全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (7): 700~708700
收稿 2013-04-18　　修定 2013-05-15
资助 教育部留学回国人员科研启动基金(教外司留2011-1139)、
河北大学引进人才项目(2010-185)和国家自然科学基金
(30800682和31201199)。
致谢 英国剑桥大学植物科学系Julian Hibberd博士对本研究提
供了重要的指导和支持。
* 通讯作者(E-mail: liuzhengxp@yeah.net; Tel: 0312-5079364)。
C4植物白花菜叶片发育不同阶段的基因表达谱分析
刘征1,*, 杨尚君1, 张书敏1, 赵彦宏2, 高双成3, 韩渊怀4
1河北大学生命科学学院, 河北保定071002; 2鲁东大学农学院, 山东烟台264025; 3河南科技大学农学院, 河南洛阳471003; 4山
西农业大学农学院, 山西太谷030801
摘要: C4植物白花菜与拟南芥是姊妹科的近缘植物, 是一种新近开发的研究C4光合作用的模式植物。对其叶片发育不同阶
段进行了基因表达谱的比较和分析, 结果表明在叶脉正在发育的幼叶中, 细胞分裂旺盛, 蛋白质大量合成, 表现为核糖体蛋
白基因、组蛋白基因、翻译因子基因、分子伴侣基因等的表达上调; 幼叶光合作用相关基因表达下调, 暗示着光合器官仍
处于发育阶段; 多种激素相关的基因如生长素、脱落酸、赤霉素、油菜素内酯、细胞分裂素、茉莉酸合成途径基因或信
号传导基因参与了叶片的发育, 表明激素对发育的调控作用。
关键词: 白花菜; 基因表达谱; 叶片发育; 蛋白质合成; 光合作用; 植物激素
Gene Expression Profiling during Leaf Development of a C4 Plant, Cleome
gynandra
LIU Zheng1,*, YANG Shang-Jun1, ZHANG Shu-Min1, ZHAO Yan-Hong2, GAO Shuang-Cheng3, HAN Yuan-Huai4
1College of Life Sciences, Hebei University, Baoding, Hebei 071002, China; 2School of Agriculture, Ludong University, Yantai,
Shandong 264025, China; 3College of Agronomy, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471003, China;
4College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China
Abstract: Cleome gynandra is a C4 species closely related with Arabidopsis thaliana and a newly developed
non-sequenced model plant for C4 photosynthesis. Here we conducted the comparative gene expression profi l-
ing to study the leaf development of C. gynandra. Data analysis showed in young leaves when veins were de-
veloping, expressions of ribosomal protein genes, histone genes, translational factors genes, molecular chaper-
onin genes, etc were up-regulated, indicating that cells were dividing quickly and a lot of nascent proteins were
being produced. Photosynthesis related genes were down-regulated in young leaves, suggesting that photosyn-
thetic apparatuses were still stay in developing stage. Various genes related to phytohormones such as auxin,
abscisic acid, gibberellin, brassinosteroid, cytokinin, jasmonic acid were participating in the leaf development,
showing their regulating functions on development.
Key words: Cleome gynandra; gene expression profi ling; leaf development; protein synthesis; photosynthesis;
phytohormones
白花菜(Cleome gynandra Linn.)为一年生草本
植物, 原产美洲, 在我国主要产区是湖北省。白花
菜属十字花目的山柑科(Capparaceae), 与十字花科
(Brassicaceae)是姐妹科(Hall等2002), 因此与拟南
