全 文 ：一九 /又八年 蟹 南 理 医 学 报 第三期
王瓜根蛋白的柱层析分离
及其杭生育作用
吴伯 良 带卢祥明 带 辛范广胜
( 生物学系 )
罗玉香 刘杰森 马增杰
( 生殖免疾中心 )
摘 要
应 用 A m b e r l i t 。 一 IR C .5 0柱 层析分 离纯化王瓜根抗早孕蛋白 , 图谱显示杭早孕蛋白
达到基线分 离 , 用 SD S · P A G E 不连续电泳证实是 电泳纯 。 应 用本工艺 生产的王瓜根
杭早孕蛋白作小 白 鼠杭着床试验 , 其E D : 。 。 ( 1 0 0 %抑制率 ) 为 1 . 5 0 9 / k g , 是 结 晶
天花粉 E D , 。 。 ( 10 0 9 / k g) 的 6 倍 以上 , 提示这种蛋白有可 能作妇女房事后避 孕的新
药 。 对应用王瓜杭早孕蛋白注射后 的小 白 鼠子宫作 组织 学鉴定 , 由显微组 织切 片显
示王瓜根杭早孕蛋白较天花粉蛋白作 用强 , 子宫组织 发生 了变化 。 用王 瓜根做杭早
孕蛋白 口服试验 , 也证实其效果好 。 这提示 王瓜根蛋 白可 制成 简便 口服避孕片 。
关键词 : 柱层析 ; 杭 着床 ; 抗早孕 ; 避孕 ; E D 、 。 。 ( 1 0 0%妊垠抑制率 ) ; H E 染 色
1 前言
1 9 8 7年报导了应用大剂量留体激素作为房事后应急用药 , 但由于 剂 量 大 而产 生 副 作
用 “ { 。 目前国内外 已十分重视抗早孕药与事后用药的研究 ! 2 ’ 。 我国古籍医书对于抗早孕的
草药有大量记载和论述 , 例如天花粉和王瓜根 。 我国从六十年代开始对天花粉进行生化和药
理研究 ’ 3 ’ , 一直延至今天 , 从不间断 。 但天花粉应用于临床表现出较强的副作用 , 故 目 前
不受欢迎 。 为寻找药效显著而副作用小的中草药 已是 当务之急 。 古书 _ L记载的王瓜根抗早孕
较夭粉多 , 如 《千金方》 「摇 ’ 和 《千金翼方》 ’ 日 1列为 “ 主癖血月闭药 ” ,而 《本草纲 目》
则指明是堕生胎药 。 近年出版的 《香港中草药 》 ’ 7 ’ 也将其列为 “ 还月水药 ” 。 日本对 王 瓜
的研究也十分重视 , 对其植物化学成分作了系统的分析 ’ ` 一 ` 。 ’ 。
2 材料
2
.
1 王瓜根
为自己种植 , 秋冬采集 , 存放在 · 20 ℃低温水箱中备用 ; 结晶夭花粉注射液为巾国 科 学
院 上海生化所孙册研究员所赠 。
2
.
2 主要制剂
琉基乙醇和考马斯亮兰R Z 。 。是 lF u ka 公司生产 ; N , N , N , N , 一四甲基 乙胺是美国 S工G M A
公司生产 ; 十二烷基硫酸钠 (S D )S 由瑞典进 口分装 ; 其余化学试剂为国产分析纯级 。
收稿时 I’q : 1 9 8 7一 1 0一 1 7
带卢祥明 为 1 9 8 7年生物工程毕业班学生 , 在毕业论文设计谈程中参加本文试验
” 范广胜 为 1 9 8 7年生物化学研 究失
第3 期 王瓜根蛋白的一柱层析分 离及其抗生育作用
2
.
3 主要仪器
低温工作室 、 恒流泵为瑞典的 L K B公司制造 , 板电泳槽为瑞典 U p p s al a大学研制 ; 紫外
分光光度计是 日本 日立公司制 , 低温冷冻高速离心机是 D u oP n t 公司制 ,其余组织捣碎 机 、
台式高速离心机 、 自动部分收集器 、 核酸蛋白检测仪均为国产 。
3 方法
3
.
