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超声提取黔产金耳环总黄酮的工艺优化



全 文 :书 [收稿日期] 2013-06-28;2013-12-05修回
 [基金项目] 贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目“水药骂广瓦止咳祛痰作用的实验研究”[黔省专合字(2010)156];贵州省黔南州
科技局资金项目“水药骂广瓦的质量控制研究”[黔南科合社字(2010)18]
 [作者简介] 魏学军(1972-),男,副教授,从事中药、民族药质量控制及开发研究。E-mail:qndywxj@163.com
[文章编号]1001-3601(2014)02-0104-0169-04
超声提取黔产金耳环总黄酮的工艺优化
魏学军,林先燕,夏亚兰,许义红,余跃生
(黔南民族医学高等专科学校,贵州 都匀558001)
  [摘 要]为获得较高的金耳环总黄酮,选取液固比、乙醇浓度、提取时间、提取次数为考察因素,以总黄
酮得率为评价指标,采用正交试验对其超声提取工艺进行优化。结果表明:黔产金耳环总黄酮最佳提取工艺
参数为液固比40∶1,乙醇浓度60%,提取3次,每次30min,该条件下的提取率为4.60%;不同产地金耳
环总黄酮含量以黔南地区荔波产最高,含量为4.68%。
[关键词]金耳环;总黄酮;超声提取;工艺优化;贵州
[中图分类号]S37 [文献标识码]A
Optimization of Ultrasonic Extraction Process of Total Flavonoids
in Asarum insignein Guizhou
WEI Xuejun,LIN Xianyan,XIA Yalan,XU Yihong,YU Yuesheng
(Qiannan Medical College for Nationalities,Duyun,Guizhou558001,China)
  Abstract:To get the highest content of total flavonoids in A.insigne,taking the ratio of liquid-solid,
ethanol concentration,extraction time and times as the examining factors,and yield of total flavonoids as
the evaluation index,the authors optimized its ultrasonic extraction process by orthogonal experiment.
The results indicated that the optimum extraction parameters of A.insigne were as folows:the ratio of
liquid-solid 40∶1,ethanol concentration 60%,extracted for 3times,each time lasted for 30min.Then its
extraction rate was 4.60%.The total flavonoids of A.insigne originated from Libo had the highest
content for 4.68%.
Key words:Asarum insigne;total flavonoids;ultrasonic extraction;process optimization;Guizhou
   金耳环为马兜铃科植物 (Asarum insigne
Diels)金耳环的干燥全草,主要分布在我国南方各
省,具有温经散寒,祛痰止咳,散瘀消肿,行气止痛的
功效,含有黄酮类、氨基酸、糖类和挥发油等成分[1]。
由于疗效显著,采集方便,在贵州三都水族集聚地被
广泛用于风寒感冒、慢性支气管炎、慢性胃炎、风寒
痹痛和细菌性痢疾等疾病的治疗。黄酮类成分作为
中草药中重要的活性物质,在抗氧化、抗菌、抗肿瘤、
抗抑郁、增强机体免疫和保护心肌等方面具有显著
疗效[2-6],对金耳环总黄酮进行提取,可为相关的研
究提供试验用药,对开发和利用贵州这一资源丰富
的天然植物具有重要意义。超声提取是利用溶剂和
样品之间产生声波空化作用,导致溶液内气泡的形
成、增长和爆破压缩,使固体样品分散,增大样品与
提取溶剂之间的接触面积,从而提高目标物从固相
转移到液相的传质速率,具有节约溶剂、选择性好、
产率高、时间短等特点,是目前从天然植物中提取黄
