全 文 ：华西药学杂志
M C J
·
P S
1伙9 4 ;9 ( 4) 2 21 ~ 2 2 4
兴安升麻皂试体外I s V抑制作用及其机制
林 新 蔡有余 肖培根
(中国医学科学院药用植物资源开发研究所免疫室 北京 1 00 09助
提要 以猴艾滋病病毒 SI V作为人艾滋病病毒 H W体外模型 ,观察了兴安升麻皂贰 ( C d 一 s) 在H ut -
78
一 SW体外培养系统对 S W的抑制作用 ,并与阳性药叠氮胸普 (A Z T )的作用进行了比较 。 结果 20 0m g /
m l C d
一 S 可抑制荧光阳性细胞数 , 抑制率为 2 4 . 0 0% , S VI 产量下降 2~ 3个单位 , 细胞病变程度亦有所
缓解 。 与阳性药A Z T相比 , dC 一 S对 S VI 的抑制作用仅为轻度 。 为探讨其作用机制 , 同时观察了 C d 一 S 在
体外P H A刺激的淋 巴细胞培养系统对 “ H 一 T d R转运的影响 , 结果表明 175 。 。协g / m l剂 量 C d 一 S 可明显抑
制 3H 一 T d R 的转运 ,抑制率达 9 3 。 8 5% , 提示 C d 一 S是 通过抑制细胞膜的核普转运过程 , 导致 SVI 在宿主
细胞内自身D N A合成受限 , SVI 产量下 降 , 表现为 C d 一 S对S Vr 的抑制作用 。
关键词 兴安升麻 ( C im i ic fu g a d ha u ir ca ) 皂贰 叠氮胸普 ( A Z T ) H ut 一 78 细胞 猴艾滋
病病毒 《 S I V ) 核普转运
升麻 ( R h i z o m a C i m i e i f u g a e ) 为毛莫科
植物 , 以其根状茎入药 , 其名称有周升麻 (《本
经 》 ) , 周麻 ( 《别录 》 ) , 鸡骨升麻 ( 《 陶
宏景》 ) , 鬼脸升麻 ( 《本草纲 目》 ) 等等 。
升麻作为民间常用中草药已有一 千 多 年 的历
史。 宋朝前 , 升麻主要用于 解 “ 毒 ” , 对 中
医辩证定性为 “毒 ” 的情况 , 如 “ 温毒 ” 、 “ 火
毒 ” 、 “ 疫毒 ” 和误食某些药物或食物引起的中
毒等均有不同程度的解 “ 毒 ” 疗效 〔 1 〕 。 现代
药理研究表明 , 升麻 ( R h i z o m a C i m i e i f u g a e )
除了有抗炎 〔 ” 〕 、 抗突变 〔 3 〕 作用外 , 尚有抑
制核昔转运作用 〔 4 〕 。 本实验观察了兴安升麻
皂昔 ( C i m i e i f u g a d a h u r i e a S a p o n i n s ,
C d一 )S 在体外 H ut 一7 8一 SI V 培养系统对 S IV的
抑制作用 , 同时观察 了 C d一S 对植 物 血 凝 素
(P H A ) 刺激的人外周血淋 巴细 胞 核昔转运
的影响 , 现将结果报道如下 。
材料和方法
病毒 SI V 、 细胞株 H ut 一 78 及 SI V阳性血清 、
g p Z o单抗均为美国加州灵长类中心 M a x 博士嫂
赠 ; R P M I i 6 4 o购于 S i g m a 公司 , 小牛血 、 P H A 、
青霉素 、 链霉素及 “ H一 T d R均为国产 ; 3, 叠氮
胸昔 ( A Z T ) (西德拜尔药厂提供 ) ; 兴安升麻
皂贰 ( C d一 S )( 中国医学科学院药用植物资源开
发研究所植化室提供 ) ; 离心机 、 自动细胞收
获仪 (国产 ) ; 闪烁仪 ( B ce k m a n公 司产品 ) 。
一 、 c d一 s在 H ut 一 78 一 sl v 体外培养系 统对
sl v 的抑制作用
靶病毒的制备和滴定 IS V感染 H ut 一 78 细
胞 、 S IV病毒液 Zm l 添加于已去溶液的 1 x 1 0 7
H ut 一 78 细胞内 , 混匀 , 置 4 ℃吸附 2 小时 , 离
心去溶液 , 添加 l o m l新鲜 R PM l l 6 4 0营养 液 ,
