全 文 ：[研究简报 ]
肥皂草素 Saporin-S6二级结构的
圆二色光谱及激光喇曼光谱法表征
王永亭 1　黄品伟 2　李正强 2　徐　菲 1　孟庆繁 1　杨　谊* 　史学惠* 　李青山 1
( 1. 吉林大学生命科学学院 , 长春 130023;
2. 吉林大学理论化学研究所 , 超分子结构及谱学教育部开放实验室 , 长春 130023)
关键词　肥皂草素 ; 二级结构 ; 喇曼光谱 ; 圆二色谱法
中图分类号　 O629. 73　　　　文献标识码　 A　　　　文章编号　 0251-0790( 2001) 07-1117-03
收稿日期: 2000-05-12.
基金项目: 清华大学生物膜与膜生物工程国家重点实验室资助 .
联系人简介: 李青山 ( 1942年出生 ) ,男 , 教授 , 博士生导师 , 从事蛋白质与酶的研究 . * 现在吉林省药品检验所工作 .
肥皂草素是从石竹科植物肥皂草 ( Saponaria of f icinalis)的种子中提取的一种单链核糖体失活蛋白
( scRIP) , 它可选择性地作用于真核细胞的核糖体和原核细胞裸露的 rRNA使其脱嘌呤 , 从而抑制蛋
白质的合成 [ 1] . 核糖体失活蛋白种类繁多 , 性质稳定 , 制备安全简便 , 与单克隆抗体结合后所制备的
单链免疫毒素在肿瘤治疗和骨髓移植等方面有着广泛的应用前景 [2 ] . Stirpe等 [1 ]首次分离到肥皂草毒
蛋白 , 并证明其为不含糖基的单链 RIP. SO-6是种子中含量最丰富的核糖体失活蛋白 [ 3] , 且具有特殊
的稳定性 [4 ] . 肥皂草素在医学上的应用十分广泛 , 特别是对急性 T细胞白血病及 Hodgkin’ s综合症等
的治疗 [5 ] . 由于获得合适的蛋白晶体比较困难 , 所以目前很多蛋白还没有明确的空间结构信息 . 喇曼
光谱由于溶剂干扰弱并且用量少 , 在生物样品二级结构表征中正发挥越来越大的作用 . Lippert等 [ 6]用
已知二级结构的蛋白质 (聚 -L-赖氨酸 )的喇曼光谱得到一组强度参数 , 然后用蛋白质喇曼光谱的酰胺
Ⅲ和酰胺Ⅰ ’ (重水溶液 )谱带强度建立了一组联立方程 , 从而求解蛋白质的二级结构 . 本实验用 FT喇
曼仪对 SO-6进行了谱学研究 , 并将结果与 SO-6的圆二色谱结果进行比较验证 , 希望得到关于 SO-6
的二级结构的有效消息 , 并为此蛋白的跨膜机理的研究提供结构学上的依据 .
1　实验部分
1. 1　材料及仪器　肥皂草种子购于中国医学科学院药用植物研究所 ; DEAE-32和 CM-52纤维素为
Whatman公司进口分装 ; Sephadex G-100凝胶为 Phamacia产品 ; bis及考马斯亮蓝 R250为 Fluka公司
产品 ; 标准蛋白为华美生物工程公司产品 ; 其它试剂为分析纯 .
LKB 2210型低温层析柜 , Jasco-J-500圆二分光光度计 , Bruker RFS-100型光谱仪 .
1. 2　肥皂草素蛋白的纯化　提纯参照文献 [7]方法进行 , 经阴离子、 阳离子两个交换柱和 Sephadex
G-100分子筛层析 , 以 SDS-PAGE电泳检验纯度 . 电泳方法参考文献 [8 ].
1. 3　蛋白溶液的 CD谱测定　用于 CD谱测定的蛋白样品浓度为 300μg /mL, 所用仪器为 Jasco-J-500
圆二分光光度计 , 石英样品池的光径为 0. 5 cm, 蛋白样品在室温下放置 90 d后再次测定 CD谱 .
