全 文 ：江西农业大学学报 2013，35(2) :357 － 360 http:/ / xuebao． jxau． edu． cn
Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E － mail:ndxb7775@ sina． com
山蜡梅叶中 3 种黄酮类成分
含量动态变化研究
聂 韡，房海灵，黄丽莉，江香梅
(江西省林业科学院，江西 南昌 330032)
摘要:建立同时测定山蜡梅叶芦丁、槲皮素、山奈酚含量的方法以及分析含量动态变化。采用 HPLC 法测定不
同采收时间山蜡梅叶中芦丁、槲皮素、山奈酚的含量，建立的 HPLC 分析方法能使 3 种黄酮类成分均达到基线
分离。随着植株生长，山蜡梅叶中黄酮类成分从 5 月份开始显著累积，并首先生成槲皮素和山奈酚黄酮苷元类
成分，经由黄酮苷元继续合成黄酮苷芦丁。从 7 月份开始，黄酮苷元类成分开始逐渐下降，转化为黄酮苷类成
分芦丁。从 5 月到 10 月，黄酮类总含量呈现逐步递增趋势。该含量测定方法能简便快速的测定山蜡梅叶中多
个黄酮类成分的含量，可以较全面地反映山腊梅叶药材质量;且从含量动态分析结果可知，8 至 9 月份采收山
蜡梅叶药材，容易获得较大生物产量和质量。
关键词:山蜡梅叶;芦丁;槲皮素;山奈酚;含量;动态变化
中图分类号:S685． 99 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2286(2013)02 － 0357 － 04
Determination of the Contents of Three Flavonoids in Leaves of
Chimonanthus nitens Oliv． and Their Dynamic Changes
NIE Wei，FANG Hai-ling，HUANG Li-li，JIANG Xiang-mei
(Jiangxi Academy of Forestry，Nanchang 330032，China)
Abstract:To develop a method for determination of three flavonoids (rutin，quercetin and kaempferol)in
leaves of Chimonanthus nitens Oliv． and to analyze their dynamic changes． HPLC was used in determination of
rutin，quercetin and kaempferol in leaves of Chimonanthus nitens Oliv． havested at different times． Results
Three flavonoids were separated perfectly． With the growth of plant，flavonoids in leaves of Chimonanthus nitens
Oliv． began to accumulate from May，and to synthesize flavonoid aglycone，as quercetin and kaempferol，firstly．
Then，flavonoid glycoside，rutin，was synthesized from flavonoid aglycone． From July，the content of flavonoid
aglycone began to reduce gradually，and transformed to flavonoid glycoside，rutin． From May to October，the to-
tal of flavonoids showed a gradual increasing tendency． Conclusion:This analysis method could be used to def-
ermine many flavonoids in leaves of Chimonanthus nitens Oliv． quickly，and could reflect the quality of leaves of
Chimonanthus nitens Oliv． more comprehensively． From result of content dynamic analysis，the fit harvest time
of leaves of Chimonanthus nitens Oliv． was from August to September，and could obtain higher yield and better
quality．
Key words:Chimonanthus nitens Oliv．;rutin;quercetin;kaempferol;content;dynamic change
山蜡梅(Chimonanthus nitens Oliv．)为蜡梅科蜡梅属植物，又名秋蜡梅、毛山茶等，为江西原产植物，
收稿日期:2012 － 06 － 20 修回日期:2013 － 01 － 16