酮类活性成分的一种较好方法[7-9]。试验以总黄酮
得率为评价指标,对黔产金耳环超声提取工艺进行
探讨,同时对不同产地金耳环总黄酮含量进行测定,
可为临床应用和产地加工提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 金耳环 药材2011年8月中下旬采自贵
州省黔东、黔南、黔西及黔北 4地区的不同市县
(表1),工艺优化样本采自贵州三都县境内,各样本
经贵阳中医学院李江教授鉴定为马兜铃科植物As-
arum insigne Diels金耳环的干燥全草,药材样本保
存于本校中药标本室。
1.1.2 仪器及试剂 Cary 100型双光束紫外可见
分光光度计(安捷伦科技有限公司),SY-1000型超
声波提取仪(北京西化仪科技有限公司),AE 240型
电子天平(瑞士 Mettler),芦丁标准品(中国食品药
品检定所,批号:100080-200707),其他试剂均为分
析纯。
1.2 超声提取工艺的优化
1.2.1 不同因素对金耳环总黄酮提取的影响
1)乙醇浓度。取样5份(过2号筛的金耳环干
燥粉0.5g,下同),采用50%、60%、70%、80%、
 贵州农业科学 2014,42(2):169~172
 Guizhou Agricultural Sciences
  表1 金耳环样本的基本情况
 Table 1 Sample information of A.asigne
采集时间
Colecting time
地域
Region
产地
Habitats
海拔/m
Elevation
土壤类型
Soil type
8月10日 黔北 桐梓松坎 1 100 黄壤
8月11日 赤水天台 1 230 紫壤
8月13日 务川都濡 950 黄壤
8月15日 黔东 江口双江 750 黄壤
8月16日 天柱兰田 600 紫壤
8月17日 黎平德凤 800 红壤
8月19日 黔西 水城玉舍 2 350 红壤
8月21日 晴隆马场 2 000 石灰土
8月23日 织金中寨 2 200 黄壤
8月25日 黔南 三都打鱼 750 石灰土
8月26日 荔波甲良 450 黄壤
8月27日 罗甸边阳 500 黄壤
90%乙醇在液固比30∶1、提取时间30min和提取
次数1次的条件下进行提取,按1.2.4进行测定。
2)液固比。取样5份,在乙醇浓度70%、提取
时间30min和提取次数1次的条件下,分别采用
10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的液固比提取,
并测定。
3)提取时间。取样5份,在乙醇浓度70%、液
固比30∶1和提取次数1次的条件下,分别提取
10min、20min、30min、40min和60min。
4)提取次数。取样3份,在乙醇浓度70%、液
固比30∶1和提取时间30min的条件下,分别提取
1次、2次和3次。
1.2.2 最佳提取工艺的确定 经单因素试验考
察,选取乙醇浓度(A)、液固比(B)、提取时间(C)和
提取次数(D)为影响金耳环总黄酮提取因素,各因
素取3个水平,以L9(34)正交设计进行试验,因素
水平见表2。
表2 金耳环总黄酮提取的因素及水平
  Table 2 Factors and levels of flavonoids extraction
in A.asigne
水平
Factor
乙醇浓度/%
Ethanol
concentration
液固比/
(mL/g)
Liquid-solid ratio
提取时间/min
Extraction
time
提取次数
Extraction
times
1  60  20∶1  20  1
2  70  30∶1  30  2
3  80  40∶1  40  3
1.2.3 验证试验 在正交试验设计求得的最佳工
艺条件下,对样品进行5次平行提取试验,检验方
法的可行性。
1.3 总黄酮的含量测定
1.3.1 样品溶液的制备 将采得的金耳环干燥粉
碎,过2号筛,准确称取0.5g,置于100mL三角瓶
中,精确加入不同浓度的乙醇,浸泡24h,按试验设
计的相应条件进行超声处理后,静置冷却,过滤,滤
液放置冰箱内备用。
1.3.2 对照品溶液的制备 精确称取已烘干至恒
重的芦丁对照品10mg,加入60%乙醇溶液溶解并
定容 至 50 mL 容 量 瓶 中,摇 匀 即 得 浓 度 为
0.2mg/mL芦丁对照品溶液。
1.3.3 标准曲线的制备 分别精密吸取芦丁对照
品溶液0.0mL,0.5mL,1.0mL,1.5mL,2.0mL,
2.5mL,3.0mL置于10mL容量瓶中,加60%乙
醇至5mL,加5%亚硝酸钠溶液0.5mL,摇匀放置