芥的亲缘关系很接近。经叶片解剖结构、生理生
化及分子鉴定, 白花菜是一种典型的NAD-ME类
型的C4植物(Marshall等2007)。另外, 白花菜植株
相对矮小, 生长周期短, 一般种子发芽后6周开花,
且属于自花授粉植物, 每株植物可生产约4 000粒
种子(Brown等2005)。白花菜叶片mRNA经转录组
测序结果显示, 该植物的基因与拟南芥的同源基
因具有很高的序列一致性(Brautigam等2011), 因而
研究白花菜的C4光合作用分子机理, 可以方便地利
用拟南芥的基因库信息。研究C4的光合进化和发
育机理, 以玉米(Zea mays)为材料受限于植株生长
周期, 以黄顶菊(Flaveria bidentis)为材料受限于没
有可供参考的基因库信息, 以狗尾草(Setaria virid-
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2013.07.014
刘征等: C4植物白花菜叶片发育不同阶段的基因表达谱分析 701
is)为材料受限于缺乏近缘的C3植物进行比较, 而以
白花菜为材料除了可以借鉴拟南芥的基因库信息,
还能利用同属近缘的C3植物醉蝶花(Cleome spino-
sa)进行比较, 极大地方便了C4光合机理的研究, 因
此白花菜是一种开展C4光合研究的新近开发出的
模式植物。
叶是植物进行光合作用的主要器官, 对植物
的生命活动起着重要的作用, 对叶发育的研究可
以探明植物光合器官的发育过程, 为提高植物光
合效率的实践提供线索。C4植物叶片发育与C4光
合作用机制的建立密切相关。比如叶脉直接决定
着叶片的生理功能, 如光合作用的效率、水的利
用率和气体交换的效率等。在C4植物中叶脉还有
一个特殊的功能: 维持C4光合作用的进行, 特别是
C4循环的进行。叶脉的发育在C4叶片发育过程中
起着十分关键的作用 , 它指导或影响着邻近组
织、细胞的分化 , 如维管束鞘细胞和叶肉细胞
(McKown和Dengler 2010), 据推测叶脉在发育过程
中向周边细胞传递一种信号物质, 诱导了维管束
鞘细胞和叶肉细胞的特异性分化 ( L a n g d a l e
2011)。因此, 研究C4叶片的发育将有助于理解C4
高光效的分子机理。
C4植物发育的研究是近年植物学研究的一个
热点, 探明C4发育的机理也是研发C4水稻的前提,
以期水稻的产量实现跨越式增长, 满足日益增长
的世界人口的需要。近几年已在白花菜属中建立
了白花菜和醉蝶花成熟叶片的基因表达谱(Brauti-
gam等2011)、在黄顶菊属中建立了C3、C3-C4中间
体和C4植物基因表达谱(Gowik等2011)、在玉米中
开展了叶肉细胞和维管束鞘细胞叶绿体的比较蛋
白组研究(Majeran等2005, 2008; Friso等2010)、开
展了玉米从叶基部到叶尖发育梯度的比较转录组
和蛋白组研究(Li等2010; Majeran等2010)。但在C4
植物中, 有关从幼嫩叶片到成熟叶片发育的分子
机理研究仍然较少, 为此我们通过基因芯片技术
比较了白花菜叶脉正在发育的幼嫩叶片和叶脉已
发育完整的成熟叶片的基因表达差异。
材料与方法
1 材料
白花菜(Cleome gynandra Linn.)种子经30 ℃
黑暗发芽后, 移栽到营养土于玻璃温室生长, 白天
温度保持在24 ℃, 夜晚温度保持在20 ℃, 用金属
卤光灯补充自然日照, 光强至少200 μmol·m-2·s-1,
光周期为16 h光照、8 h黑暗。当植株生长到
30~40 cm高时, 开始采集叶片样品, 分别采集0.7
cm细脉正在发育且叶片尚未展开的幼叶和5 cm细
脉已完全形成且叶片完全展开的成熟叶片, 迅速
置于液氮中, 并储存于–80 ℃备用。
Tripure试剂购自Roche公司 ; On-Column
DNase I Digestion Set试剂盒购自Sigma公司;
polyATtract mRNA isolation试剂盒购自Promega公
司; cDNA逆转录试剂、酶及cy3、cy5荧光染料购
自Invitrogen公司; Qiaquick PCR cleanup试剂盒购
自Qiagen公司, 其余常用化学药品购自Sigma公
司。
2 拟南芥基因芯片
采用澳大利亚联邦科学与工业研究组织研制
开发的拟南芥基因芯片进行跨种杂交。整张芯片
序列来源于13 426个高质量EST, 包含约10 798个
非冗余的基因序列(Wilson等2005)。
3 方法与步骤
3.1 mRNA提取
叶片总RNA采用Tripure试剂提取, RNA溶液
中可能残留的DNA采用On-Column DNase I Diges-
tion Set试剂盒去除, mRNA的提取采用polyATtract
mRNA isolation试剂盒, 样品于−80 ℃保存备用。
3.2 cDNA逆转录及探针制备
将5 μg poly(A)+ RNA和5 μg Oligo(dT)引物混
于超纯水中, 终体积为16.8 μL, 置于70 ℃金属浴10
min, 迅速置于冰上冷却5 min, 加入13.2 μL预先
混合好的如下试剂: 5×cDNA第一链合成缓冲液
6 μL, 0.1 mol·L-1 DTT 3 μL, 50×氨基丙烯基标记的
dNTP混合物0.7 μL, RNaseOut 1.5 μL, Superscript
II 2 μL, 42 ℃孵育1 h后, 加入1 μL反转录酶, 并继
续于42 ℃孵育1 h。加入15 μL 0.1 mol·L-1 NaOH,