基金项目:江西省科技厅科技支撑项目(2060402)
作者简介:聂韡(1982—) ，女，助理研究员，博士，主要从事中药质量评价研究，E － mail:nw1025@ hotmail． com。
江 西 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
具有祛风解表、清热解毒、醒脾化浊之功效，可用于治疗上呼吸道感染、肺结核咯血等［1 － 2］。近年来，对
山蜡梅叶的化学成分有少量报道［3 － 5］，研究表明其活性成分主要为黄酮及生物碱类成分。目前，由山蜡
梅叶制成的制剂多以黄酮类成分作为其质量控制的标准［6 － 7］，而对山蜡梅叶药材并未有关于其黄酮类
成分的质量标准的研究，本实验建立了以 HPLC法同时测定芦丁、槲皮素和山奈酚 3 种黄酮类成分的方
法，并对不同采收时间的山蜡梅叶的上述 3 种黄酮类成分的含量动态变化进行了研究分析，为确定山蜡
梅叶最佳采收期提供理论依据，也可作为山蜡梅叶及其制剂的质量控制的标准。
1 仪器与材料
1． 1 实验器材
Waters 2695 型高效液相色谱仪(美国 Waters 公司) ;紫外检测器;超声清洗器(洁康超声波有限公
司) ;CP214 型分析天平(奥豪斯仪器有限公司)。
芦丁、槲皮素和山奈酚标准品(纯度 98%) ，芦丁标准品批号:100080 － 200707，槲皮素标准品批号:
100081 － 200907;山奈酚标准品批号:110861 － 200507;均购自江西省药检所。甲醇(色谱纯，天津大茂
公司) ;娃哈哈纯净水(杭州) ;其余试剂均为分析纯。
山蜡梅叶采自江西婺源，经江西省林业科学院朱培林研究员鉴定为蜡梅科(Calycanthaceae)山蜡梅
(Chimonanthus nitens Oliv．)。
1． 2 方法
1． 2． 1 色谱条件 色谱柱为 sunfire C18 4． 6 mm × 250 mm 色谱柱;流动相为甲醇:水(含 0． 1%甲酸)
的溶液:0 ～ 5 min:30% ～ 35%;5 ～ 30 min:35% ～ 40%;30 ～ 38 min:40% ～ 60%;38 ～ 48 min:60% ～
75%;48 ～ 60 min:75%;检测波长为 360 nm;流速为 1 mL /min;柱温为 25 ℃;进样量 10 μL。在该条件
下，山蜡梅叶药材及对照品色谱图见图 1。
A:芦丁(rutin) B:槲皮素(quercetin) C:山奈酚(kaempferol)
图 1 混合对照品和山蜡梅叶的 HPLC色谱
Fig． 1 HPLC chromatorams of mixed reference substances and leaves of Chimonanthus nitens Oliv．
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第 2 期 聂 韡等:山蜡梅叶中 3 种黄酮类成分含量测定及其含量动态变化研究
1． 2． 2 对照品溶液的制备 精密称取 0． 005 g芦丁、槲皮素和山奈酚标准品，用甲醇(色谱纯)溶解并
定容至 10 mL，精密量取各标准品溶液 1 mL，混匀，制得混合标准品溶液，进样前用 0． 45 μm 孔径的微
孔滤膜过滤，去杂质，备用。
1． 2． 3 供试品溶液的制备 称取山蜡梅叶粉末 1 g，精密称定，加入 40 倍 φ乙醇 = 70%溶液，50 ℃超声
提取 30 min。提取液放置至室温，甲醇定容至 100 mL，摇匀后取上清液，0． 45 μm微孔滤膜滤过，待用。
1． 2． 4 样品的测定 按照“1． 2． 3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液 10 μL，注入
高效液相色谱仪中，按“1． 2． 1”项下色谱条件进行分析，以外标法计算芦丁、槲皮素和山奈酚的含量。
2 结果
2． 1 标准曲线的绘制
精确移取对照品混合溶液 0． 05、0． 1、0． 2、0． 4 、0． 6 分别于 1 mL容量瓶中依次稀释定容，取上述各
溶液 10 μL进样。按“1． 2． 1”项下色谱条件进行分析，以各自的峰面积积分值 Y 为纵坐标，进样量 X
(μg)为横坐标，绘制标准曲线，求得芦丁、槲皮素和山奈酚回归方程，分别为:Y = 1 × 106X － 40 497，r =
0． 996;Y = 3 × 106X － 197 608，r = 0． 999 7;Y = 4 × 106X － 332 890，r = 0． 999 2。结果表明，芦丁、槲皮素
和山奈酚分别为 0． 092 ～ 1． 1 μg，0． 088 ～ 1． 06 μg，0． 093 ～ 1． 113 μg，线性关系良好。
2． 2 精密度试验
精密吸取样品溶液 10 μL，连续重复进样 6 次，记录峰面积，测得芦丁、槲皮素和山奈酚含量的 RSD
分别为 1． 01%，0． 78%，0． 94%，表明仪器精密度良好。
2． 3 重复性试验
按“1． 2． 2”项下方法制备供试品溶液，分别进样 10 μL，记录峰面积，测得芦丁、槲皮素和山奈酚含
量的 RSD分别为 1． 23%，1． 58%，1． 46%，表明该方法重现性良好。