6min,再加10%硝酸铝溶液0.5mL,摇匀放置
5min,加4%氢氧化钠溶液4mL,摇匀放置12min。
芦丁对照品溶液显色后在波长400~700nm进行
扫描,确定最大吸收波长。以未加入芦丁对照品的
溶液为空白对照,在确定最大吸收波长处分别测定
吸光度,并以芦丁浓度(C,mg/mL)为横坐标,吸光
度(A)为纵坐标,绘制标准曲线。
1.3.4 样品的含量测定 将样品液定容至50mL
容量瓶中,再精密吸取2.0mL,参照1.2.3于最大
吸收波长处测定总黄酮,并按下式计算总黄酮得率。
总黄酮得率=(溶出成分质量/药材干重)×100%
1.4 方法学考察
1.4.1 精密度试验 精密吸取1.2.2项下对照品
溶液2.0mL,按1.2.3项下的方法制备,连续测5
次吸光度。
1.4.2 稳定性试验 精密吸取某一供试品溶液
2.0mL,按1.2.3项下的方法制备,分别在0h、
1h、2h、4h、6h、8h测定。
1.4.3 重复性试验 精密吸取某一供试品溶液
2.0mL 5份,按1.2.3项下的方法制备,测定吸光
度。
1.4.4 加样回收率试验 精密称取过2号筛的某
一产地金耳环0.5g 5份,分别加入芦丁对照品适
量,按1.4.1项下制备供试品溶液。精密吸取供试
品溶液2.0mL,按1.2.3项下的方法制备并测定总
黄酮,计算回收率。
2 结果与分析
2.1 最大吸收波长
试验结果表明,芦丁对照品最大吸收波长为
515nm。在该条件下,以芦丁浓度为横坐标,吸光
度为纵坐标作图,得标准曲线(图1)及回归方程A=
1.084 9 C+0.001 1,r=0.999 1,对照品在
0.1~0.6mg/mL线性关系良好。
2.2 不同因素对金耳环总黄酮提取的影响
2.2.1 乙醇浓度 乙醇浓度为50%、60%、70%、
·071·
                                        贵 州 农 业 科 学
                                   Guizhou Agricultural Sciences



/A
Ab
so
rb
an
ce
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
溶液浓度/(mg/mL)
Concentration
图示 芦丁对照品的标准曲线
Fig. The regression curve of rutin
80%和90%的金耳环总黄酮得率分别为1.81%、
1.93%、2.01%、1.89%、1.74%,总黄酮得率在乙醇
浓度超过70%后呈逐渐降低趋势,这与脂溶性杂质
溶出增多,与总黄酮竞争溶剂有关,故选择70%乙
醇作为提取溶剂。
2.2.2 液固比 液料比为10∶1、20∶1、30∶1、
40∶1、50∶1的金耳环总黄酮得率分别为2.37%、
2.84%、3.60%、3.71%、3.82%,总黄酮得率随液固
比的增加而逐渐升高,当液料比超过30∶1后升高
不明显,这与总黄酮的溶出渐趋平衡有关,从缩短浓
缩时间的角度考虑,选择30∶1的液固比最佳。
2.2.3 提取时间 提取时间为10min、20min、
30min、40min和50min的金耳环总黄酮得率分别
为2.20%、2.54%、3.07%、3.15%、3.26%,提取
30min后,总黄酮得率升高不明显,这主要是因为
提取时间过长,乙醇挥发增多,降低了提取溶剂的浓
度,故选择超声提取30min。
2.2.4 提取次数 提取次数为1次、2次和3次的
金耳环总黄酮得率分别为3.53%、4.31%、4.47%,
从节约资源和缩短生产周期的角度考虑,选择提取
2次较适宜。
2.3 金耳环总黄酮的最佳提取工艺
由表3可知,影响总黄酮提取效果的顺序为超
声次数 > 液固比 > 超声时间 >乙醇浓度,分析得
最佳工艺条件为 A1B3C2D3,即以60%的乙醇作溶
剂,液固比40∶1,提取3次,每次30min。在该条
件下,进行5次金耳环总黄酮的提取,其总黄酮的平
均得率为4.60%,RSD值为1.61%,说明优选的提
取工艺是科学、合理的。
2.4 方法学考察
经试验表明,其精密度的相对标准偏差(RSD)
为0.68%,说明仪器精密度好;稳定性的RSD 为
1.08%,表明供试品溶液在8h内稳定;在重复性试
验中,金耳环总黄酮的平均含量为4.60%,RSD 为
0.83%,说明试验重复性好;此外,其加样的平均回
表3 金耳环总黄酮提取的正交试验结果
  Table 3 Orithogonal experents results of flavonoids
extraction in A.asigne
试验号
No.