1 分级沉淀提取方法
用新鲜主瓜根捣碎 、 压汁 、 过滤去渣 , 按汪绍福制备天花粉蛋白 ’ 3 的工艺稍改 而 成 。
3
.
2 柱层析分离
采用新鲜王瓜根 , 先洗净去皮 , 切成薄片 , 用组织捣碎机打浆 , 过 2 0 目尼龙 网 筛 , 压
滤 , 去渣 , 取原汁放冰箱自然沉淀 30 分钟 , 4 ℃下低温离心 5 0 0。: p m l/ s m in , `去沉淀 , 上清
入透析袋中 , 用聚乙二醇 (分子量 2 万 ) 约浓缩 15 倍 , 冲洗透析袋 , 用蒸馏水透析 , 每 4 小
时换水一次 , 共换水 6 次 , 全过程在 4 ℃低温下拌搅完成 。 取 A m b e r il et IR C 一 50 离子 交换
树脂 2 9 , 用水洗净 , 用 I Om l的一ZN 盐酸处理 , 水洗至中性 , 然后加入 ZN的氢氧化 按 20 m l , 加
热至 60 ℃ , 揽拌处理 1 小时 , 倾去氨液 , 用水洗至中性。 如此重复 3 次 , 即可进行装柱 。 取
g1 处理好的树脂装微型柱 , 柱长 1 oc m , 口 径 l o m , 装柱前先把树脂抽气 , 用蒸馏水平衡 。 调
好流速 , 每 IJ n l八 。m in , 自 动收集器 1管八 o分钟 , 上样量为 6 0 m g 蛋白 。 上样后 , 先用 蒸馏
水洗脱 , 收集到第 1 、 2 、 3峰 , 然后改为 o . 06 N磷酸氢二钠一 o . 4M氯化钠洗脱 , 收集到第 4 、 5 、
6
、
7等四个峰 。 经 SD S · p A G E 电泳分析第 2 、 3等二个峰为多组分峰 , 而 4 、 5 、 6 、 7峰为单一成分 ,
其中第 6 峰含量较多 , 故取此峰做抗早孕试验和电泳鉴定 , 结果证实相当于丙酮分级沉淀的
有效组分 。
3
.
3 不同组分杭早孕试验
取 20 克体重健康成熟的昆明种小白鼠 , 按雌雄鼠 2 : 1合笼 , 每天上午检查雌鼠阴 道 , 以
发现有阴道栓为第一天 , 于妊娠 4 一 6 日 , 在雌鼠腹部皮下分别注射丙酮分级沉淀组分和柱
层 析不 同峰的组分 , 每组分 1。只小白鼠 , 每天注射一次 , 连续三天 , 于妊娠 8 一 12 天解剖 ,
记录妊娠动物数 。 对照组注射生理盐水代替王瓜抗早孕蛋白 , 方法同上 。
3
.
4 对比试验
取 20 克体重健康成熟的昆明种小白鼠 1 0 只 , 按雌雄鼠 2 : 1 合笼 , 用上述方法确诊妊娠
4 一 6 夭之后 , 分为 9 组 , 每组 10 只 , 第 1 、 2 、 3 、 4组注射王瓜抗早孕蛋白 , 其剂量依次为
3 m g / k g
、
1
.
s m g / k g
、
o
.
37 5 m g / k g
; 第 5 、 6 、 7 、 8 、 9组注射结晶天花粉针剂 , 其剂量依 次
为 1 0 , n g / k g 、 s m g / k g 、 2 . s m g / k g 、 1 . 2 5m g / k g 、 o . 6 2 5 m g / k g , 第 10组为对照 组 , 用 生 理
盐水代替药剂 , 注射方法如上 , 重复实验一次 , 把二次结果统计 。
3
.
5 小白鼠子宫组织学实验
于妊娠 8 一 12 天 之后处死小白鼠 , 沿腹中线打开腹腔 , 游离出子宫 , 记录怀孕胎数 , 用
波恩氏液 固定子宫 , 常规石蜡包埋 , 连续切片 6 , m , 用 E H染色 , 光学显微镜观 察 , 比较天花
粉组 、 王瓜组和对照组小白鼠子宫组织变化 , 并作显微摄影 。
3
.
