全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
%$
"
&
#$
#()#$
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""*+"!$
"
!"#$
#
"&*#(*"&
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#",("(
%
-
,.//0,#"""*+"!$,!"#$,"&,#(
!!
收稿日期$
!"#$*"$*"+
&修改稿收到日期$
!"#$*"*#&
!!
基金项目$国家自然科学基金"
%#+(""+%
#&新疆自治区优秀青年科技人才培养项目"
!"#%!#"#%
#
!!
作者简介$程
!
刚"
#&1)
#!男!在读博士研究生!研究方向为植物学
2*34.5
$
60
-
7
8
#!%95
8!
#(%,:73
!!"
通信作者$兰海燕!博士!教授!研究方向$植物抗逆分子生物学
2*34.5
$
540;4.
8
40
!
<
-
=,6>=,:0
异子蓬
1213
基因原核表达及其重组菌
在非生物胁迫下的耐受力解析
程
!
刚!兰海燕"
"新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室!乌鲁木齐
1%""+(
#
摘
!
要$该研究在
!"#$%&#$(#)*?@40/6AA4
"
B2%
#中表达了
C
+
盐生植物异子蓬的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因
"
+!+,
#!并进行了酶学特性及非生物胁迫响应分析!以期初步阐明
+!+,
基因在非生物胁迫下的生物学功能!为
异子蓬
D2DC
的非生物胁迫的抗性生理研究提供参考依据基于
$E*FGC2
技术获得异子蓬
+!+,
全长基因
"
H60I40J
登录号为
KD&1$#+
#!构建了
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
重组菌株通过分光光度法和酶联
免疫吸附技术"
2NOPG
#分别测定了
D2DC
重组蛋白的酶活和含量!并检测
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
重
组菌株在非生物胁迫下的耐受性生物信息学分析发现!该
+!+,
基因的
:BQG
全长为
!&"#R
L
!编码
&((
个氨
基酸!与甜菜"
.%/(01*
2
(&"
#
D2DC
的氨基酸序列一致性达
&"S
!具有
D2DC
的典型保守结构域"
D2D:4/6
#以及
T5?GUD?V/.FF
和
TWOHXPBP
Y
KBGH
活性位点&
D2DC
蛋白属
D2DC*#
型的不含信号肽的非分泌型亲水蛋白
Z6/A6@0R57A
结果显示!融合
HP?
的
D2DC
蛋白的分子量约
#%"
"
#+"JB
&在
%[
用
",13375
%
NOD?H
诱导
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
重组菌株显示出更高的
D2DC
酶活及含量!而且
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*
+?*#*+!+,
重组菌在
!""
"
1""3375
%
NQ4C5
(
$S
"
!"S
聚乙二醇"
D2H
#
("""
(
!$[
"
$![
温度范围(
$"
"
+""
#
375
%
N
甲基紫精和
L
U%,"
"
##,"
的非生物胁迫下生长均明显优于对照研究表明!异子蓬
+!+,
基因的表达提
高了
!-#)*
耐受非生物胁迫的能力
关键词$异子蓬&
C
+
盐生植物&磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶&非生物胁迫
中图分类号$
V1(
&
V1&
!!!
文献标志码$
G
$%"&%
(
")#&*+
,
%-..#"/"012130%"123"
,
4
(
)-04$).$$($*&"$5
6
-"$
/!5/3
(
.#."06)%-..7"3-%/&-"0)4-8-&"19#//)6)%#/
CU2QHH40
Y
!
NGQU4.
8
40
"
"
M.0
-
.40
Y
K6
8
N4R7@4A7@
8
79I.757
Y
.:45F6/7=@:6/40>H606A.:20
Y
.066@.0
Y
!
C756
Y
679N.96P:.60:640>?6:;0757
Y8
!
M.0
-
.40
Y
\0.*
]6@/.A
8
!
\@=3
^
.1%""+(
!
C;.04
#
59.)%&)
$
?7654R7@4A6A;6R.757
Y
.:459=0:A.7079+!+, _;.:;60:7>6/
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
9@73C
+
;457
L
;
8
A631(%4((&(*)#("
5
#(
!
_6.0]6/A.
Y
4A6>A;6
L
6@97@340:679@6:73R.040AD2DC.0!"#$%6
&#$(#)*?@40/6AA4
"
B2%
#
=0>6@]4@.7=/4R.7A.:/A@6//6/,?;69=5*560
Y
A;:BQG79+!+,
"
H60I40J4:*
:6//.70Q7,KD&1$#+
#
_4/7RA4.06>R
8
$E*FGC2A6:;0.
