩张
中图分类号 : q抖9 .砧 ` 2 文献标识码 : A 文章编号 : 05 29 一 65 79 (那 ) 02 一 07 0 一。
陆均松 D ac 叫 iu m iP e er i de h u be fen ls 是一种常
绿乔木 , 高可达 30 余 m , 在分类上被归人罗汉松
科陆均松属 aD c州 ium oS lan de : e x G . oF 、 etr 。 陆均
松属包括 21 种植物 , 而陆均松是该属分布于我国
的惟一代表川 。 陆均松在我国的现代分布区很 狭
窄 , 仅见于海南省中部以南山区 , 例如 , 尖峰岭 、
吊罗山 、 五指山及霸王岭等水湿条件优越的山地雨
林 , 并组成较优势植物种类成份 。 然而 , 古抱粉学
资料显示 , 历史上在第三纪晚期 (距今 2 万 一 4 万
a 前 ) 陆均松曾分布到我国南方北纬 2 20 一 24 “附近 ,
比其现代分布北界要高出 3 一 5 个纬度 ; 直至 1 . 5
万年前 , 由于晚大理盛冰期气候变冷和全球低海面
所造成的古环境变化才导致陆均松 退 出华南大
陆川 。 因此 , 陆均松是研 究海南植物系统发育地
理 、 热带林起源及区系组成的重要材料 。 可是 , 由
于过去 20 多 a 的过度砍伐 , 其天然资源备受破坏 ,
现已被列为国家三级保护珍稀濒危植物 。
研究濒危物种种群的遗传结构和地理分化不仅
有助于更加深人地了解种群的形成 、 分布和扩散途
径 , 而且可 以追溯历史事件对种群进化产生的影
响川 。 近年来 , 基因谱系 ( ge en ge ealn o gy ) 和合并理论 ( 。喇 e sc en ce het oyr ) 的联合运用为在分子水平
上探讨种群的遗传变异和分化进一步开辟出新的途
径风 5 1。 叶绿体 DNA ( C p D NA ) 非编码区序列 已被
经常用于分析植物种内系统发育 、 种群遗传结构及
系统发育地理学问题 。
本研究以陆均松现存于海南的天然种群为材
料 , 通过对 。 pDN A tm L F非编码 区序列数据进行
核昔酸 多样性 、 中性 检验 和错配分布 (而~ ct h
id st ibr ut io n) 以及系统发育地理分析 , 研究了陆均松
海南种群的遗传结构和近期历史 上可能发生的事
件 。
1 材料和方法
1
.
1 植物材料
样本分别采 自海南大 吊罗海拔 9 6() m 种群
( DD )
, 吊罗后 山海拔 9 3 8 m 种群 ( L HA ) 、 海拔
l X( Xl m种群 ( LH B ) 及海拔 1 0 80 m 种群 ( LH C ) ,
白水岭海拔 6 or m 种群 ( B SA ) 、 海拔 626 m 种群
( B SB ) 及海拔 9 8 0 m 种群 ( BS C ) , 和生长于霸王
岭东四分水岭山脊海拔 1 (X找) m 处 的种群 (玲 ) 、
老点小路海拔 1 050 m 处种群 ( DL ) 、 东三山脊海
拔 1 l o m 处种群 ( 55) 、 东三 旧公路海拔 1 《XX〕 m
处种群 ( GS ) 及东四伐区路边海拔 1 以X) m 处种群
( rQ )
。 采集的叶片材料立 即用硅胶干燥 , 运至实
验室后 一 20 ℃保存 。
, 收稿日期 : 2X( 只 一 1 1一 16
基金项目 : 国家自然科学基金资助项 目 ( 30 170789 , 302 70 15 3 ;) 中国科学院 “ 百人计划 ” 项 目 (05 05 2叨3
作者简介 : 苏应娟 (l 965 年生 ) , 女 , 副教授 ; 通讯联系人 : 王艇 ; E一耐 1: int g w an g @ hw gc as . 。 n
第 5 期 苏应娟等 : 基于 。 pD A Nt L o F序列数据分析海南陆均松种群的冰期后扩一张
1
.