置 37 ℃C O Z 孵箱内 , 每周换液 2次 , 约 2周的病
变达 75 % , 离心去上清液 , 10 ~ 20 % 感染细胞和
8 0~ 9 0 %新的未感染细胞指混合使 细 胞 浓 度
为 2 x l o 6 / m l , 2 天后收取上清液为 SI V病毒
液 , 分装冻存于一70 ℃ , 病毒滴定为在 96 孔板上 ,
病毒作 2 倍系列稀释 , 加等量的 C E M X 一 1 74 细
胞 , 置 37 ℃ C O Z孵箱 5~ 7天观察结果 , 以细胞
融合为指标 , 一般滴度可达 1 : 2 5 6 。 , 试验时用
6 4融合单位 。
待测药物对 H ut 一78 细胞毒性测定 药物
在 96 孔板上作系列 2倍稀释 ,等量加入 1 . s x 1o .
/ m l H
u t一 7 5细胞 , 置 3 7 ℃ C O Z 孵箱 5~ 6 天 , 在
显微镜下观察细胞生长情况 , 用酞酚兰测 定细
DOI : 10. 13375 /j . cnki . wcjps . 1994. 04. 004
华 西 药 学 杂 志 9卷
胞活性和计数 , 选取无细胞毒性浓度进行试验 。
正式试验 用 sI V作靶病毒时 , 在 24 孔板
上每孔加入 1 . 乒 8 2 0 “ / m l H u t一细胞 o . 4m l , 6 4
个融合单位 SI V O. 4 m l , 然后加入待试 药物 C d -
S
、
A Z T O
.
s m l
。 每个药物每稀 释 度 2 孔 , 另
作 S I V (不 加药物 ) H u t一 7 5细胞 (不加 S I V 和
药物 ) 各 2 孔作对照 。 置 3 7 oC C O : 孵箱 , 5 天
观察病变 , 并且每孔去 O` 8m l溶液 , 添加 不 同
浓度药液或溶液 (对照孔 ) 0 . 8m l , 复孵育 5 天 ,
每观察病变。 每同样两孔培养物合并 , 上清液
作 SI V病毒滴定 。 细胞用 P B S洗三次 , 常规涂
片 , 用 g p 2 0单抗作间接免疫荧光试验 (I F A ) ,
计算 20 0个细胞中的 SI V抗原阳性细胞百分率与
SI V对照孔的SI V抗原阳性细胞百分率 相比较 ,
计算阳性细胞抑制率 。
二 、 C d 一 s 对 P H A刺激人外周血淋 巴细胞核
昔转运的影晌
培养基的配制与分装 R P M l l 6 4 0培养 液
8 0 %
,
F B S 2 0%
, 青霉素 1 0 0 I U / m l , 链霉素 2 0 0
林 g / m l , P H A s m以m l , 无菌条件下将上述各组
成份混匀 , 以 7 . 5% N a H C O 3调 P H 7 . o ~ 7 . 2 ,
分装 24 孔板 , 每孔含培养液 9 0 0时 。
种血与加样 将采集的正常人静脉血 (肝
素抗凝 )在超净台内无菌接种于上述培养基中 ,
每孔 1 0 0时 , 实验组同时加不同浓度兴安升麻皂
贰液20 时 , 空白对照组加等体积培养基 。 每组
4 个平行孔 , 每孔总体积约为 1 0 0 0衅。 加好样的
2 4孔板于 3 7 ℃ , 5 % C O : 条件下 , 共同培养 4 8
小时 , 每孔加入 Z u C i “ H 一 T d R , 再置 3 7 ℃ 5%
C O
Z条件继续培养 24 小时 , 冰浴终止反应 。
液闪测定 将上述终止反应的各孔培养细
胞用冷生理盐水 5 m l , 洗涤 2 次 。 然 后 用 自
动细胞收集器将细胞收集到 49 型玻璃 纤 维 纸
上 , 蒸馏水洗 10 遍 , 80 ℃烤干或室温凉干后放
入盛有闪烁液 5 m l瓶 中进行日计数 。
结 果
一 、 C d 一 s 在 H ut 一 78 一 I v 体外培养系统对
S I V的抑制作用
如表 1 及图 1 所示 C d一S实验组与 SI V对照
T a b l e
表 1 中药兴安升麻皂贰在体外 H u t 一78 一I V培养系统对 SW 的抑制作用