^
=640>.A/
L
@7:4@
8
7A.:6<
L
@6//.70]6:A7@
L
H2M*
+?*#*+!+,_4/:70/A@=:A6>,?;6:70A60A40>60`
8
364:A.].A
8
79D2DC_6@6364/=@6>R
8
A;6/
L
6:A@7
L
;7*
A736A@.:36A;7>40>60`
8
365.0J6>.33=07/7@R60A4//4
8
"
2NOPG
#
,W640A.36
!
A;6A756@40:679A;6@6:73*
R.040A!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,A7>.996@60A4R.7A.:/A@6//6/_4/45/7.0]6/A.
Y
4A6>,I.7.097@34*
A.:/4045
8
/6//;7_6>A;4A+!+,:70A4.06>!&"#R
L
0=:567A.>6/40>60:7>6>&((43.074:.>/
!
_;.:;
L
7/*
/6//6/A;6A
8L
.:45:70/6@]6>>734.0/79D2DC
"
6,
Y
,4:A.]6/.A6/T5?GUD?V/.FF40>TWOHXPBP
Y
KB*
GH
#!
40>/;4@6/&"S43.074:.>/.3.54@.A
8
A7D2DC9@73.%/(01*
2
(&"
&
7=@D2DC_4/4070*/6:@6A7@
8
D2DC*#A
8L
6;
8
>@7
L
;.5.:
L
@7A6.0_.A;7=A/.
Y
045
L
6
L
A.>6/6
^
=60:6
!
40>A;63756:=54@_6.
Y
;A79A;6@6:73R.*
040AD2DC_4/4
LL
@7<.34A65
8
#%")#+"JB
!
_;.:;_4/:709.@36>R
8
_6/A6@0R57A4045
8
/./,?;6@6:73R.*
040AD2DC
L
@6/60A6>@654A.]65
8
;.
Y
;6@60`
8
34A.:4:A.].A
8
_;60.0>=:6>R
8
",13375
%
NOD?H4A%[,
C73
L
4@6>_.A;A;6:70A@75/A@4.0
!
A;6@6:73R.040A!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,/;7_6>R6AA6@
Y
@7_A;
L
6@97@340:6=0>6@]4@.7=/4R.7A.:/A@6//6/
)
.,6,!"")1""3375
%
NQ4C5
!
$S)!"SD2H("""
!
$
[)$![
!
$")+""
#
375
%
N36A;
8
5].757
Y
60
!
40>A;6_.>64:.>40>R4/6@40
Y
6
"
L
U%,")##,"
#*
,?;6@6*
/=5A//;7_6>A;4A7]6@6<
L
@6//.7079+!+,
Y
6069@733-(&(*)#("
5
#(.0!-#)*60;40:6>A;6A756@40:6=0*
>6@]4@.7=/4R.7A.:/A@6//6/
!
_;.:;/=
YY
6/A/A;4AD2DC34
8
:7096@/A@6//A756@40:6A7!-#)*,a=@_7@J:40
L
@7].>637@66].>60:697@@6]645.0
Y
A;6R.757
Y
.:459=0:A.7079D2DC9@733-(&(*)#("
5
#(,
:-
(
;"%!.
$
31(%4((&(*)#("
5
#(
&
C
+
;457
L
;
8
A6
&
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
&
4R.7A.:/A@6//6/
!!
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶"
D2DC
#是
C
+
光合
途径中重要的光合调控酶!催化磷酸烯醇式丙酮酸
"
D2D
#的
$
*
羧化并以四碳酸形式固定
Ca
!
!充当
Ca
!
泵的作用)#*%*
D2DC
存在于所有植物(绿藻(
光合细菌(古细菌及非光合细菌中!主要参与
C
+
及
景天酸光合代谢途径)+*$*
D2DC
在植物中主要以
C
+
型(
C
%
型(
CGW
型以及细菌型
+
种同工酶形式
存在)(**除了调控光合作用!
D2DC
还参与三羧酸
循环"
?CG
#中各种生物合成及氮同化过程所消耗
的中间产物的回补反应!在植物(藻类及细菌中起到
重要的非光合协调作用)1*#"*除此之外!