2 实验方法
1
.
2
.
1D A N提取与 P CR 扩增反应 采用改进的十
六烷基三 甲基 澳化胺 ( c TA ) B法困 。 每 10 拌L
P CR 反应体积中包括 : 5 0 o ml / L K CI
; 0 1 m
ol/ L
Ti r
s一 HI C; 1
.
5 m
ol/ L M薛犯 ; 0 . 1 %Ti rl on X一 l () X;
d TPN各 20 脚n ol /L ;模板用量为 50 ng ;2 , o 单位
aqT
DNA 聚合酶 ; 引物各 40 p m ol 。 扩增 叩DN A
ntr L F 非编码区引物采用 r l址屺d et 等的设计川 , 引
物 C : 5 ’ 一C C AA ACT GC TAG AC G CAT C G 一 3 ’ , 引物 f :
5’ 一 A T r r GA A C r ( ;G r GA C AC (; AG 一3’ 。 引物由上海博亚
生物技术有限公司合成 。 CP R 反应程序为 : 94 ℃
预变性 3 m i n ; 94 ℃ 4 5 5 , 5 5 ℃ 6() s , 7 2 ℃ 9() S ,
30 个循环 ; 末次循环 72 ℃延伸 7 而 n 。 PC R 产物经
琼脂糖凝胶电泳检测相对分子质量
1
.
2
.
2 CP R 扩增产物直接测序 取 cP R 产物 5 拌L
测序 , 测序引物与 CP R 反应引物相同 。
1
.
2
.
3 低熔点琼脂糖 回收 CP R 产物与 克隆测序
w 二 1 . 0% 琼脂糖凝胶 1 x TAE 电泳 Z h (电压为 5
V/
c m )
, 切下 目的片段 , 用 -NU IQ一 or 柱式 DN A 胶回
收试剂盒回收 PCR 产物 。 回收所得 CP R 产物采用
pM 1D 8
一
T V ce lor 试剂盒连接 , 转化导人由大肠杆菌
D H
一
a5 所制的感受态细胞中 , 采用蓝 白斑筛选法获
得克隆 。 使用 CP R 法确认 T 载体中插人片段的大
小 , 鉴定 阳性 克隆 。 用阳性克隆提取质粒做模板 ,
应用 p M D 18 一 T V ce t ( )r 两端通用引物 M 13 F 和 M 13 n
在 ABI 3 7 自动测序仪上测序 。
1
.
3 数据分析
测定的 t o L 一 F 非编码区单倍型序列 eG nB an k 登
录号 为 AY 5 347 68 一 A5Y 34 7 97 。 序 列 比 对 使 用
e一u s以 x 软件 〔g ]完成 。 按照 obJ li n g 等 [ , 〕的方法计算
单倍型 多样性 ( h) 与核昔酸多样性 ( D 、 ) 。 根据
ajT ilan
仁’ 。〕的方法进行中性检验 。 错配分布检测采用
oR罗。 和 H a l l犯 n di n g [” 丁的方法 。 利用几 lmP e ot 。 等〔” ]
的统计简约算法 ( s tiat st ic al p a sr iom ny alg o ir thm ) 构
建网图 。 使用 PHY l p 软件包间 计算单倍型 间的
愉
~ 双参数遗传距离
, 并进行邻接法 ( Ne i ghbo 卜
ioj in gn M
e ht od ) 分析 。 通过 Bot s tm p 法检验重建分
支的可信度 。 邻接法分析时选取 日本黑松 iP n us
ht 叭 be 咭“ Palr . 作为外类群 。 种群内和种群间的基
因流用每代雌性个体迁移数 (戈 ) 估计 , 该值可由
公式 凡 : 二 1 ( 1 十 2弋 )求出 ,其中 N 是有效种群大
小雌性数目 、 m 是雌性迁移率 〔’ 4〕。 选用 A lr eq ul 。 软
件 〔` 5〕进行分子方差分析 (MA o vA ) , 计算种群内 、
种群间及不同地区间种群的变异方差分布 。
2 实验结果
2
.