乙醇
浓度/%
Ethanol
concentration
液固比/
(mL/g)
Liquid-solid
ratio
提取
时间/min
Extraction
time
提取
次数
Extraction
times
得率/%
Yield
1  1  1  1  1  1.65
2  1  2  2  2  3.73
3  1  3  3  3  4.79
4  2  1  2  3  4.56
5  2  2  3  1  2.07
6  2  3  1  2  3.54
7  3  1  3  2  2.48
8  3  2  1  3  3.96
9  3  3  2  1  3.24
K1 10.17  8.69  9.15  6.96
K2 10.17  9.76  11.53  9.75
K3 9.68  11.57  9.34  13.31
R  0.49  2.88  2.38  6.35
表4 贵州不同产地金耳环总黄酮的含量
  Table 4 Total flavones of flowers of A.insigne
from different habitats in Guizhou %
产地
Origin
地域
Region
总黄酮
Total
flavones
平均含量
Average
content
相对标
准偏差
RSD
桐梓松坎Songkan,Tongzi 黔北 3.11  3.11  0.12
赤水天台 Tiantai,Chishui  3.12  0.09
务川都濡 Duru,Wuchuan  3.09  0.06
江口双江Shuangjiang,Jiangkou 黔东 4.35  4.35  0.11
天柱兰田Lantian,Tianzhu  4.38  0.13
黎平德凤 Defeng,Liping  4.32  0.09
水城玉舍 Yushe,Shuicheng 黔西 1.97  1.94  0.05
晴隆马场 Machang,Qinglong  1.94  0.07
织金中寨Zhongzhai,Zhijin  1.91  0.03
三都打鱼 Dayu,Sandu 黔南 4.60  4.61  0.13
荔波甲良Jialiang,Libo  4.68  0.08
罗甸边阳Bianyang,Luodian  4.55  0.10
收率为101.4%,RSD为1.25%,说明准确度符合
分析要求。
2.5 不同产地金耳环总黄酮的含量
由表4可知,不同地域间总黄酮含量具有明显
差异,同一地域不同产地间总黄酮含量差异不明显,
分析原因可能与海拔、土壤、气候、植被状况及采收
时间不同有关。贵州产金耳环总黄酮的含量为
1.94% ~4.61%,以荔波产含量最高,织金产含量
最低。
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 魏学军 等 超声提取黔产金耳环总黄酮的工艺优化
 WEI Xuejun et al Optimization of Ultrasonic Extraction Process of Total Flavonoids in Asarum insigne in Guizhou
3 结论
试验采用正交试验设计对金耳环总黄酮的超声
提取工艺进行优化,确定了超声提取的最优工艺条
件为液固比40∶1,乙醇浓度60%,提取3次,每次
30min。在该条件下,金耳环总黄酮提取率为
4.60%。验证试验表明,此方法提取率高,稳定性
好,可用于金耳环总黄酮的提取。不同产地金耳环
总黄酮含量测定结果表明,各地域间含量差异明显,
以黔南地区产金耳环总黄酮含量最高,而黔西地区
最低,提示在临床应用和产地加工时,金耳环的选择
标准还需与其药理、药效作用研究结果相结合来确
定。
[参 考 文 献]
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(责任编辑:孙小岚)
·271·
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