D2DC
在植
物应对逆境胁迫中也发挥重要作用!如非生物胁迫
中的盐)##*(干旱)#!*(低温)#%*(臭氧胁迫)#+*等均能诱
导
+!+,
基因上调表达!参与植物抗逆反应特别
是通过转基因方法将
C
+
植物
+!+,
基因导入
C
%
经济作物中!以提高其光合速率及胁迫耐受性!从而
增加作物产量和适应性的研究已被广泛报道研究
发现!转玉米
++78
和
+!+,
基因的拟南芥和水
稻较对照具有更高的光合速率)#$*#(*!干旱胁迫下!过
表达
+!+,
水稻较对照具有更高光耐受性)#*在
生物胁迫中!一些植物病毒能够诱导
+!+,
基因的
高表达!间接帮助植物抵御病毒侵害)#1*
近年来发现的几种单细胞
C
+
植物光合碳同化
模式)#&*!为人类进一步认识光合碳同化途径及其进
化关系提供了新证据异子蓬"
31(%4((&(*)#("
5
6
#(
#作为藜科异子蓬属一年生盐生植物!在中国仅分
布于新疆!生长于重度盐化荒漠!整个生活史均具极
强的抗逆性)!"*异子蓬特有的单细胞
C
+
光合途
径!能够在单个叶肉细胞内经极性区隔化分布的两
种异型叶绿体进行高效光合作用)!#*因此!探索单
细胞
C
+
植物异子蓬中
D2DC
的相关功能对揭示该
物种高光效机制及逆境胁迫响应机制具有重要意
义前期研究中发现异子蓬中至少有
!
种植物型
D2DC
"根据文献命名为
D2DC*#
型和
D2DC*!
型#!
目前获得了
D2DC*#
型
+!+,
基因的
:BQG
全
长)!!*本研究通过原核表达异子蓬
D2DC*#
型
+!+,
基因!分析了
D2DC
在原核表达系统中的酶
学特性!并检测了
D2DC
重组菌在非生物胁迫下的
耐受性能本研究为后续深入分析
D2DC
的功能及
利用其改良作物光合特性和抗逆性提供参考依据
#
!
材料和方法
<,<
!
实验材料
异子蓬"
31(%4((&(*)#("
5
#(
#种植于新疆大学
新疆生物资源基因工程重点实验室阳台本研究所
用的菌株(质粒和
DCF
扩增用引物序列见表
#

<,=
!
方
!
法
<>=><
!
&?@5
全长序列的克隆
!
取发育
!
个月的
异子蓬幼苗嫩叶
",#$
Y
!于液氮中磨碎至均匀粉末
状!用
FQG
L
@6
L
D=@6
植物总
FQG
提取试剂盒"天
根#提取异子蓬总
FQG
!置
)1"[
备用
取上 述 总
FQG #
#
Y
!用
W*WNT
试 剂 盒
"
?4K4F4
#反转录合成
:BQG
第一链!以此作为模
板!根据已报道异子蓬
+!+,
基因的部分序列
"
BV$%1%$%
#!以及近源种中相似性较高的
+!+,
保守编码序列"
BV$%1%$!
(
GX&$"((
#设计简并引
物"表
#
#!获得部分序列"缺失
$E
端#
DCF
反应程
序为
&+[
预变性
$3.0
&
+[
变性
%"/
!
$1,1[
复
性
%"/
!
![
延伸
%3.0
!
%"
个循环后!
![
延伸

3.0
随后!利用
PWGF?6@
?W
FGC2:BQG G3*
L
5.9.:4A.70K.A
"
C570A6:;
!
?4K4F4
#及引物
HPD#
和
QHPD#
扩增获得
+!+,
基因
$E
端序列获得的
+!+,
全长
:BQG
由上海
P40
Y
70
公司测序
<>=>=
!
$*$A
生物信息学分析
!
用
;AA
L
$%%
R54/A,
1(#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
表
<
!
菌株!质粒和
$A8
扩增所用引物
?4R56#
!
PA@4.0/
"
L
54/3.>/40>DCF43
L
5.9.:4A.70
L
@.36@/=/6>.0A;.//A=>
8
类别
C4A6
Y
7@
8
名称
Q436
描述
B6/:@.
L
A.70
来源
F696@60:6
菌株
PA@4.0/
!-#)*?@40/6AA4
"
B2%
#
b*)9
5
?$"4P
I
"
@
I
*
3
I
*
#
2
(*4#9*(#X#
"
B2%
#
L
FGF2
"
(&
2
!
(&
2
Z
!
*%M
!
2
*
:
?
!
*%1Z
!
5
&)N
#"
C43
@
#
?@40/H60I.7A6:;C7,
!-#)*?@40/$
%
b*
&
1">*(#c

W#$

"
*(#cXG*(&
2
b
#
\#(&%;4 G#&%#G#
$"4F#
"
@
J
)
!