1 单倍型多样性与核昔酸多样性
陆均松 叩D NA : m L F 非编码区序列长度介于
86 8
一 87 6 bP 之间 , 显示 出长度多态性 ; 发生在位
点 1 12 一 1 19 的插人导致 BS 0A 1 和 SG习2 的序列加
长 。 碱基组成 A + T 含量较 高 , 其百分 比介于
64
.
17 %
一
64
.
95 % 之间 , 许多非编码区和假基因序
列都具此性质 。 通过统计简约算法共鉴定出 30 个
c四NA mt L F 单倍型 。
陆均松 cP D NA to L 一 F 非编码区序列的单倍型
多样性 ( h) 与核昔酸多样性 (马 ) 见表 1。 陆均松
具高水平单倍型多样性 ( h 二 0 . 8 21 ) 。 各种群的单
倍型多样性也较高 ( h 值介于 0 . 545 一 O , 9的 ) , 其
中邓 种群的单倍型多样性最低 , B SB 和 1丑B 种群
单倍型多样性最高 。 陆均松整个种的核昔酸多样性
(氏 二 0 . 0 2 52 ) 水平较低 。 各种群的 D ij 取值介于
0
. 《XX〕 7 0 ~ 0 .田 5 34 , 其中 SF 种群的核昔酸多样性
最低 , SG 种群核昔酸多样性最高 。
2
.
2 中性检验和错配分布
利用 ajT im a D 检验所得负值 ( 一 2 . 62 2 02 ) 和
零有极显著性差异 ( 尸 < 0 . 0 1 ) , 这说明同零假设
(分子进化呈中性 、 种群处于平衡状态 ) 的预期相
比 , 稀有等位基因过量 。
另外 , 陆均松 c p DN A t。 卜 F 非编码区序列的
错配分布和基于突然 扩 张模型 ( su d en ex pan iso n
m do el) 预期的结果非常匹配 (图 1 ) 。 参差指数
( m韶e ,ln es s in de x ) 较低 , 并且和预期值没有显著差
异 ( R = 0 . 0 2 2 , P = 0 . 0 89 9 ) 。
2
.
3 叶绿体 DN A 单倍型的系统发育
图 2 是利用统计简约算法由陆均松 :m L F 非编
码区单倍型构建出的网图 。 单倍型的分支式样呈现
“ 星状 ” 结构 。 单倍型 15 0 1被鉴定为祖先型 , 它在
种群 玲 、 山 、 s 、 sG 、 玲 、 L HA 及 LH C 中均有出
现 。 绝大多数单倍型仅以 1至 4 步突变与处在中心
位置的 只刃 1 合并 ; 只有单倍型 BS0A 1 和 SG习2 例
外 , 它们通过较长步长与 F印 1合并 , 在位置上显
得孤立 。 此外 , 没有种群共有衍生型单倍型 。
以日本黑松 iP n us ht u nbe 替 1 p alr . 为外类群对陆
均松近缘种鸡毛松 凡凌丫。 , 。 耐~ us BI . 、 百 日青 oP故屺 a切 us en ir如 lius D . D o n 、 罗汉松 只划玩呷。
~ 呷梅儿 us (仆 u bn
.
) D
.
