全 文 ：第４７卷第３期 华中师范大学学报（自然科学版） Ｖｏｌ．４７ Ｎｏ．３
２０１３年６月 ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＨＵＡＺＨＯＮＧ　ＮＯＲＭＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．） Ｊｕｎ．２０１３
收稿日期：２０１３－０１－１９．
基金项目：湖北省自然科学基金项目（２０１２ＦＦＢ０７４０９）．
＊通讯联系人．Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｉｎｅｒ７０＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ．
文章编号：１０００－１１９０（２０１３）０３－０３４８－０５
野木瓜三萜皂苷类化合物抗炎活性研究
张　伦１，杨光忠１，欧泽亮２，杨　芳１，王德彬１＊
（１．中南民族大学 药学院，武汉４３００７４；
２．拜尔斯道夫日化有限公司 研发部，武汉４３００５６）
摘　要：为了研究野木瓜藤茎中三萜皂苷类化合物的抗炎活性，以ＬＰＳ诱导ＲＡＷ２６４．７细胞建立
细胞炎症反应模型，采用Ｇｒｉｅｓｓ法检测一氧化氮（ＮＯ）含量；酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测ＩＬ－
１β含量；Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８荧光染色观察细胞凋亡形态。结果表明：从野木瓜藤茎的正丁醇提取物中
得到两个皂苷类化合物均可显著抑制ＮＯ释放；其中化合物１可显著抑制ＩＬ－１β产生，且能观察到
明显的细胞凋亡现象，两种皂苷化合物均具有一定的抗炎活性．
关键词：野木瓜；三萜皂苷；ＮＯ；ＥＬＩＳＡ；抗炎活性
中图分类号：Ｏ６２９．６ 文献标识码：Ａ
　　野木瓜又名假荔枝根、假荔枝、绕绕藤、沙
藤，为木通科野木瓜属植物［１］．其根、茎、叶具有
祛风止痛及舒筋活络的功效，临床用于各种手术
止痛及肿瘤止痛，对风湿痛、各种神经性头痛、腰
椎骨质增生等疗效显著［２］．野木瓜中含有丰富的
皂苷，主要包括去甲五环三萜皂苷类化合物［３－６］、
木脂素类化合物［７－８］和黄酮苷类化合物［９］，此外，
还含有多糖、酚类化合物［１０－１１］等．已有研究表明
野木瓜注射液具有抗炎镇痛作用［１２－１３］．本课题组
前期从野木瓜藤茎正丁醇部位分离得到的两个
三萜皂苷类化合物１、２，已有文献对化合物１做
了初步的抗肿瘤研究［１４－１５］，化合物２的活性研究
未见报道．因此，本研究拟对这两个三萜皂苷类
化合物进行抗炎活性筛选，并探讨其可能存在的
机制．
图１　化合物的结构
ａ．化合物１；ｂ．化合物２
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
ａ．３－Ｏ－α－Ｌ－ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→２）－α－Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－ｈｅｄｅｒａｇｅｎｉｎ；
ｂ．３－Ｏ－α－Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→３）－α－Ｌ－ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１→２）－α－Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－ａｋｅｂｏｎｉｃ　ａｃｉｄ
　第３期 张　伦等：野木瓜三萜皂苷类化合物抗炎活性研究 ３４９　
１ 材料与方法
１．１ 细胞株
小鼠巨噬细胞ＲＡＷ２６４．７由本室冻存．
１．２ 材料和试剂
野木瓜藤茎购自广西南宁，经广西壮医医院副
主任药师黄锦威鉴定为木通科野木瓜属植物，化合
物１和２为课题组从其正丁醇提取物中分离出来，
它们的结构经１　Ｈ　ＮＭＲ，１３Ｃ　ＮＭＲ和 ＥＳＩＭＳ确
证［６，１４］．ＬＰＳ、地塞米松、Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８（美国ｓｉｇｍａ
公司）；胎牛血清（四季清公司）；ＤＭＥＭ培养基（美
国Ｇｉｂｃｏ公司）；Ｇｒｉｅｓｓ试剂盒（碧云天公司）；小鼠
ＩＬ－１β试剂盒（达科为生物技术有限公司）；其余试
剂均为国产分析纯．
１．３ 仪器
Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００ 型 酶 标 仪； ＤＦＣ４２５Ｃ
（１２７３０２２２）型荧光倒置显微镜．
１．４ 方法
１．４．１ ＲＡＷ２６４．７ 细 胞 培 养 及 传 代 　 小 鼠
ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞加入含 １０％ 胎牛血 清、
１００Ｕ／ｍＬ青霉素和链霉素的ＤＭＥＭ 培养基，置
于含５％ＣＯ２、３７℃恒温培养箱中培养．细胞生长
至７０％～８０％融合后进行传代，１～２ｄ换液１次，
３～４ｄ传代１次．
１．４．２ＭＴＴ法检测药物对细胞活性的影响　按文
献［１６］中的 ＭＴＴ法，测定化合物１，２对小鼠巨噬
细胞ＲＡＷ２６４．７的细胞毒活性．将生长状态良好
的ＲＡＷ２６４．７细胞以每孔９５μＬ（约１×１０
４ 个）传
代培养于９６孔板中，置于含５％ＣＯ２、３７℃恒温培
养箱中培养２～３ｈ，细胞贴壁后，加入不同浓度的
化合物５μＬ，使其终浓度达到０，２．５，５，１０，２０，４０，
８０μｍｏｌ·Ｌ
－１．溶剂对照组不加化合物，但加入
ＤＭＳＯ使其终浓度为０．２％（与高浓度化合物所含
的ＤＭＳＯ终浓度相同）．每组４个复孔．３７℃，５％
ＣＯ２ 的恒温培养箱中培养７２ｈ后，加入 ＭＴＴ孵
育４ｈ后，弃上清，每孔加入ＤＭＳＯ　１５０μＬ，震荡
１０ｍｉｎ，在４９２ｎｍ处检测吸光度Ａ４９２．
１．４．３实验分组　将ＲＡＷ２６４．７细胞悬液调整浓
度为１×１０４ 个／孔，加入９６孔板内，每孔８５μＬ，每
组４个复孔，置３７℃、５％ＣＯ２孵箱培养．根据ＭＴＴ
检测结果，实验分为６组．各组处理方法：①正常
组，只加培养基培养；②模型组，只加ＬＰＳ，终浓度
为１０μｇ／ｍＬ；③阳性对照组，分别加入终浓度为
１０μｇ／ｍＬ　ＬＰＳ和１０μｍｏｌ·Ｌ
－１地塞米松；④低、
中、高剂量组，分别加入终浓度为１０μｇ／ｍＬ　ＬＰＳ
和５、１０、２０μｍｏｌ·Ｌ
－１化合物．
１．４．４Ｇｒｉｅｓｓ法测定一氧化氮含量　按照１．４．３
处理，培养７２ｈ后取细胞上清液采用Ｇｒｉｅｓｓ法，按
ＮＯ检测试剂盒说明书操作．
１．４．５ＥＬＩＳＡ检测ＩＬ－１β含量　根据Ｇｒｉｅｓｓ法检
测结果，选取化合物１按照１．４．３处理，培养７２ｈ
后取细胞上清液采用ＥＬＩＳＡ法，按试剂盒说明书
操作．
１．４．６Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８荧光染色对细胞凋亡形态学
观察　通过 Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８荧光染色法观察化合
物１促进炎性细胞凋亡的作用．按照１．４．３处理，
培养７２ｈ后弃上清，Ｄ－Ｈａｎｋｓ溶液洗一遍（尽量不
吹打），加入固 定 液 （甲 醇∶冰 醋 酸 ＝３∶１）
２００μＬ／孔，４℃处理５ｍｉｎ后用 Ｄ－Ｈａｎｋｓ溶液洗
一遍（尽量不吹打），加入５μｇ／ｍＬ　Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８
染液５０μＬ／孔，３７℃孵育１５～３０ｍｉｎ后，置于荧光
倒置显微镜下观察，拍照．
１．４．７ 统计学分析　数据用ｘ±ｓ表示，采用
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ统计软件，多组间比较采用单因素
方差分析，组间比较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５为有统
计学意义．
２ 结果与分析
２．１ 药物对细胞活力的影响
ＭＴＴ实验结果显示，化合物 １，２ 在 ０～
２０μｍｏｌ·Ｌ
－１浓度对ＲＡＷ２６４．７细胞活力的影响
与空白对照组相比，均无显著性差异．说明化合物
１，２在这个浓度范围内对 ＲＡＷ２６４．７细胞无毒
性，该结果为后续试验提供依据，本研究所使用的
药物有效浓度，均在这一浓度范围之内．
２．２ 化合物１，２对炎性细胞ＮＯ释放的影响
图２ａ显示不同浓度化合物１对 ＬＰＳ刺激
ＲＡＷ２６４．７细胞释放ＮＯ的影响；图２ｂ显示不同
浓度化合物２对ＬＰＳ刺激 ＲＡＷ２６４．７细胞释放
ＮＯ的影响．由图２可知，正常组中ＲＡＷ２６４．７细
胞上清液ＮＯ水平很低，给予１０μｇ／ｍＬ　ＬＰＳ诱导
７２ｈ后，ＮＯ水平显著增加．而实验组 ＮＯ释放受
到明显抑制，并呈现一定的剂量依赖关系，化合物
１，２在高剂量２０μｍｏｌ·Ｌ
－１时抑制ＮＯ释放的强
度高于阳性对照药地塞米松（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１），且
在高剂量时化合物１表现出较强的活性．
３５０　 华中师范大学学报（自然科学版） 　　第４７卷
图２　不同浓度化合物对ＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７细胞释放ＮＯ的影响
（与正常组比较：＊＊Ｐ＜０．０１；与模型组比较：＃＃Ｐ＜０．０１）