3
J
d
#
"1
5
2++
(
*/$*#
2:
&G&(&%*G#
5
$)G
?@40/H60I.7A6:;C7,
质粒
D54/3.>/
L
WB#1*?
<&C752#
!
N4:c7
L
6@4A7@
!
WCP
!
G3
L
@
!
6<
L
@6//.70]6:A7@
?4K4F4C7,
L
H2M*+?*#
<&
L
IF%!!
!
A4:
L
@737A6@
!
WCP
!
G3
L
@
!
HP?
Y
6069=/.70]6:A7@
PA7@6>.0A;654R
引物"
$E
#
%E
#
D@.36@
"
$E
#
%E
#
D2DC
+
L
4
G?HHCZGPZHKHGGHK?HHGHGG
本研究
?;./_7@J
D2DC
+
B7_0
4
??GGCCHH?H??C?HCG??CCGH
本研究
?;./_7@J
HPD# GHH?H??GC?C??HHG???CCG?C?CHH
本研究
?;./_7@J
QHPD# HCGHGGC?C?CG?CGHCGGGG?CCC
本研究
?;./_7@J
D2DC
+
L
R
CCHHGG??CG?HHCGGH?H?HGGH??HH
本研究
?;./_7@J
D2DC
+
B7_0
R
???HCHHCCHCGCCHH?H??C?HCG??C
本研究
?;./_7@J
!!
注$4表示
+!+,
同源克隆的简并引物&R表示
+!+,
全长序列的引物&下划线表示酶切位点
Q7A6
$
4
/A40>/97@A;6>6
Y
606@4A6
L
@.36@/=/6>.0;73757
Y
7=/:5706
&
R
/A40>/97@A;6
L
@.36@/=/6>.0A;643
L
5.9.:4A.70799=5*560
Y
A;+!+,
:BQG
&
?;6=0>6@5.06/.A6.0>.:4A6/A;660>70=:564/6/6
^
=60:6,
0:R.,053,0.;,
Y
7]
程序进行序列比对!并用
C5=/A45
M
进行多序列比对分析)!%*用
;AA
L
$%%
_6R,6<*
L
4/
8
,7@
Y
%
A@40/54A6
%在线软件进行蛋白翻译分析&
利 用
D@7A
L
4@43
"
;AA
L
$%%
_6R,6<
L
4/
8
,7@
Y
%
L
@7A*
L
4@43
%#对蛋白质基本理化性质进行预测&
W7A.9
P:40
"
;AA
L
$%%
3
8
;.A/,./R*/.R,:;
%
:
Y
.*R.0
%
37A.9
+
/:40
#对蛋白质功能位点进行预测分析&
;AA
L
$%%
:65*
57,5.96,0:A=,6>=,A_
在线软件进行亚细胞定位预
测&
P.
Y
045D+,"
"
;AA
L
$%%
:R/,>A=,>J
%
/6@].:6/
%
P.
Y
*
045D
%#预测蛋白质信号肽序列&
;AA
L
$%%
6<
L
4/
8
,7@
Y
%
A775/
%
L
@7A/:456,;A35
分析蛋白亲疏水性&
D@6>.:A*
D@7A6.0
"
;AA
L
/
$%%
___,
L
@6>.:A
L
@7A6.0,7@
Y
#及
P_.//*W7>65
"
;AA
L
$%%
/_.//37>65,6<
L
4/
8
,7@
Y
%#预
测蛋白质二级及三级结构
<>=>B
!
基因诱导表达及免疫印迹分析
!
将
!-#)*
?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
重组菌和
!-#)*
?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#
对照菌!接种于含
#""
#
Y
%
3N
氨苄青霉素的
NI
液体培养基!于
%[
(
!!"@
%
3.0
培养至
aB
(""
",+
"
",(
!加入
",13375
%
N
OD?H
诱导
+;
离心收集
$3N
菌液!用
DIP
"
L
U
,+
#缓冲液洗涤菌体
!
次!加入
#3NDIP
缓冲液!
超声波破碎菌体"功率
!""Z
!超声
%/
!间隔
#"/
!
重复
#"
次#!随后
+[
(
#!"""
Y
离心
#"3.0
!取上
清及
#3NDIP
缓冲液重悬沉淀进行
PBP*DGH2
检测
PBP*DGH2
结束后!
&"T
历时
$"3.0
将蛋
白转印至
DTBb
膜先用
#e#""""
稀释
HP?