D o n 和所有陆均松 :。 L F
非编码区单倍型进行邻接法分析发现 , 陆均松单倍
型序列组成一单系群并获 B o st tm p 值为 9 % 的有
力支持 (图 3) 。 除 B sA 03 , S印 1 及 LH C0 1 外 , 多
数单倍型在树的顶端附近合并 。 没有一个来自同一
种群的全部单倍型能组成单系群 。 对应于不同地点
的分支混合分布 , 显示其间存在有效基因流 。
中山大学学报 ( 自然科学版 ) 第 4 卷
表 1 陆均松 叩DN A tm L一 F 非编码区序列的单倍型多样性 ( h) 和核普酸多样性 (几 )
1、 I〕 . 1 H a jP o ty洋 山 v e sr it y ( h ) adn
n u e lcot ide id vesr
i ty ( D。 ) of c pD NA ntr .l F no cn 司 i n g se qU e cnes of D
· 尸交脱￡
82154姗9卿713812or0
种群
D
.
P
~
i
地理位置 样本大小 单倍型多样性 核昔酸多样性
1(刃。 13 ` E 18 o 25 ` N
1(刃 0 14 , E I S O 26 , N
1田 0 52 , E 18o4 1` N
l住护52 , E 1 8o4 1` N
1(刃。 52 ` E 180 4 1 ’ N
l的 0 15 ` E 18 0 28 ` N
l伪 0 16 , E 1 8O2 7 ’ N
l伪。 54 , E 18o 4 , N
l毋 , 14 , E 180 22 , N
l田心 51 ’ E 18 04 3 , N
l仪笋51 ` E】8 043 ` N
1《刃。 51 ` E 1 8o4 3` N
0
.以犯52 土 0 .仪刃24
0
.仪刃70 士 0 .佣舰 2
0
.田创乃 士 0 .佣以3
0
. 《X )287 土 0 . J X娜1
0
.仪犯 , 9 土 0 .仪刃 37
0
.
0 105 士 0
.以刃 35
0
.
X() 14() 士 0
.《义洲) 35
0
.田 534 士 0 . X(j 1 12
0
.
0 105
士 0 . OJ犯 3
0
.仪沦科 士 0 . (汉X抖 3
0
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0 105 士 0
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P a i r店 , is e d if巍 re n e e s
图 1 陆均松种群 。 , D NA to L F
非编码区序列的错配分布
凡 9 . 1 肠 asm htC 山 s itr b u t io n ac 脱 s 即 p己a rio愁 of
D
.
p ic砚 1 1拍助 , 1 on c四N A nt : L F on lc 记 in g eS qj j e n c e s
2
.
4 种群遗传分化
从 DN A 歧义 度的角度分析 , 陆均 松种群间
叩ND A mt L F 非编码区序列的核昔酸差异平均数和
每位点核昔酸替换平均数分别介于 0 . 83 一 5 , 03 3
和 0 . 《X刃 % 一 0 .以只 5 ;4 种群玲 同种群 BS C 、 DD 及
LHA 之间的歧义度最小 , 而种群 SG 和 LHB 之间的
歧义度最大 。
根据陆均松 C p DNA 如 -L F 非编码区序列变异
估算出的种群间分化度 F 二取值为 0 . 0 、 基 因流
弋 值介于 1 . 92 一 2 . 50 , 而且种群间的 Nm 值和地
理距离之间不存在显著相关性 ( r 二 0 . 06 , 尸 二
0
.
7 8 )
。 基于 mt L F 非编码区序列变异的 AM O vA
分析表明 , 陆均松大部分 ( 75 . 83 % ) 遗传变异发
生在种群内 , 只有 24 . 17 % 的遗传变异发生在种群
图 2 利用统计简约算法构建的陆均
松 枷 L F 非编码区单倍型网图
iF g
.