于70 ℃孵育10 min以终止反应, 加入15 μL 0.1
mol·L-1 HCl中和反应液。
将上述溶液体积加超纯水至100 μL, 加入100
μL酚氯仿后混匀, 离心5 min, 将上清液转入一个
新的离心管中, 加入10 μL 3 mol·L-1醋酸钠(pH 5.2)
和250 μL的无水乙醇, 于−20 ℃沉淀过夜。将样品
植物生理学报702
于13 000×g、4 ℃离心30 min, 分别用70%和无水
乙醇洗涤各一次, 空气干燥5 min, 加入3 μL超纯
水, 于−80 ℃保存。
取出上述样品, 加入1.66 μL 0.3 mol·L-1碳酸氢
钠(pH 9.0)和5 μL DMSO, 混匀后转到有cy3或cy5
荧光染料的离心管中, 轻轻混匀后, 于黑暗条件下
室温反应1 h, 每15 min混合一次。加入4.5 μL 4
mol·L-1羟胺, 黑暗下于室温继续反应15 min, 最后
用Qiaquick PCR cleanup试剂盒除去未反应的
染料。
3.3 芯片预杂交、杂交及杂交后清洗
将芯片置于42 ℃预杂交溶液(50%去离子甲
酰胺, 5×SSC, 0.1% SDS, 0.1 mg·mL-1 BSA)中30~60
min, 然后用去离子水浸泡清洗30 s 4次, 再用异丙
醇浸泡清洗一次, 最后在1 000 r·min-1离心2 min。
将cy3和cy5标记的探针样品(一种为幼嫩叶
片、另一种为成熟叶片)混合, 于黑暗条件下真空
干燥离心至体积1~2 μL, 加入36 μL杂交液(50%甲
酰胺, 5×SSC, 0.1% SDS, 0.1 mg·mL-1鱼精液)中,
95 ℃加热5 min、离心2 min, 并冷却至室温。将芯
片放入杂交盒中, 将混有探针的杂交液滴加到芯
片表面, 轻轻放上盖片, 并于杂交盒的两个槽中各
加入15 μL 3×SSC, 拧紧杂交盖, 于42 ℃水浴中过
夜杂交。
取出芯片, 浸于42 ℃的2×SSC、0.1% SDS清
洗液中, 于摇床上轻摇直至盖片滑落。取出芯片
于摇床上在42 ℃进行如下清洗: 2×SSC、0.1%
SDS 5 min; 0.1×SSC、0.1% SDS 5 min; 0.1×SSC
1 min 8次; 0.01×SSC 10 s。最后于1 000 r·min-1离
心甩干2 min。每份材料进行2组4次独立的杂交实
验, 组间实验采用荧光交换方式标记, 组内重复2
次。
3.4 芯片扫描和数据处理
杂交芯片采用GenePix 4000A microarray scanner
(Molecular Devices Ltd)扫描, 高背景信号、不规则
杂交斑点及不正常的荧光信号等均在进一步分析
中排除, 统计分析(包括微阵列标准化)采用Gene-
Spring GX 7.3.1 2006 (Agilent Technologies)。数据
标准化采用依赖于单点、单芯片强度的标准化、
并基于全部样品数据的20%。默认情况下(default)
进行背景校正, 杂交信号所代表的基因通过拟南
芥信息资源中最新的拟南芥基因组标注信息进行
标注, 并应用MapMan软件对光合作用相关基因进
行合成、代谢途径作图。
实验结果
1 芯片杂交结果统计
杂交结果统计显示: 在10 798个芯片探针中,
信号良好的杂交有7 360个, 检测率为68.16%。将
两组实验的荧光数据校正、整合后做散点图, 可
以比较直观地看出2个样品之间基因表达的差异
情况(图1): 多数数据点集中在上下两条斜线之间,
说明大多数基因在幼嫩叶片和成熟叶片中的表达
差异不大。可查出对应拟南芥atg编号的白花菜差
异表达基因434个, 其中幼叶中上调表达基因222
个, 下调表达基因212个。
图1 白花菜幼叶与成熟叶片基因芯片杂交散点图
Fig.1 Scatter plot of gene expression profi ling in young and
mature leaves of C. gynandra
每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号。居中45°
斜线代表在幼嫩和成熟叶片中基因表达量一样, 该斜线上方的点
表示在幼嫩叶片中上调(成熟叶片中下调)的基因、该斜线下方的
点表示在幼嫩叶片中下调(成熟叶片中上调)的基因。上端斜线上
方的数据点表示幼嫩叶片基因表达量2倍以上上调, 下端斜线下方
的数据点表示幼嫩叶片基因表达量2倍以上下调。
2 对应拟南芥atg编号的白花菜差异表达基因功能
分类
参照Bevan等(1998)的植物基因功能分类方
刘征等: C4植物白花菜叶片发育不同阶段的基因表达谱分析 703
法, 将白花菜叶片基因芯片表达差异超过2倍以上
的基因按照其参与的生物过程进行分类(表1)。
3 基因差异表达分析
在幼嫩叶片上调的基因中, 最引人注目的是
有大量与核糖体组成相关的基因, 共有46个基因
上调, 分别占全部上调基因222个的20.7%和蛋白
质合成相关基因的86.8% (表1), 其中大多数为核
糖体蛋白基因。在剩下的蛋白质合成相关的基因
中, 分别是4个编码翻译起始因子和3个编码翻译
延长因子的基因, 如起始因子基因eIF4A1 (at3g-
13920)、eIF3K (At4g33250)、eIF3B (at5g27640)和
eIF-3 (at5g44320)及GTP结合延长因子Tu家族基因
(at1g07920、at1g07930和at5g60390)。在蛋白质归
宿和储存相关的19个上调基因中, 则多数(有15个)
与蛋白质折叠有关, 约占全部上调基因的6.8%及