?4
Y
鼠源单克隆抗体与膜反应
!;
!再用
#e#""""
羊抗小鼠
O
Y
H
二抗孵育
!;
!洗膜后加入
BGI
显色
液室温避光孵育
$
"
#"3.0
!至出现目的条带后终
止显色反应!观察结果
<>=>C
!
重组菌表达蛋白的酶活分析
!
用索莱宝磷
酸烯醇式丙酮酸羧化酶试剂盒"北京#和朗顿植物磷
酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶联免疫检测试剂盒"上
海#!检测
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
重
组菌的
D2DC
酶活性和蛋白含量!以空载菌株
!-
#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#
作为对照样品前处
理步骤为$离心收集
#"3N
菌液!用
DIP
"
L
U,+
#
缓冲液洗涤菌体
!
次!加入
#3N
提取液"含
#""
3375
%
NDWPb
的
DIP
缓冲液#!超声波破碎菌体
"功率
!""Z
!超声
%/
!间隔
#"/
!共
$3.0
#!随后
+
[
(
1"""
Y
离心
#"3.0
!取上清!置冰上待测按照
B60
Y
等)!+*的方法!在
%+"03
处检测样品吸光度!
通过监测
QGBU
的减少量来评价
D2DC
酶活!每
3
Y
组织蛋白在反应体系中每分钟消耗
#0375
QGBU
定义为一个酶活力单位用生物素双抗体
夹心酶联免疫吸附法"
2NOPG
#评价菌体中
D2DC
的
含量变化水平
<>=>D
!
重组菌的生长和胁迫耐受性测定
!
重组菌
生长情况测定按照
Q4@4
8
40
等的方法)!$*!并做适当
修改菌体在
",13375
%
NOD?H
诱导表达
+;
!调
节重组菌
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
和
对照菌株
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#
的初始
aB
值相等!按
#S
"
]
%
]
#的接种量
!
次转接至含
#""
#
Y
%
3N
氨苄青霉素的新鲜
NI
培养基中!每隔
!
;
取样!在
(""03
处测定菌液
aB
值
重组菌
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
和对照菌株
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#
的非生
物胁迫耐受性检测按照
P.0
Y
;
等方法)$*!并做适当
&(#
&
期 程
!
刚!等$异子蓬
+!+,
基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析
修改将
",13375
%
NOD?H
诱导表达
+;
后的重
组菌和对照菌株调节
aB
值一致!按
#S
"
]
%
]
#的接
种量!接种在添加有
!""
"
1""3375
%
NQ4C5
(
$S
"
!"SD2H("""
(
$"
"
+""
#
375
%
N
甲基紫精以及
L
U%,"
"
##,"
的
NI
液体培养基!于
%[
(
!!"@
%
3.0
振荡培养温度胁迫实验是将诱导后培养物添
加到
NI
"
L
U,"
#!于
!$[
"
$![
!
!"@
%
3.0
振荡
培养所有非生物胁迫实验每
!;
取样
#
次!在
(""
03
处检测菌液
aB
值
<,B
!
数据分析
实验数据统计分析及作图采用
H@4
L
;D4>
D@./3$,"#
软件进行
!
!
结果与分析
=><
!
1213
基因克隆及原核表达
以异子蓬总
FQG
反转录获得的
:BQG
为模
板!通过
$E*FGC2
和同源克隆技术!对目的片段进
行扩增!得到
%"""R
L
左右条带"图
#
!
G
#!与预期
片段大小一致
测序结果表明!
+!+,
基因
:BQG
全长为
!&"#
R
L
在线蛋白翻译分析"
;AA
L
$%%
_6R,6<
L
4/
8
,7@
Y
%
A@40/54A6
%#发现!该序列具有完整读码框!可进行后
续蛋白表达后将
+!+,
基因重组子转化
!-#)*
?@40/6AA4
"
B2%
#!得到重组菌
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
"图
#
!
I
#
图
#
!
异子蓬
+!+,
基因
:BQG
扩增"
G
#及重组原核表达
载体
L
H2M*+?*#*+!+,
双酶切鉴定"
I
#
W
#
,BN$"""
&
W
!
,BN#$"""
&
G,#,+!+,
基因
DCF
扩增产物&
I,#,!#)F
)
和
=)/
)
消化的
L
H2M*+?*#
&
!,!#)F
)
和
=)/
)
消化的
L
H2M*+?*#*+!+,
重组质粒
b.
Y
,#
!
DCF@6/=5A/79+!+,:BQG793-(&(*)#("
5
#(
"
G
#
40>@6/A@.:A.70>.
Y
6/A.7079
L
H2M*+?*#*+!+,]6:A7@
"
I
#
W
#
,BN$"""
&
W
!