I n hi b i t ion o f S IV in H吐一 7 8一W e u l t u esr 扭 v i t r o by C h ln es e m e d i e加 a l h e r b a C d -S
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5 1、
2 1
2 2
2 2 一 3
2 5
C d
一 S = C im i e if u g a d a h u r i c a S a Po n ln s
相 比 , H ut 一 78 细胞病变程度有所缓解 , 病毒产
量下降 1~ 3个融合单位 , 免疫荧光阳性细胞数
减少 , 当 C d一 S终浓度为 20 0件g / m l时 , 荧光 阳性
细胞抑制率达 24 . 20 % , 与阳性药 A Z T 荧光 阳
性细胞抑制率 91 . 30 %相比 , 仅为轻度抑制 , 尚
未达到阳性药物标准 : 荧光阳性细 胞 抑 制 率
) 3 0 %
。
二 、 C d 一 S对 P H A 刺激的人外周血淋 巴细胞
核昔转运的影响 。
结果如表 2 、 图 2 所示 “ H 一T d R 的掺入量
(C P M值 ) , 随着 C d一 5给药浓度的 提 高 , 而
逐渐减少 。 经统计学处理 , C d一S实验组与阴性
对照组 比较 , 有显著及非常显著统 计 学 差 异
( p < 0
.
0 5一 p < 0
.
0 0 1 ) 当 C d一 S 浓 度 提 高 到
17 5
.
0 0件g / m l时 “ H 一 T d R掺入抑制率达 9 3 . 5 5%
提示 C d一S有强烈抑制核昔转运作用 。
3期
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图 、 不同剂量的兴安升麻皂俄与其阳性细胞百分抑制
率的关系 。
F i g 1 T he e o r r o l ta i o n be t
v 7 e e n 卯 r e ent
i n h ib i t i o n r ta e o f P o s i t i v o e o l l a n d
d 1f f o r e n七 d o s e s o f C d一 5 . ( C d一 S 二
C i m i c i f i g a d ha u r i e a SPa o n in s )
表 2 兴安升麻皂贰对 P H A刺激的人外周血淋巴细胞
3 H一 T d R核普转运的影响
T a b l e 2 I n f l u e n ce o f C d
一 5 o n 3 H 一 T d R
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0
5
.
4 7
1 0 ; 9 4
2 1
.
8 8
4 3
.
7 5
8 7
.
50
17 5
.
0 0
15 7 30 5
.
0 0士 2 14 3 . 4 8
14 6 9 1 3
.
0 0士 4 12 9 . 3 3
13 4 3 1 0
.
0 0士 4 5 58 . 0 7
13 0 13 0
.
00 士 6 4 3 . 8 2
10 4 7 4 8
.
8 9士 1 4 98 . 33
6 0 2 3 2
.
50 土 9 6 8 . 76
96 7 0
.
7 5士 34 3 . 8 6
6
.
6 1
14
.
6 2
. “
16
.
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3 3
.
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6 1
.
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. ’ .
e d一 S = C im i e i f u g a d a h u r i e a S a P o n玩 5 .