该组上调基因的78.9%, 与蛋白质折叠有关的基因
基本上是分子伴侣基因[如TCP-1/cpn60分子伴侣
基因家族的一些基因(at1g24510、at3g02530、
at3g03960)、chaperonin-60 alpha (At2g28000)、ja-
calin-related lectin 30 (at3g16420)、chloroplast
chaperonin 10 (at5g20720)和chaperonin-60 beta3
(at5g56500)]以及热激蛋白基因[如hsp60 (at3g-
23990)、hsp90.7 (at4g24190)、mitochondrial
hsp70-1 (at4g37910)]。与细胞结构相关的15个上
调基因中, 一个显著的特点是组蛋白基因表达上
调(6个), 约占该组上调基因的40%, 它们是histone
H2A protein 9 (at1g52740)、histone H2B (at3g-
45980)、histone H3.3 (at5g10980)、组蛋白超级基
因家族基因(at4g40040、at5g12910、at5g59690)。
其余的上调基因还包括编码微管蛋白的基因, 用
于构建新生成细胞的细胞骨架。
在幼嫩叶片中下调的基因中, 与能量相关的
基因所占比例最高, 在这一组基因中, 与光系统建
立和色素合成有关的基因为39个, 占全部下调基
因212个的18.4%及该组下调基因63个的61.9%, 比
如组成光系统I和II的一些亚基基因(at1g03130、
at1g31330、at1g52230、at1g55670等)、捕光复合
体亚基基因(at1g15820、at1g29930、at3g08940
等)、光合电子传递相关蛋白的基因(at1g15980、
at1g18730等)、叶绿素a/b结合蛋白基因(at1g-
29910、at1g61520、at2g34420等)及叶绿素合成途
径相关酶的基因 ( a t 1 g 5 8 2 9 0、 a t 2 g 2 6 5 4 0、
at4g27440)。将芯片数据导入在线MapMan软件
(http://mapman.gabipd.org/web/guest), 输出结果获
得叶片在光反应系统、卡尔文循环和光呼吸途径
中基因表达变化示意图(图2), 从图中明显可见上
述3条途径在幼嫩叶片中多数基因表达都下调。
同时, 与C4光合作用有关的一些基因也下调,
表1 白花菜幼嫩叶片中差异表达基因的功能分类
Table 1 Functional category of the differentially expressed genes in young leaves of C. gynandra
相关功能 上调表达基因数 占上调基因比例/% 下调表达基因数 占下调基因比例/%
代谢 12 5.4 14 6.6
能量 8 3.6 63 29.7
细胞生长/分裂 8 3.6 10 4.7
转录 33 14.9 8 3.8
蛋白质合成 53 23.9 - -
蛋白质归宿及储存 19 8.6 13 6.1
运载蛋白 9 4.1 14 6.6
胞内运输 4 1.8 1 0.5
细胞结构 15 6.8 5 2.4
信号转导 11 5.0 21 9.9
疾病/防卫 7 3.2 14 6.6
次生代谢 3 1.4 - -
转座子 - - 1 0.5
核糖体RNA 1 0.5 4 1.9
不明分类 19 8.6 8 3.8
未知功能 20 9.0 36 17.0
植物生理学报704
如碳酸酐酶(CA, at3g01500和at5g14740)、磷酸烯
醇式丙酮酸羧激酶(PEPC, at3g14940)、丙酮酸磷
酸双激酶(PPDK, at4g15530)。总之, 与成熟叶片相
比, 在叶脉正在建立的幼嫩叶片中, 与光合作用的
光反应和暗反应有关的基因表达量均较低。
需要注意的是, 叶片发育过程涉及众多激素
的合成及信号转导, 如生长素、脱落酸(ABA)、赤
霉素(GA)、茉莉酸(JA)、细胞分裂素(CK)、油菜
素内酯(BR)等。本研究发现有5个与生长素有关
的基因在叶片发育过程中差异表达, 其中2个上调,
分别是wat1 (at1g75500)和abcb19 (at3g28860); 3个
下调, 它们是snx1 (at5g06140)、休眠/生长素相关
基因家族的基因(at2g33830)和ailp1 (at5g19140)。
ABA合成的关键基因NCED1 (at3g63520)和NCED4
(at4g19170)在幼嫩叶片中表达下调, 同时筛选出与
ABA信号转导相关的差异表达基因还包括ATCYS-
3A (at4g14880)、myb-like转录因子基因(at1g70000)、
ARCK1 (at4g11890)、FBA2 (at4g38970)、BBD1
(At1g75380)、ALT31 (At5g27420)、原生质膜质子
ATP酶基因(At2g18960)、MAPK3 (at3g45640)。与
BR合成及信号转导有关的一些基因在幼嫩叶片中
上调, 如cabbage1 (at3g19820)和aact2 (At5g48230)
是BR合成途径的两个重要基因, grf6 (at5g10450)
则在BR信号转导中发挥作用。本研究还发现一些
受GA调控的基因在幼叶中表达上调 , 如atarca
(at1g18080)、2个GA调控蛋白家族基因(at2g14900
和at5g14920)及gasa4 (at5g15230)。另外还发现一
个水孔蛋白基因上调(at4g35100)。