,BN#$"""
&
G,#,+!+,
Y
6069@4
Y
360AR
8
DCF
&
I,#,
L
H2M*+?*#>.
Y
6/A6>R
8
!#)F
)
40>=)/
)
&
!,F6:73R.040A
L
54/3.>
L
H2M*+?*#*+!+,>.
Y
6/A6>
R
8
!#)F
)
40>=)/
)
,
=>=
!
异子蓬
$*$A
生物信息学分析
本研究通过生物信息学平台系统分析了异子蓬
D2DC
的蛋白信息
D@7AD4@43
分析发现!异子蓬
+!+,
基因编码
&((
个氨基酸!理论分子量为
##",!JB
!等电点为
(,#"
该蛋白质的主要氨基酸
构成为
N6=
"
#!,!S
#(
H5=
"
1,$S
#(
G@
Y
"
,%S
#(
G54
"
(,1S
#(
G/
L
"
(,#S
#!推测的分子式为
C
+&"%
U
1"#
Q
#%(#
a
#+$"
P
%
理论不稳定系数为
%1,($
!属于
稳定型蛋白亲水性及疏水性分析发现!该蛋白多
肽链中亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸且均匀分
布!因此推测异子蓬
D2DC
属于亲水蛋白
前人研究发现!植物中
C
+
型
D2DC
的
C
末端
第
+
位或附近的
#
个氨基酸残基为保守丝氨酸
"
P6@
#!而
C
%
型
D2DC
的相应位置则为丙氨酸
"
G54
#
)
!#*!!
*
本研究克隆的异子蓬
D2DC
在
C
末端
第
$
位氨基酸是丙氨酸"图
!
#!推测可能属于
C
%
型
D2DC
!并将其命名为
D2DC*#
型
D2DC

异子蓬
D2DC
蛋白功能位点与功能域预测发
现!
#(%
"
&((
位氨基酸之间存在一个典型
D2DC
结
构域氨基酸序列分析表明!异子蓬
D2DC
含有植
物型
D2DC
所有基本模体(保守残基(催化位点及磷
酸化和泛素化位点)!(*"图
!
#其中!位于
Q
端的
##
POBGVNF
#模体!在
C
+
(
CGW
及部分
C
%
植物中
参与调控植物酶活性的昼夜变化!该模体中的丝氨
酸残基为专一磷酸化位点)!*位于
C
端的&(%
VQ?H
&((模体决定了
D2DC
最大催化活性)!1*(+"
HFHH?THFHH
(+&模体中
F
(+残基直接参与该酶
的羧化反应)!&*根据
DFaPO?2
数据库分析!异子
蓬
D2DC
氨基酸序列含有
!
个大的
D2DC
活性位
点!分别位于
#(&
"
#1"
氨基酸位点"
DP""1#
!
T5*
?GUD?V/.FF
#和
$&!
"
("+
氨 基 酸 位 点
"
DP""%&%
!
TWOHXPBP
Y
KBGH
#之间
D2DC
亚细胞定位和结构预测结果显示!异子
蓬
D2DC
位于线粒体基质空间(线粒体内膜(线粒
体间隙和叶绿体类囊体膜的可能性系数分别为
",$!
(
",!$$
(
",!$$
和
",!1"

D2DC
蛋白跨膜结
构域和信号肽分析发现!该蛋白不含信号肽!属于非
分泌型蛋白
利用
D@6>.:AD@7A6.0
程序预测异子蓬
D2DC
二
级结构"图
%
#分析发现!
%
*
螺旋(无规则卷曲和延伸
链含量分别为
($,%S
(
%",+%S
和
%,1%S
!
%
*
螺旋
和无规则卷曲大量分布!而延伸链稀疏地散布在其
中利用
P_.//*W7>65
程序提供的同源建模法!对
异子蓬
D2DC
蛋白质进行同源建模!获得的三级结
"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
!
!
异子蓬
D2DC
氨基酸序列的分析
方框标示酶催化反应中重要的结构域&灰色背景标示保守残基&黑色背景标示功能位点&下划线标示模体
b.
Y
,!
!
G045
8
/./7943.074:.>/6
^
=60:679D2DC9@733-(&(*)#("
5
#(
I7<6/.0>.:4A6A;6.3
L
7@A40A:4A45
8
A.:>734.0/
&
H@4
8
40>R54:J.0>.:4A6A;6:70/6@]6>@6/.>=6/40>9=0:A.7045/.A6/
!
@6/
L
6:A.]65
8
&
\0>6@5.06/6
^
=60:6/364037A.9/
图
%
!