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ＮＯ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｉｎ　ＲＡＷ２６４．７ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＬＰＳ
（Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ：＊＊Ｐ＜０．０１；Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ：＃＃Ｐ＜０．０１）
２．３ 化合物１对炎性细胞ＩＬ－１β产生的影响
ＩＬ－１β的分泌与药物的浓度呈剂量依赖性关
系，药物高浓度对ＩＬ－１β的抑制率最高，随用药浓
度的降低对ＩＬ－１β的抑制率逐渐下降．与模型组相
比，化合物１在高、中、低三个浓度均对ＩＬ－１β的产
生有强抑制作用，显示出强的抗炎活性．结果见
图３．
图３　不同浓度化合物１对ＬＰＳ刺激
ＲＡＷ２６４．７细胞释放ＩＬ－１β的影响
（与模型组比较：＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１）
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ＩＬ－１βｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎ　ｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　１　ｉｎ　ＲＡＷ２６４．７ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＬＰＳ
（Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ：＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１）
２．４ 化合物１促进炎性细胞凋亡的形态学观察
图４ａ、４ｂ分别为正常组、炎症模型组细胞形
态，细胞呈微弱荧光；图４ｃ～４ｆ分别为阳性对照
组、高浓度组、中浓度组、低浓度组细胞形态，其
中正常细胞呈微弱荧光，凋亡细胞呈强蓝色荧光
且染色体固缩．给予不同浓度药物可以观察到不
同程度的细胞凋亡现象，高浓度组观察到了大量
发出高亮荧光的固缩染色体，有明显的细胞凋亡
现象．
图４　皂苷化合物１促进炎性细胞凋亡的形态学观察
（４ａ：正常细胞组；４ｂ：ＬＰＳ诱导组；４ｃ：地塞米松组；
４ｄ：高浓度组；４ｅ：中浓度组；４ｆ：低浓度组）
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　１　ｉｎ
ＲＡＷ２６４．７ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＬＰＳ
（４ａ：ｎｏｒｍａｌ　ｃｅｌ　ｇｒｏｕｐ；４ｂ：ＬＰＳ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｒｏｕｐ；
４ｃ：ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ　ｇｒｏｕｐ；４ｄ：ｈｉｇｈ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ；
４ｅ：ｍｅｄｉｕｍ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ；４ｆ：ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ）
３ 讨论
巨噬细胞是重要的抗炎免疫细胞，它在非特异
性免疫、体液免疫以及肿瘤免疫等方面起着重要作
　第３期 张　伦等：野木瓜三萜皂苷类化合物抗炎活性研究 ３５１　
用．ＬＰＳ是巨噬细胞最有效的激活剂，ＬＰＳ诱导的
ＲＡＷ２６４．７细胞模型已经被广泛用于炎症反应研
究．当ＲＡＷ２６４．７细胞受到ＬＰＳ的刺激时，可分
泌大量炎症因子．ＩＬ－１β是激活的巨噬细胞分泌的
主要炎症因子之一，在炎症和免疫反应中发挥非常
重要的作用；一氧化氮（ＮＯ）是具有生物活性的气
体分子，是细胞间信息传递的重要调节因子，并有
介导细胞免疫和炎症毒性的功能．ＮＯ的过量生成
与炎症密切相关［１７］，在急性炎症部位，致炎物质和
炎症介质可诱导或增加ＮＯ的合成和释放，ＮＯ本
身具有细胞毒性，还能与游离基团反应生成如
ＯＮＯＯ－等的分子，导致毒性增加，从而促进炎症
部位渗出和水肿［１８］．本实验采用 ＬＰＳ诱导小鼠
ＲＡＷ２６４．７细胞建立炎症细胞模型，通过观察野
木瓜三萜皂苷类化合物１、２对炎性细胞产生
ＮＯ、ＩＬ－１β的影响，发现两种化合物均剂量依赖