图2 白花菜幼叶在光反应系统、卡尔文循化和光呼吸途径中的基因表达
Fig.2 Expressions of genes involved in light reactions, Calvin cycle and photorespiratory pathway in young leaves of C. gynandra
绿色代表基因表达在幼叶中下调, 从深绿到浅绿代表基因差异表达量逐渐减弱; 红色代表基因表达在幼叶中上调, 从深红到粉红代表
基因差异表达量逐渐减弱; 白色代表基因表达无差异。
刘征等: C4植物白花菜叶片发育不同阶段的基因表达谱分析 705
讨　　论
1 近缘植物的跨种芯片杂交
基因芯片是大规模分析基因表达谱的有效手
段, 可以同时检测上万个基因的转录水平, 由此可
以检测植物不同发育阶段基因的表达差异, 进而
探讨植物发育的分子机理。针对目前一些基因组
序列未知、cDNA文库也未构建的物种, 可以采取
与近缘物种的基因芯片进行跨种杂交的方法, 因
为彼此之间基因序列比较一致。目前在近缘动、
植物种间进行跨种杂交成功的案例已经很多。在
植物中有油菜与拟南芥(Gaeta等2009)、马铃薯和
西红柿(Bar-Or等2006)的跨种杂交等。跨种杂交
成功的一个关键是采用长序列的探针制作cDNA
芯片, 这样探针序列与所选物种基因序列之间的
个别碱基差异将对杂交和分析结果不产生影响
(Adjaye等2004; Chen等2004)。本实验采用的是拟
南芥cDNA芯片, 探针长度均在70个碱基以上, 有
一部分超过100, 为跨种杂交的成功提供了前提。
另外, 白花菜和拟南芥亲缘关系很近, 白花菜和醉
蝶花的高通量转录组测序与拟南芥的基因序列比
对结果可以直接判断各自所属的光合类型(Brauti-
gam等2011), 表明它们之间基因序列的一致性很
高。对一些白花菜C4循环的关键基因的测序也表
明, 它们与拟南芥同源基因序列一致性高达90%以
上。总之, 由于白花菜和拟南芥的近缘关系以及
我们所选芯片探针较长, 最终获得了理想的杂交
效果。
2 C4叶片发育与核糖体蛋白基因的表达
对拟南芥叶片发育的形态及基因表达谱分析
表明, 新生幼嫩叶片中所有细胞均进行分裂增殖,
此时细胞质核糖体蛋白基因的表达最高; 随后叶
尖处先进入细胞膨大期, 并向靠近叶柄处扩展, 在
细胞膨大期核糖体蛋白基因的表达最低; 最后细
胞膨大停止, 叶片进入成熟期, 此时核糖体蛋白基
因的表达高于膨大期、但低于增殖期(Beemster等
2005; Andriankaja等2012)。我们所采用的白花菜
幼嫩叶片, 正处于细胞分裂增殖的旺盛时期, 共检
测出46个核糖体蛋白基因上调。成熟叶片中则未
检测出上调的核糖体蛋白基因。核糖体蛋白基因
在幼嫩叶片中高表达一方面暗示在叶片发育过程
中有大量核糖体的合成与组装, 为各种发育相关
基因的翻译提供了前提条件; 另一方面, 有众多的
证据表明核糖体蛋白与叶片发育的调控有关, 即
在翻译水平调控叶片发育(Horiguchi等2012)。在
拟南芥中已明确与发育相关的核糖体蛋白基因,
如rpl24b (At3g53020)、rps5b (At2g37270)、rpl23
(At4g16720)、rpl28a (At2g19730)、rpl27a (At1g-
23290)等, 它们的同源基因在白花菜幼叶中均上
调。总之, 在白花菜幼叶中大量核糖体蛋白基因
高量表达, 暗示着众多核糖体蛋白及其在翻译水
平调控的发育相关基因协调作用, 实现了叶片的
正常发育。
3 C4叶片发育与细胞分裂、蛋白质合成
细胞分裂过程中新合成的DNA需要与组蛋白
形成核小体, 因而DNA复制、细胞分裂与组蛋白
的合成密切相关(Marzluff和Duronio 2002)。在本
研究中发现有一些组蛋白基因表达在幼嫩叶片中
上调, 表明在白花菜发育的叶片中进行着活跃的
细胞分裂。在橄榄叶片发育早期同样也观察到组
蛋白基因表达上调(Maayan等2008), 暗示着陆生植
物在叶片发育初期存在着一些共同的分子机理。
白花菜幼叶中生命活动旺盛, 进行着大量蛋
白质的合成。其中的一个证据来自于蛋白质翻译
的起始因子和延长因子的基因表达上调; 另一个
证据是大量分子伴侣基因和与蛋白质折叠有关的
热激蛋白基因的表达上调, 这些基因的蛋白产物
将帮助新生肽正确的折叠, 如组蛋白的折叠、核
糖体蛋白的折叠及核糖体的组装(Karbstein 2010)
等。幼叶中核糖体组装活跃的证据还在于本实验
筛选出一个新生肽相关复合体基因(NAC, at1g73230)
在幼叶中表达上调, 该基因产物的功能是促进核
糖体的组装(Karbstein 2010)。热激蛋白基因在幼
叶中高表达的另一可能原因是幼叶光合器官不健
全 , 对光线的照射较敏感 , 可能产生光损伤
(Maayan等2008), 导致一些蛋白质空间结构异常,
热激蛋白等参与了蛋白质的损伤修复。
4 C4叶片发育与光合作用
Maayan等(2008)对橄榄叶片发育的研究表明
正在发育的幼叶光合作用很低, 与光合器官未发
育成熟有关, 如缺乏成熟的叶绿体, 尽管光系统、
捕光复合体和光合电子传递相关蛋白已存在, 但
含量较低, 且随叶片发育而逐渐增加。本研究则
植物生理学报706
进一步证明在白花菜幼叶中众多与光系统I和II、
捕光复合体及光合电子传递有关基因的表达至少
在转录水平受抑制。同时还发现叶绿素合成相关
蛋白的基因表达下调, 暗示着幼叶中叶绿素含量
较低 , 这与橄榄幼叶叶绿素含量较低相一致
(Maayan等2008), 可见在叶片发育初期叶绿素合成
途径的相关基因表达尚未完全激活。从进化及经