异子蓬
D2DC
三级结构预测
b.
Y
,%
!
?;6
L
@6>.:A6>A6@A.4@
8
/A@=:A=@679D2DC
L
@7A6.0
构如图
%
所示
=>B
!
异子蓬
$*$A
蛋白诱导表达及免疫印迹分析
PBP*DGH2
结果显示!重组菌
!-#)*?@40/6A*
A4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
样品在
#%"JB
处有差异表
达条带"
D2DC##"JBdHP?!(JB
#!表明构建原
核表达载体正确"图
+
!
G
#取超声处理后菌体上清
及沉淀进行蛋白可溶性检测"图
+
!
I
#结果表明目
的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中
Z6/A6@0
印迹结果发现!重组菌和对照菌
!-
#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#
经
OD?H
诱导后分别
检测到
HP?
融合蛋白"
#%"JB
#和
HP?
标签"
!(
JB
#!且重组菌未诱导情况下也检测到较弱条带!说
明
D2DC
存在本底表达"图
+
!
C
#
=,C
!
重组蛋白的酶活分析
本研究采用酶联免疫吸附技术和分光光度法!
对
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
重组菌
D2DC
蛋白含量及活性进行了测定结果表明!重
组 菌经
",13375
%
NOD?H
诱导
+;
!
D2DC
含量达
##
&
期 程
!
刚!等$异子蓬
+!+,
基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析
图
+
!
D2DC
重组蛋白的
PBP*DGH2
及
Z6/A6@0R57A
分析
G
和
I,PBP*DGH2
分析$
W
#
,
蛋白质分子量对照&
#,
重组菌诱导前&
!,
重组菌诱导后&
%,
重组菌诱导前总蛋白&
+,
重组菌诱导前上清&
$,
重组菌诱导前上清&
(,
重组菌诱导后总蛋白&
,
重组菌诱导后沉淀&
1,
重组菌诱导后上清&
C,Z6/A6@0R57A
分析$
W
!
,
预染蛋白质分子量对照&
,
对照菌诱导后&
#",
重组菌诱导后箭头所示为
D2DC
重组蛋白条带
b.
Y
,+
!
G045
8
/./79A;6@6:73R.040AD2DC
L
@7A6.0R
8
PBP*DGH240>Z6/A6@0R57A
G40>I,PBP*DGH24045
8
/./79@6:73R.040AD2DC
L
@7A6.0,W
#
,D@7A6.03756:=54@_6.
Y
;A34@J6@
&
#,\0*.0>=:6>@6:73R.040A
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
&
!,O0>=:6>@6:73R.040A!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
&
%,?7A45:@=>66=:6>@6:73R.040A/A@4.0/
&
+,O0/75=R569@4:A.7079=0*.0>=:6>@6:73R.040A/A@4.0/
&
$,P75=R569@4:A.7079=0*.0>=:6>@6:73R.040A/A@4.0/
&
(,?7A45:@=>66=:6>@6:73R.040A/A@4.0/
&
,O0/75=R569@4:A.7079.0>=:6>@6:73R.040A/A@4.0/
&
1,P75=R569@4:A.7079.0>=:6>@6:73R.040A/A@4.0/
&
C,Z6/A6@0R57A4045
8
/./79@6:73R.040AD2DC
L
@7A6.0,W
!
,D@6/A4.06>
L
@7A6.03756:=54@_6.
Y
;A34@J6@
&
&,O0>=:6>:70A@75!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#
&
#",O0>=:6>@6:73R.040A!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,,
?;64@@7_.0>.:4A6/A;6A4@
Y
6A@6:73R.040AD2DC
L
@7A6.0,
",#&0
Y
%
3N
!分别是非诱导组和对照组的
!,"#
和
!&,(&
倍"图
$
#
D2DC
活性为
#(,#%%
3
Y
!分别
是非诱导组和对照组的
!,%$
和
$,%1
倍该结果表
明通过
OD?H
诱导!重组菌表达了目的蛋白
D2DC
且具有活性非诱导重组菌中
+!+,
基因有少量
泄漏表达!因此与对照菌相比检测到一定的
D2DC
含量及活性
=,D
!
重组菌胁迫耐受性测定
为了验证
D2DC
重组菌
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
在不同非生物胁迫下的耐受性!
本研究检测了
!""
"
1""3375
%
NQ4C5
(
$S
"
!"S
D2H("""
(
!$[
"
$![
(
$"
"
+""
#
375
%
N
甲基紫精
和
L
U%,"
"
##,"
等不同条件下的菌体生长"图
(
!