6 有效期观察
取昆明种小白鼠 30 只 , 按上述方法雌雄配对 、 妊娠检查和分组 , 每 组 10 只 。 第 一 组 用
A m b e r il et I RC 5 0柱层分离的第 2 峰 , 按 1 , s m g / k g 剂量作腹部皮下注射 (于妊娠 4 一 6 天
里 南 理 医 学 报 1 9 8 8 年
后 ) , 连续 3 天 ; 第二组改为注射第 6 峰 ; 第三组注射生理盐水为对照组 。 妊娠 20 天之后 ,
第三组小白鼠先后产下小鼠 , 记录小鼠数。 而第一 、 二组由于完全抑孕 , 故在实际检测已妊
娠 25 天之后 , 再次按雌雄 2 : 1配对 , 记录妊娠时间 , 于妊娠 4 一 6 天之后 , 抽出雄鼠 , 继续
饲养 12 天 , 分别处死第一 、 二组小白鼠 , 游 离子宫 , 用波恩氏液 固定 , 作迸一步组织学鉴定
实验 。
3
.
7 口服抑孕试验
取小 白鼠 30 只 , 按上述方法雌雄配对 , 检查妊娠 4 一 6 天之后 , 于早上灌服王瓜抗早孕
蛋 白30 m g / k g , 连续 3 天 , 对照组则灌服生理盐水 l m l代替 。 于妊娠 10 一 1 2天剖腹检查怀 孕
胎数 , 并作组织学实验 。
4 结果和讨论
4
.
1 图谱分析
图 l 王瓜根蛋白柱层 分离图谱
4
.
2 峰 6 的 E D , 。 。测定
下面图 1 中图谱显示 7 个峰 , 经分析 ,
其中第 1 峰是假峰 , 第 2 峰是柱没有交换的
蛋 白质混合物 , 第 6 峰是 有 效 峰 , 电泳纯
(见图 3 ) 。第 2 峰在 20 分钟后收集 , 每 10 分
钟 1 管 。 第 6 有效峰收集 3 0一 3 4管 , 即在 5
小时至 5 时40 分钟可以分离纯化有效王瓜抗
早孕蛋白 , 总收得率为丙酮分 级 沉 淀法的
1
.
2倍 。
为了便于和周美华 ” ` 等关于天花粉抗早孕试验作比较 , 故把试验结果列表于后 :
附表 王瓜根抗早孕蛋白与天花粉蛋白抑孕比较
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辛害验三周 过程 中 , 部分少 白鼠逃走 或死亡 , 故只能用实际存活数来统计
从表 1结果显示王瓜根抗早 孕蛋白E D , 。 。为 1 . s m g / k g , 而 结 晶 天 花 粉 蛋 白 E D , 。 。为
1 0m g / k g
, , 王瓜蛋白的抑孕效采优于结晶天花粉蛋 白 。 从图 2 照片可见 : 由王瓜根抗早孕蛋
白所致的小白鼠子宫外形变得非常纤细 , 约为正常未怀孕子宫的 1 / 3一 1 / 4; 而天花粉引产蛋
白所致的小白鼠子宫则比正常未怀孕的小白鼠子宫略小 。 至于对照组的小白鼠子宫 , 则明显
可见子宫内的幼仔 。
图 Z A
l 号和 2 号小 白鼠表示注 射天花粉引产
蛋白 ; 3 号和 4 号小 白 鼠注射 王 瓜杭早
孕蛋白 ; 5 号 6 号小 白 鼠注射生理盐 水
时照组 , 可 明 显 看到怀孕的小 白鼠 。
图 Z B
左 1 为注舫 天花粉引产蛋白的子宫
中 2 为正常未怀孕小 白 鼠子宫
右 3 为注 射王瓜古闷元早孕蛋白 的子宫
4
.