性抑制 ＮＯ 释放，且化合物１能抑制ＩＬ－１β的
产生．
在炎症反应过程中，中性粒细胞和其它的滞留
细胞通过凋亡机制，在膜完整状态下被巨噬细胞识
别和清除，从而避免继发的炎症反应．凋亡，是机体
调控炎症反应的发展和防止炎症后组织器官损伤
与瘢痕形成的重要机制．近年来发现急性胰腺炎与
胰腺腺体细胞凋亡有关［１９－２１］，细胞凋亡参与了急
性胰腺炎的发病［２２－２３］．在众多研究中也发现炎症
时细胞损伤释放的一些无机小分子、细胞因子、炎
症介质及毒性物质作用均会影响细胞的凋亡．这些
细胞活性分子及一些应激因素参与细胞的凋亡过
程，在引导细胞凋亡的基因调控方面具有重要的意
义［２４］．本研究观察到不同浓度化合物１均可促进
炎性细胞发生凋亡，且高浓度时细胞凋亡明显，推
测可能是炎症反应中炎症灶内 ＮＯ、ＩＬ－１β等炎症
因子促进细胞凋亡，限制了炎症反应的扩大．
本文通过野木瓜两种三萜皂苷化合物抑制炎
性细胞ＮＯ，ＩＬ－１β等炎症因子的释放进行抗炎活
性筛选，两种三萜皂苷化合物均具有一定的抗炎活
性，其中化合物１具有较强的抗炎活性，其发挥抗
炎作用的机制可能是通过抑制炎性因子的释放进
而促进炎性细胞的凋亡来实现的，本研究为进一步
探讨野木瓜抗炎活性成分奠定了基础．
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３５２　 华中师范大学学报（自然科学版） 　　第４７卷
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ｆｒｏｍｓｔａｕｎｔｏｎｉａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ
ＺＨＡＮＧ　Ｌｕｎ１，ＹＡＮＧ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｎｇ１，ＯＵ　Ｚｅｌｉａｎｇ２，ＹＡＮＧ　Ｆａｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｄｅｂｉｎ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗｕｈａｎ　４３００７４；
２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ　Ｈａｉｒ　Ｃａｒｅ，Ｗｕｈａｎ　４３００５６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｆｒｏｍ
ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ．Ａ　ｃｅｌｕｌａｒ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ＬＰＳ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ＲＡＷ２６４．７ｃｅｌ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂ－
ｌｉｓｈｅｄ，ｔｈｅ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）、ＩＬ－１βｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｇｒｉｅｓｓ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ＥＬＩＳＡ，ａｐｏｐｔｏ－
ｓｉｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｗｏ
ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｓｔｅｍ　ｏｆ　ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｒｅ－
ｌｅａｓｅ　ｏｆ　ＮＯ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ１　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　ＩＬ－１βａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ
ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ；ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ　ｓａｐｏｎｉｎｓ；ＮＯ；ＥＬＩＳＡ；ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ａｃｔｉｖｉｔｙ