1. 4　 FT-Raman光谱测定　蛋白冻干粉直接用于测定 FT-Raman光谱 . 对于氘代样品 , 将约 30 mg
SO-6溶于 2 mL重水 , 于 4℃冰箱中放置 24 h, 离心除去不溶物 , 得无色透明上清液 , 冻干此液得氘
代干粉 . 为氘代完全 , 重复上述操作一次 . 光谱测定在 Bruker RFS-100光谱仪上进行 , 红宝石钕光源 ,
激发波长 1 064 nm , 功率 250 mW , 室温 . 对蛋白干粉扫描 10 000次 , 氘代蛋白干粉扫描 15 000次 .
2　结果与讨论
2. 1　肥皂草素蛋白的纯度检验　纯化后的 SO-6经 SDS-PAGE电泳检验纯度 , 检测到纯化的蛋白为
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2 0 0 1年 7月 　 　　　　　　 CHEM ICAL JOURN AL O F CHINE SE UN IVERSITIES　　 　　　　　　　 1117～ 1119　
Fig. 1　 CD spectra of purif ied SO-6(—— ) and the
same SO-6 af ter 90 days( - - )
一条带 , 分子量约为 30 000. N-末端测定证实 SO-6
的 N-末端均为缬氨酸 , 其纯度适合光谱测定 .
2. 2　 SO-6溶液态 CD谱　根据文献 [9 ]方法 , 计算
得 SO-6中 T-螺旋含量为 24% . 经室温放置 90 d
后 , SO-6的 CD谱图无明显变化 (图 1) .
2. 3　肥皂草素蛋白干粉和氘代干粉的 FT-Raman
光谱　 Bellocq等 [ 10]于 1972年提出了蛋白质激光喇
曼光谱的酰胺Ⅰ 带、 酰胺Ⅲ带频率与其构象的关
系 , 但不能测定 T-螺旋和无序结构的含量 .
Lippert[11 ]等则建立了由酰胺Ⅲ和酰胺Ⅰ ’ (重水溶
液 )谱带求解蛋白质二级结构的方法 .
图 2( A)和图 2( B)分别为肥皂草素干粉和氘代干粉的 FT-Raman谱图 . 表 1为肥皂草素蛋白和氘
代蛋白干粉的主要特征喇曼光谱数据 , 表 2为聚 -L-赖氨酸和肥皂草素 SO-6的 3种构象的喇曼强度对
1 448 cm- 1谱带强度的比值 .
Fig. 2　 FT-Raman spectra of SO-6(A) and deuterated SO-6(B)
Table 1　 The main characteristic spectrum of SO-6 and deuterated SO-6 powder
ν~max /cm- 1
Pow der Deuterated pow der
Att ribution
ν~max /cm- 1
　 Pow der Deuterated powd er At t ribu tion
1 660 Amid eⅠ ’ (Uand coiled )
1 632 Amid eⅠ ’ (T-helix)
1 448 1 448 CH2
1 336 1 319 CH2
1 273 1 279 Amid eⅢ (T-helix)
1 259 Amid eⅢ (Uand coiled )
1 240 1 240 Amid eⅢ (Uand coiled )
1 124 1 122 C— N
1 003 1 003 Ph e
956 C— CT— N
850 850 Tyr
827 Tyr
642 642 Tyr
621 619 Ph e
Table 2　 Rel ative Raman spectral intensities, Iαγ , Iβγ , IRγ of poly-lys and SO-6[12 ]
Amino acid H2O soln. D2O soln. Amino acid H2O soln. D2O soln.