济的角度考虑, 由于光合器官发育不完善, 植物幼
叶还无法进行有效的光合作用, 光系统组装及叶
绿素合成相关基因的高量表达只会造成浪费。
另外, 从图2可以看出在幼嫩叶片中卡尔文循
环中多数基因表达均下调, 表明在叶片发育阶段
CO2的同化并不活跃。由于幼叶发育初期检测不
到Rubisco (Maayan等2008), 因而Rubisco的加氧反
应也不能实现, 光呼吸不活跃, 光呼吸代谢相关基
因表达呈下调。同样值得关注的是, 作为NAD-
ME类型的C4植物白花菜, 幼叶中C4循环的一些关
键基因的表达也呈下调, 表明在幼叶中活跃的C4循
环并未完全建立。
总之, 正在发育的幼叶中, 无论是光反应还是
暗反应均未完全建立。此时叶片仍以异养型为主,
需要由叶源向其运输养分和能量, 以供发育的需
要(Šesták 1985)。
5 C4叶片发育与植物激素
5.1 生长素
生长素在叶片发育中具有重要地位, 比如生
长素运输和分布决定叶原基的起始、参与叶片极
性建立和叶片形态构建、调控叶片细胞分裂、参
与叶片维管模式形成等(李林川和瞿礼嘉2006)。
在白花菜幼叶中, 与生长素相关的差异表达基因
可能涉及生长素极性运输(如abcb19) (Nagashima
等2008)、维管束形成(如wat1) (Ranocha等2010)、
生长素运载蛋白的降解及回用(如snx1) (Cui等
2010)等。C4植物叶脉密度远高于C3植物可能与生
长素的极性运输、维管束原形成层的形成有关
(McKown和Dengler 2010), 因而进一步探究这些生
长素相关基因在C4植物发育中的作用可能会为探
究C4高密度细脉系统之谜提供一些线索。
5.2 脱落酸
虽然一般认为ABA是与胁迫相关的植物激
素, 但在一些水生植物中, 它可以决定叶片的解剖
结构及细胞的生理功能, 如ABA可以触发大莎草
(Eleocharis vivipara) C4形态建成及C4循环(Ueno
2001)。目前仍未发现在陆生C4植物, 如玉米、黄
顶菊等中ABA对C4酶有诱导作用。本研究经比对
正在发育的C4白花菜幼嫩叶片和成熟叶片的基因
表达谱, 发现一些与ABA有关的基因差异性表达,
如ABA合成的关键基因NCED1和NCED4在幼叶中
表达下调。目前比较流行的C4植物进化的假说认
为低大气CO2浓度、高温、干旱、盐碱等因素加
剧C3植物的光呼吸, 从而促成植物向C4方向进化,
其中进化的一个动力是改善植物叶片水分的运输
和利用率, 比如胁迫条件下ABA的积累诱导了维
管束鞘细胞的水通道蛋白表达下调, 临时阻断从
微管组织到叶肉细胞的水分流动, 减缓了水分向
叶片的供应。自然选择的结果导致维管束鞘细胞
体积增大, 便于储存更多的水分, 以平衡向叶肉细
胞的水分供应(Liu等2013)。有趣的是本研究同时
筛选出一个水通道蛋白基因plasma membrane in-
trinsic protein 3 (pip3, at4g35100)在幼叶中表达上
调。需要指出的是该实验是在水分供应充足的条
件下进行的。虽然此时ABA没必要积累以诱导水
通道蛋白表达下调, 但却从另一个侧面暗示ABA
积累和水通道蛋白基因表达存在一定相关性。本
实验筛选出众多ABA合成及信号转导相关基因在
C4叶片发育过程中差异表达, 暗示着ABA可能参
与了陆生C4叶片的发育。
5.3 油菜素内酯、赤霉素
BR是一种在叶片发育和细胞分化中起重要
作用的植物激素。C4植物叶片的发育与成熟存在
一个逐渐过渡的过程, 如玉米叶片靠近柄部的部
位表现为维持基本的细胞功能, 并进行活跃的细
胞分裂, 中间则体现从库到源的过渡状态, 靠近叶
尖处进行活跃的光合作用(Li等2010; Majeran等
2010; Nelissen等2012)。研究发现BR合成途径在
靠近叶柄处表达量最高, 随着远离叶柄处其表达
量迅速下降(Majeran等2010)。与此相一致的是,
我们发现在白花菜幼嫩叶片中一些与BR合成及信
号转导相关的基因表达上调。BR存在于快速分化
和扩展的叶片或叶片区域, 这与BR促进细胞增大
的功能相一致(Kim和Wang 2010)。
GA可以促进细胞的分裂和叶片伸长的速率
刘征等: C4植物白花菜叶片发育不同阶段的基因表达谱分析 707
(Nelissen等2012)。一些受GA调控的基因在白花
菜幼叶中表达上调暗示着GA在幼叶中积累, 并对
叶片发育起作用。与此推测相一致的是, 玉米叶
片从柄部到叶尖的发育梯度研究证实靠近柄部(细
胞分裂区) GA的合成达最高, 而在细胞分裂区和
细胞增大区的分界处GA的代谢最活跃(Nelissen等
2012)。
本研究还发现与JA和CK相关的一些基因差
异表达, 表明叶片发育是一个复杂的过程, 涉及多
种激素的调控。
总之, C4植物叶片发育是一个复杂的过程, 幼
叶细胞生命活动、细胞分裂旺盛, 进行着大量蛋
白质的合成以满足生长的需要, 表现为核糖体蛋
白基因、组蛋白基因、翻译因子基因、分子伴侣
基因等的表达上调。由于幼叶光合器官尚未建立,
与光合作用有关的基因均下调, 幼叶仍处于异养
生长阶段。各种植物激素参与了叶片发育这一复
杂的过程, 比如生长素、ABA、GA、BR等, 生长
素相关基因在幼叶的高表达可能与生长素极性运
输及叶脉的发育有关, GA和BR相关基因的高表达
与叶片细胞分裂、伸长有关, ABA也可能以某种
形式参与了陆生C4植物叶片的发育, 但具体的机理
有待进一步探讨。
参考文献
李林川, 瞿礼嘉(2006). 生长素对拟南芥叶片发育调控的研究进展.
植物学通报, 23 (5): 459~465