2 N
e l明 rk elr 如gn 11叩lo ylt 鹅 of e PDNA to L F 朋” e 峨汕gn
er ig on
s in D
. 姿滩己能泣场灿 st ie al l犯sr imo yn al 即 ir t llm
I’ed ( P > 0 . 0 5 ) 。
3 讨 论
检测陆均松的种群遗传结构发现 , 其分布于海
南的种群间还未发生分化 。 这种推论得到种群间分
化度 F * 基因流 戈 及 MA OV A 数据的支持 。 邻接树
的分支式样也显示种群间存在明显基因流 。 依统计
简约算法求得的网图显示 : 单倍型 万5 0 1属祖先型 ;
在所研究的 12 个种群中 , 它为 砖 、 DL 、 S 、 SG 、
印 、 IJ 队 及 LH C 等 7 个种群共有 。 但除此祖先型
单倍型外 , 陆均松种群不再共有衍生型单倍型 , 说
明所共有的祖先型单倍型可能代表的正是各种群来
第 5期 苏应娟等: 基于 c四NA 如L F 序列数据分析海南陆均松种群的冰期后扩张
源相同的组成部分仁’ 6 ] 。 这些结果反映陆均松海南
各种群之间有着密切的遗传联系 , 种群遗传分化程
度低 。 陆均松不仅拥有远交繁育系统 〔’ 〕 , 而且还具
有长距离传递基因流的潜力 ; 它的花粉在海南山地
雨林表土中普遍存在 , 是山地雨林中含量最高的花
粉种类之一比 ` 7了。 这些生物学特性可能是导致其种
群分化程度低的重要原因叫 。
陆均松的海南种群中检测到高水平单倍型多样
性 ( h = 0 . 82 1) 和低水平核昔酸多样性 (马 二 0 . 0
25 2)
。 这是种群经由较小的有效种群大小发生过快
速扩张的 “ 标识 ” [’ 9】。 陆均松 tm L F 单倍型的系统
发育地理式样具 “ 星状 ” 特征 , 即其他单倍型大多
以较短的枝长同中央单倍型合并 (图 2 ) 。 这种相
对简单的式样表示 , 种群在遇到适宜的气候环境条
件时曾经发生过扩张 ; 扩弓长后的种群因为还未能获
得足够的时间建立更加复杂的结构故而呈现 “ 星
状 ” 川 。 邻接树中 , 多数单倍型在树的顶端或接近
顶端接合 (图 3 ) , 同样提示合并事件主要发生在相
B S A 0 3
对较近的时期 。 此外 , ajT ilan 的 D 检验和如 L F非
编码区序列间的差异频率分布也都支持所研究的陆
均松种群近期经历过种群扩张 。 地质和古抱粉学证
据表明 , 经历晚玉木盛冰期后 , 陆均松虽然已完全
在华南大陆消失 , 但是它们却得以在海南残存 。 盛
冰期时 , 海南海拔 so m 以上的山区仍能提供适应
陆均松生长的气温条件 , 成为其 “ 避难所 ” 。 川结合
本研究结果可以推测 , 残存于 “ 避难所 ” 的陆均松
种群在全新世时 , 伴随全球气候转暖 , 实行了种群
扩张 。 垂直方向 , 陆均松种群可以向更高海拔迁
移 ; 水平方向 , 扩张范围局限在海南岛内 , 因为冰
后期海平面的快速上升导致海南和大陆分离 , 海水
阻隔使得陆均松无法再返回华南大陆 。
近年来 , 不少研究开始尝试应用分子手段来分
析植物冰期后所经历的迁移对现有种群遗传变异格
局的影响困 。 乔木由于每代寿命相对很长 , 它们
对上述问题的探讨可能更具特殊价值 lz[] 。 但是 ,
这方面针对热带树种的工作却鲜见报道 。 陆均松是
热带雨林优势植物 , 本文以它为材料所进行的研究
显示 , 分子系统发育地理方法能够为揭示热带地区
乔木的种群遗传结构和进化历史提供新资料 。
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图 3 基于陆均松单倍型及其近缘种鸡毛松 、 百 日青和
罗汉松的 枷 L F非编码区序列 ,
以 日本黑松为外类群构建的的邻接树
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