一 P < 0 . 0 1 ; , , · P < 0 . 0 0 1
写吕
(
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目oT护.`d召。工
至诸
讨 论
人类免疫缺陷综合症 ( A I D )S 的病原是人
类免疫缺陷病毒 ( H I V ) , 从发现病原至今尚
未找到理想的预防措施和治疗药物。 进 行 抗
H VI 药物的筛选 , 首要解决方法学的问题 。 最理
想的方法是用 H IV和 T 细胞系统进行筛 选 , 但
H IV 的危险性大 , 需要特定的条件和严格 的 P 3
实验室内进行操作。 因此国外亦探索危险性小 ,
条件一般的反转录病毒代替 H I V进行 药 物 筛
选 , 如小斌白血病病毒 (M u L V ) 〔 5 〕 , 羊维 纳
斯病毒 (S R V 一 1 ) 〔 “ 〕 , 猴免疫缺陷病病毒
( S IV ) 〔 7 〕 , 猴 D型反转录病毒 1型 ( S R V一 1 ) 〔8 〕
等 。 考虑 升 麻 传 统 的 解 “毒 ” 作 用 及 其
现代研究 的核昔转运抑制作用 , 利 用 H ut 一 7 8-
SI V 筛选系统 , 通过观察细胞融合程度 , 病毒
效价及免疫荧光 阳性细胞数三个指标 , 检测了
兴安升麻皂贰对 SI V 的抑制作用 , 并观察 了C d -
S对核昔转运的影响 。 本文首次发现 , 兴 安 升
麻皂贰 ( C d一 )S 有强烈的核昔转运抑制作 用 ,
对 SI V亦有一定的抑制作用 , 其抑制率尚未达到
阳性药标准 ( ) 30 % ) , 这与其内含多种成 份 有
关 , 对其抗 SI V有效成份的检测尚有待 于进一
步研究。
兴安升麻皂贰 ( C d一 )S 对 SI V抑制作用机制
与以下两方面有关 : ( 1 ) 影响 SI V 利用宿主
H ut 一 7 8细胞内源核昔酸合成自身 D N A , 导致
SI V病毒 自身复制障碍 , 病毒产量下 降 。 ( 2 )
抑制H ut 一78 细胞外源核昔酸通过细胞膜 转 运
致细胞 内 , 从而使 SI V利用外源核昔酸合 成 自
身 D N A间接受限 , 影响 SI V 在宿主 H ut 一 78 细胞
内复制 , 繁殖 , 达到对 S I J 的抑制作用 。
C 5
.
4 7 1 0
.
9 4 2 1
.
8 8 4 3
。
7 5 8 7
. 弓0 1 7亏。 O
c d一 3 e o 劝 。 e n t r a t i o n ( u口 m l )
图 2 兴安升麻皂试对 P H A刺激的人外周血淋巴 细 胞
召 H 一 T d R核普转运的影响 。
参 考 文 献
F i g Z E f f
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o P r a t i o n
b l o o d l y
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S = C l n l
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.
C d d a h u
r
i e a aS po n i sn
.
方药中 。 谈我对升麻的认识 及临床运用经验 . 辽 宁 中
医 杂志 , 19 8 1 ; 5 ( 1 ) “ 3 2
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2 2 4华 西 药 学 杂 志 g 卷
5
抗突变作用 · 癌变 · 畸变 · 突变 , 拍 g乳 5 ( 4 ) : 36
H o m m i H i r o m i e h i
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.
In h i b i t i o n o f ” H -
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V i s n a v i r u s as an i n v i t r o
m o d e l f o r h u 扭a n im m u n o d e f i e i e n e y v i几 s
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T s a i 〔犯 , o t a l . A nt i v i .l a l e f f o e t s o f 3 , 一 a z i d o -
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R e s ea r e h H u m an R ot r o v i ur s e s
, 2 5 5 5 ; 4 : 35 。
I N H I B I T I O N O F S I V I N V I T R O B Y C IM I C I F U G A
D A H U R I C A A N D IT S A C T I O N M E C H E N I S M
L i n X i n C a i Y o u y u X i a o P e i g e n
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A B S T R A C T S i m i a l l D刀 m u n o d e f -
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a s l o w e r e d
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。
八 Z T H tU 一 7 8 e e l l S IV