Adjaye J, Herwig R, Herrmann D, Wruck W, Benkahla A, Brink TC,
Nowak M, Carnwath JW, Hultschig C, Niemann H, Lehrach H
(2004). Cross-species hybridisation of human and bovine orthol-
ogous genes on high density cDNA microarrays. BMC Genom-
ics, 5: 83
Andriankaja M, Dhondt S, Bodt SD, Vanhaeren H, Coppens F, Milde
LD, Muhlenbock P, Skirycz A, Gonzalez N, Beemster GTS,
Inze D (2012). Exit from proliferation during leaf development
in Arabidopsis thaliana: a not-so-gradual process. Dev Cell, 22:
1~15
Bar-Or C, Bar-Eyal M, Gal TZ, Kapulnik Y, Czosnek H, Koltai H
(2006). Derivation of species-specifi c hybridization-like knowl-
edge out of cross-species hybridization results. BMC Genomics,
7: 110
Bevan M, Bancroft I, Bent E, Love K, Goodman H, Dean C, Berg-
kamp R, Dirkse W, Staveren MV, Stiekema W et al (1998).
Analysis of 1.9 Mb of contiguous sequence from chromosome 4
of Arabidopsis thaliana. Nature, 391: 485~488
Beemster GT, Veylder LD, Vercruysse S, West G, Rombaut D, Hum-
melen PV, Galichet A, Gruissem W, Inzé D, Vuylsteke M (2005).
Genome-wide analysis of gene expression profiles associated
with cell cycle transitions in growing organs of Arabidopsis,
Plant Physiol, 138: 734~743
Brautigam A, Kajala K, Wullenweber J, Sommer M, Gagneul D, We-
ber KL, Carr KM, Gowik U, Mass J, Lercher MJ et al (2011). An
mRNA blueprint for C4 photosynthesis derived from compara-
tive transcriptomics of closely related C3 and C4 species. Plant
Physiol, 155: 142~156
Brown NJ, Parsley K, Hibberd JM (2005). The future of C4 research –
maize, Flaveria or Cleome? Trends Plant Sci, 10: 215~221
Chen YA, McKillen DJ, Wu S, Jenny MJ, Chapman R, Gross PS,
Warr GW, Almeida JS (2004). Optimal cDNA microarray design
using expressed sequence tags for organisms with limited ge-
nomic information. BMC Bioinformatics, 5: 191
Cui Y, Li X, Chen Q, He X, Yang Q, Zhang A, Yu X, Chen H, Liu N,
Xie Q et al (2010). BLOS1, a putative BLOC-1 subunit, interacts
with SNX1 and modulates root growth in Arabidopsis. J Cell
Sci, 123: 3727~3733
Friso G, Majeran W, Huang M, Sun Q, van Wijk KJ (2010). Recon-
struction of metabolic pathways, protein expression, and homeo-
stasis machineries across maize bundle sheath and mesophyll
chloroplasts: large-scale quantitative proteomics using the first
maize genome assembly. Plant Physiol, 152: 1219~1250
Gaeta RT, Yoo SY, Pires JC, Doerge RW, Chen J, Osborn TC (2009).