3 小白限子宫组织学鉴定
经光学显微镜检查. , 可见子宫腔在正常 `清况下较大 , 腔内有大量中性粒 细 胞 , 腺 体 多
数 , 整个切片可见 8 一 9 个腺体 , 子宫内膜为增殖期 ; 经注射天花粉引产蛋 白的 ,\J’ 白鼠子宫
腔缩小 , 子宫内膜为增殖期 , 内膜上皮为柱状细胞 , 间质细胞肥大 , 胞浆丰富 , 呈早期蜕膜
细胞样变 , 腺体减少 , 整个切片见 5 一 7 个腺休 ; 一 经王瓜抗早孕蛋白注射后的小 白鼠子宫腔
消失 , 即在 x 1 00显微镜下仍不见官腔 , 内膜几乎完全相贴厂各层细胞较为致密 。 用 40 0倍目
镜 x 4 0 倍物镜可见子宫内 膜 柱状 上 皮细
胞 , 间质细胞致密呈菱形 , 腺体少数 , 整个
切面仅见 1 ~ 2 个腺体 。 以上描述 , 均可以
在显微组织切片的照片检出。 由此可见
瓜抗早孕蛋白对小 白鼠子宫组织的作用
,
,王
忐 !
起子宫组织学的变化较天花粉弓}产 `蛋白强 , 1
这提示王瓜抗早孕蛋白有更好的药用效果 ,
并且足以说明为什么王瓜抗早孕蛋白 E D : 。 。
是 2 . 5 0 9 /k g , 而天花粉 E D 工。 。是 l o m g / k g 。
至于药理学的实验 , 有待今后进一步深入研
究 。
左 I 为王 瓜根蛋 白 A m b 。 : J j le
柱层析第 2 峰 , 中 2 为王瓜根
蛋 白原液 ; 右 3 为王瓜根杭早
孕蛋白 , 即柱层析第 6 峰 。
图 3
处 南 理 医 学 报 1 98 8 年
图 4
: A正常小 白鼠子宫横 B 注射结晶天花粉 C注扮王瓜抗早孕
切 显微照相 , 放 大 蛋 白的小 白鼠子 蛋白 的小 白鼠子
3 1
,
2 5倍 宫横切 显徽照相 , 宫横切 显微照相 ,
放 大 31 . 25 倍 放 大 31 . 25 倍
4
.
4 抑孕期鉴定
注射 A m be r l i et IR C 一 50 柱层析第 2 峰和第 6 峰可 以使小白鼠抑孕已经可以肯定 , 因 为
经过 20 多天的观察 , 20 只小白鼠无一生育 。 为了进一步鉴定王瓜根蛋白的抑孕作用 , 我们将
其重新按雌雄 2 , 1合笼 , 检查证实妊娠后再观察 12 天 , 发现注射第 6 峰的 10 只小 白鼠有 2 只
怀孕 , 而注射第 2 峰的小白鼠无一怀孕 。 处死小 白鼠 , 检查子宫组织变化。 结果注射第 6 峰
的小白鼠子宫组织基本恢复正常 , 外形也与正常子宫大小无异 , 但注射第 2 峰的则只有 75 %
有所恢复 , 有 25 %外形纤细 , 子宫组织与开始注射的情况基本相同 。 由此可见 , 柱层析分离
峰 2 和峰 6 抗早孕效果相同 , 而有效期则仍然有差异 。 从电泳测定第 2 峰是混合组分 , 分子
量较大 , 到底是混合物的协同作用所影响 , 还是分子量较大所致? 有待进一步探讨 。
.4 5 口服试验效果
经试验证明口服同样可取得抗早孕效果 。 无论柱层析峰 2或峰 6 , 其 E D , 。 。都在 30 m g / k g
之下 。 关于作用时间我们观察到口服峰 2 或峰 6 王瓜根蛋白 8 小时之后即可引起小白鼠自然
流产 , 胎盘完整排出 。 子宫组织学的变化和注射方法的效果相似 , 说明可作为良好的事后用
药 , 同时也证实了古籍医书的论述是正确的 。
切 片工作 由陈淑群 同志完成 , 照相 由戴云 同志完成 , 谨表谢意
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P er P a ar t i on
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R a d i x T r i e h o s a n *h i s p r o t e i n s s i n e e 19 7 3
.
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