2． 4 稳定性试验
取同一份供试品溶液，分别在 0、6、12、18、24 h 测定，记录峰面积，测得芦丁、槲皮素和山奈酚含量
的 RSD分别为 1． 82%，2． 03%，1． 69%，表明供试品溶液在 24 h内稳定性良好。
2． 5 加样回收率试验
精密称取已知含量的山蜡梅叶 5 份，每份为 1 g，分别精密加入混合对照品溶液，吹干。然后按照
“1． 2． 3”项下方法制得待测溶液，按“1． 2． 1”，项下方法进行分析，计算加样回收率。经计算，芦丁、槲皮
素、山奈酚的平均加样回收率依次分别为 98． 64%、101． 33%、97． 89%，RSD 值均小于 2%，表明分析方
法的准确度良好。
表 1 不同采收时间山蜡梅叶中黄酮类成分含量测定结果
Tab． 1 Contents of flavonoids in leaves of Chimonanthus nitens Oliv． in different harvesting time
采收时间 /(月 －日)
(Harvesting time)
芦丁 /%
(Rutin)
槲皮素 /%
(Quercetin)
山奈酚 /%
(Kaempferol)
总和 /%
Total)
05 － 21 0． 17 0． 15 0． 14 0． 46
06 － 20 0． 19 0． 21 0． 24 0． 64
07 － 22 0． 23 0． 23 0． 29 0． 75
08 － 19 0． 30 0． 17 0． 19 0． 66
09 － 19 0． 43 0． 13 0． 16 0． 72
10 － 21 0． 67 0． 07 0． 09 0． 83
2． 6 山蜡梅黄酮类成分含量动态变化
本试验采用 HPLC法测定了不同采收时间的山蜡梅叶中 3 种黄酮类成分的含量，分别收集 5 月、6
月、7 月、8 月、9 月、10 月的山蜡梅叶，测定其中芦丁、槲皮素和山奈酚 3 种黄酮类成分的含量(表 1、图
2)。数据显示，山蜡梅叶中上述 3 种黄酮类成分从 5 月份开始显著累积，推断可能首先生成黄酮苷元类
成分槲皮素和山奈酚，经由黄酮苷元类成分继续合成黄酮苷类成分芦丁。槲皮素和山奈酚为两种黄酮
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苷元类化合物，在早期含量较高，5 月份，芦丁、槲皮素、山奈酚三者含量接近，随着黄酮的生物合成途径
继续进行，黄酮苷元类成分槲皮素、山奈酚增长至 7 月达到最高值，而后开始呈现下降趋势，分析原因为
从 7 月开始，叶片趋于成熟，黄酮苷元停止合成，已生成的黄酮苷元类成分作为中间体继续生成黄酮苷
类成分芦丁等，因此含量从 7 月份开始逐渐下降。黄酮苷类成分从 5 月开始呈现稳步上升，尤其在 8 月
至 10 月期间，山蜡梅植株的营养成分已累积充分，黄酮苷类成分累积速度尤为明显。黄酮类成分总含
量从 5 月份开始到 7 月份呈现逐渐递增趋势，7 至 8 月份由于植株的营养成分在该期间大量累积，造成
黄酮类成分合成速率略有降低，从 8 月至 10 月黄酮类成分继续加速增长。因此，从山蜡梅黄酮类成分
累积的动态变化分析，为保证山蜡梅叶中各种黄酮类成分都较多，同时考虑药材产量的因素，选择 8 至
9 月份作为山蜡梅叶的最佳采收期较适宜。
图 2 不同采收时间山蜡梅叶中黄酮类成分含量变化
Fig． 2 Dynamic changes of flavonoids in leaves of
Chimonanthus nitens in different harvesting time
3 讨 论
3． 1 提取方法的选择
通过对提取方法(热回流提取
法、冷浸提取法、微波提取法、超声
提取法)的考察，发现超声提取法的
提取效率较高，且杂质少，故采用超
声提取法。在此基础上采用正交试
验 L9(3
4)对超声提取法的提取工艺
进行了优化，考察了料液比、提取时
间和提取温度 3 因素的 3 个水平，测
定结果表明，最佳提取方案为，结果
发现用 40 倍 φ乙醇 = 70%溶液于 50
℃超声提取 30 min，可以使 4 种黄
酮类成分均达到较高的提取效率。
3． 2 色谱条件的优化
3 种被测成分均属于黄酮类结构骨架，紫外扫描发现其紫外吸收带 I 在 360 nm 处有较大吸收，因
此，选择检测波长 360 nm进行测定。另外，在确定流动相系统时，分别比较了不同梯度的甲醇 －水、乙
腈 －水、甲醇 －甲酸水溶液、甲醇 －磷酸水溶液、甲醇 －三氟乙酸溶液等多个溶剂系统进行洗脱，经多次
试验，最终确定了以甲醇 － 0． 1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，可使各待测组分得到很好的基线分离，
且 0． 1%的甲酸可有效地防止色谱峰的拖尾现象。
3． 3 以往文献报道
测定山蜡梅叶中黄酮类成分的 HPLC方法控制指标较少，多以槲皮素为指标［8］，不能较全面地评价
山蜡梅叶及其制剂的质量。本试验建立的 HPLC法可同时测定山蜡梅叶中的 3 种主要黄酮类成分，且
具有分离度高、测定准确的特点，可以更加全面地控制和评价山蜡梅叶及其制剂的质量。
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