Analysis of gene expression in resynthesized Brassica napus al-
lopolyploids using Arabidopsis 70mer oligo microarrays. PLoS
ONE, 4 (3): e4760
Gowik U, Brautigam A, Weber, KL, Weber APM, Westhoff P (2011).
Evolution of C4 photosynthesis in the genus Flaveria: how
many and which genes does it take to make C4? Plant Cell, 23:
2087~2105
Hall JC, Sytsma KJ, Iltis HH (2002). Phylogeny of Capparaceae and
Brassicaceae based on chloroplast sequence data. Am J Bot, 89:
1826~1842
Horiguchi G, Lijsebettens MV, Candela H, Micol JL, Tsukaya H
(2012). Ribosomes and translation in plant developmental con-
trol. Plant Sci, 191-192: 24~34
Karbstein K (2010). Chaperoning ribosome assembly. J Cell Biol, 189
(1): 11~12
Kim TW, Wang ZY (2010). Brassinosteroid signal transduction from
receptor kinases to transcription factors. Annu Rev Plant Biol,
61: 681~704
Langdale JA (2011). C4 cycle: past, present, and future research on C4
photosynthesis. Plant Cell, 23: 3879~3892
Li P, Ponnala L, Gandotra N, Wang L, Si Y, Tausta SL, Kebrom TH,
Provart N, Patel R, Myers CR et al (2010). The developmen-
tal dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet, 42:
1060~1067
Liu Z, Sun N, Yang SJ, Zhao YH, Wang XQ, Hao XY, Qiao ZJ (2013).
Evolutionary transition from C3 to C4 photosynthesis and the
route to C4 rice. Biologia, 68 (4): 577~586
Maayan I, Shaya F, Ratner K, Mani Y, Lavee S, Avidan B, Shahak Y,
Ostersetzer-Biran O (2008). Photosynthetic activity during olive
植物生理学报708
(Olea europaea) leaf development correlates with plastid bio-
genesis and Rubisco levels. Physiol Plant, 134: 547~558
Majeran W, Cai Y, Sun Q, van Wijk KJ (2005). Functional differentia-
tion of bundle sheath and mesophyll maize chloroplasts deter-
mined by comparative proteomics. Plant Cell, 17: 3111~3140
Majeran W, Zybailov B, Ytterberg AJ, Dunsmore J, Sun Q, van Wijk
KJ (2008). Consequences of C4 differentiation for chloroplast
membrane proteomes in maize mesophyll and bundle sheath
cells. Mol Cell Proteomics, 7: 1609~1638
Majeran W, Friso G, Ponnala L, Connolly B, Huang M, Reidel E,
Zhang C, Asakura Y, Bhuiyan NH, Sun Q et al (2010). Structural
and metabolic transitions of C4 leaf development and differen-
tiation defined by microscopy and quantitative proteomics in
maize. Plant Cell, 22: 3509~3542
Marshall DM, Muhaidat R, Brown NJ, Liu Z, Stanley S, Griffiths H,
Sage RF, Hibberd JM (2007). Cleome, a genus closely related to
Arabidopsis, contains species spanning a developmental progres-
sion from C3 to C4 photosynthesis. Plant J, 51: 886~896
Marzluff WF, Duronio RJ (2002). Histone mRNA expression: mul-
tiple levels of cell cycle regulation and important developmental
consequences. Curr Opin Cell Biol, 14: 692~699
McKown AD, Dengler NG (2010). Vein patterning and evolution in
C4 plants. Botany, 88: 775~786
Nagashima A, Suzuki G, Uehara Y, Saji K, Furukawa T, Koshiba T,
Sekimoto M, Fujioka S, Kuroha T, Kojima M et al (2008). Phy-
tochromes and cryptochromes regulate the differential growth
of Arabidopsis hypocotyls in both a PGP19-dependent and a
PGP19-independent manner. Plant J, 53: 516~529
Nelissen H, Rymen B, Jikumaru Y, Demuynck K, Lijsebettens MV,
Kamiya Y, Inze D, Beemster GTS (2012). A local maximum in
gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control
of cell division. Curr Biol, 22: 1183~1187
Ranocha P, Denancé N, Vanholme R, Freydier A, Martinez Y, Hoff-
mann L, Köhler L, Pouzet C, Renou JP, Sundberg B et al (2010).
Walls are thin1 (WAT1), an Arabidopsis homolog of Medicago
truncatula NODULIN21, is a tonoplast-localized protein required
for secondary wall formation in fibers. Plant J, 63: 469~483
Šesták Z (1985). Chlorophylls and carotenoids during leaf ontogeny.
In: Šesták Z (ed). Photosynthesis during Leaf Development.
Prague: Academia, 76~106
Ueno O (2001). Environmental regulation of C3 and C4 differentiation
in the amphibious sedge Eleocharis vivipara. Plant Physiol, 127:
1524~1532
Wilson IW, Kennedy GC, Peacock JW, Dennis ES (2005). Microarray
analysis reveals vegetative molecular phenotypes of Arabidopsis
fl owering-time mutants. Plant Cell Physiol, 46: 1190~1201