1 240 cm- 1 1 632 cm- 1 1 660 cm- 1 1 240 cm- 1 1 632 cm- 1 1 660 cm- 1
Poly-lys, T-Helix 0. 00 0. 80 0. 55 　 Poly-lys, random coi l 0. 60 0. 08 0. 78
Poly-lys, U-sheet 1. 20 0. 72 0. 88 　 SO-6 Protein 0. 43 0. 33 0. 49
　　根据 Lippert等 [6, 11 ]的方法 , 以聚 -L-赖氨酸的三种构象为模型 , 利用四阶联立方程组:
c( protein) Ip rotein1 240 = fTIT1 240+ fUIU1 240+ f R IR1 240
c( protein) Ip rotein1 632 = fTIT1 632+ fUIU1 632+ f R IR1 632
c( protein) I
p rotein
1 660 = fTIT1 660+ fUIU1 660+ f R IR1 660
fT+ fU+ f R = 1
式中 , Iprotein1 240 , Iprotein1 632和 Iprotein1 660分别为被测蛋白质干粉和氘代干粉喇曼光谱中 1 240, 1 632和 1 660 cm- 1谱
带的强度与 CH2弯曲模式 1 448 cm- 1强度的比值 ; IT1 240 , IU1 632和 IR1 660分别为聚-L-赖氨酸的 3种构象与
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CH2弯曲模式 1 448 cm- 1的强度比值 ; fT, fU, f R分别为被测蛋白质的T-螺旋、 U-折叠和无序的百分
比组成 ; c( protein)是被测蛋白质 CH2模式比例常数 . 计算得肥皂草素的二级结构为T-螺旋 26% , U-折
叠 37% , 无序 37% . 蛋白质侧链的喇曼光谱中 ,谱带 850 cm- 1和 830 cm- 1是酪氨酸残基的对位取代苯
的有关振动 , 由于环的呼吸振动和面外弯曲振动倍频之间的费米共振 , 它们总是成对出现 , 而且二谱
带的强度比可表征酪氨酸残基所处的环境 , 由 Siamwiza等 [13 ]提出的公式:
0. 5N bury + 1. 25N expo = I850 /I830
N bury + N expo = 1
可定量地计算其是呈“暴露式”还是呈“埋入式” [14 ] , 测得 SO-6干粉的 I850 /I830的比值为 1. 028, SO-6中
含有 12个酪氨酸 [ 15] , 约有 8个 (～ 70% )呈“暴露式”状态 . 目前 , 蛋白质非晶体条件下的定量二级结构
测定仍然是困扰人们的难题 . CD法只能较准确地给出蛋白质溶液状态下T-螺旋的含量 , 但对于测定
U-折叠和无规卷曲的确切含量则较为困难 . 从 CD谱与 Raman光谱的结果对比来看 , 冻干状态下的
Raman结果显示 SO-6的T-螺旋含量高于 CD法所测溶液状态下的含量 . 有关溶液状态下肥皂草素的
Raman光谱测定仍在尝试之中 .
参　考　文　献
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　 3　 Benat ti L. , Maria Beat rece Saccardo. Biochem. [ J] , 1989, 183: 465— 470
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A CD and FT-Raman Study on the Secondary Structure of Saporin-S6
WANG Yong-Ting1 , HU ANG Pin-Wei2 , LI Zheng-Qiang2
XU Fei1 , M ENG Qing-Fan1 , YAN G Yi, SHI Xue-Hui , LI Qing-Shan1,*
( 1. College of Lif e Science; 2. Key Laborator y of Supramolecular
Structure& Spectroscopy , J ilin University , Changchun 130023, China)
Abstract　 Saporin-S6 is puri fied f rom the seeds of Saponaria of f icinalis and i ts CD and FT-Raman spectra
are determined. From the CD spectra of f resh protein aqueous and the same aqueous that w as laid aside for
90 days, i t is proved that saporin-S6 has unusual stabili ty. Throughout the FT-Raman spect ra of saporin-
S6, w e wo rk out that theT-helix of saporin-S6 is 26% , whileU-fold is 37% , and random coil is 37% .
Keywords　 Saporin; Secondary structure; Raman spect ra; Circular dichroism ( Ed.: K, G)
1119No. 7 王永亭等: 肥皂草素 Saporin-S6二级结构的圆二色光谱及激光喇曼光谱法表征