G
"
2
#结果显示!在
+""3375
%
NQ4C5
处理
#!;
时!重组菌液
aB
(""
值是对照的
#,$1
倍在
#"S
D2H("""
(
!$[
(
$
#
375
%
N
甲基紫精和
L
U&,"
胁迫下!重组菌分别是对照的
#,!$
(
!,%
(
#,&!
和
#,1!
倍并且!随着胁迫增强!重组菌的生长呈现
优于对照菌的趋势以上结果表明!过量表达
D2DC
能够赋予宿主菌更好的耐受非生物胁迫的
能力
本研究进一步探讨了
+""3375
%
NQ4C5
(
#"S
D2H("""
(
!$[
(
$
#
375
%
N
甲基紫精(
L
U&,"
等
单一非生物胁迫条件下菌体生长情况"图

!
I
"
b
#
图
$
!
异子蓬
D2DC
蛋白含量和活性测定
#,
对照菌非诱导&
!,
重组菌非诱导&
%,
重组菌诱导后&
图中数据为平均值
fPB
"
0g%
#&下同
b.
Y
,$
!
?;6
L
@7A6.0:70A60A40>60`
8
364:A.].A
8
79D2DC
9@733-(&(*)#("
5
#(
#,\0*.0>=:6>:70A@75!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#
&
!,\0*.0>=:6>@6:73R.040A!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
&
%,O0>=:6>@6:73R.040A!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
&
I4@@6
L
@6/60A/3640fPB79A;@66@6
L
5.:4A6/
&
?;6/4364/R657_,
结果显示!在正常条件下"
%[
(
L
U,"
#!重组菌和
对照菌生长没有差异!
#";
后基本达到平稳期"图

!
G
#在胁迫条件下!除
#"SD2H("""
以外!
#!
;
两者菌体生长量均有显著差异!并且对照菌的生
长受到明显胁迫抑制以上结果表明!
+!+,
基因
的表达促进了菌体在非生物胁迫下的生长
!#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
(
!
非生物胁迫下的菌体生长检测
b.
Y
,(
!
PA@4.0/
Y
@7_A;=0>6@]4@.7=/4R.7A.:/A@6//6/
%
!
讨
!
论
尽管
+!+,
基因在
C
%
或具花环结构的
C
+
植
物中已被广泛研究!但在单细胞
C
+
植物中的研究鲜
见报道本研究克隆了单细胞
C
+
植物异子蓬
+!+,
基因
:BQG
全长序列!包含
!&"#R
L
个核苷
图

!
!-#)*?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
重组菌
在不同非生物胁迫下的生长检测
b.
Y
,
!
H@7_A;79A;6@6:73R.040A!-#)*
?@40/6AA4
$$
L
H2M*+?*#*+!+,
=0>6@>.996@60A4R.7A.:/A@6//6/
酸!编码
&((
个氨基酸!序列中含有多个
D2DC
已知
模体(保守残基(酶催化位点(磷酸化和泛素化位点
及两个大的
D2DC
活性位点)!!*氨基酸序列多重
比对发现!异子蓬
D2DC
序列与甜菜"
.%/(01*
2
(&6
"
#(五色苋"
>*/%&;(;/$%&(
?
#)4%(
#及莲子草"
>*6
/%&;(;/$%&("%""*"
#的同源性最高!均达
&"S
以
上)!!*通过生物信息学方法对异子蓬
D2DC
蛋白
质理化性质(结构及功能位点等预测分析发现!异子
蓬
D2DC
同其他种属植物型
D2DC
类似)%"*%#*该蛋
白主要分布于线粒体基质!属于无跨膜结构域和信
号肽的非分泌蛋白对其三级空间结构分析显示!
异子蓬
D2DC
主要以
%
*
螺旋为主!其酶催化反应结
构域位于蛋白中心位置!符合酶活性中心局限于大
分子一定区域的规律)%!*
经免疫印迹检测原核表达的
#%"JB
重组
HP?*D2DC
蛋白主要以包涵体形式存在!在菌体裂
解后上清及未诱导情况下也有少量表达本实验克
隆的异子蓬
D2DC
属
D2DC*#
型!其体外重组酶活
性检测显示!底物
D2D
能够在
D2DC
及苹果酸脱氢
酶催化下!通过消耗
QGBU
最终生成苹果酸!该结
%#
&
期 程
!
刚!等$异子蓬
+!+,
基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析
果与
D4@J
等研究结果一致)%%*众所周知!
D2DC
作
为重要的光合关键酶在植物中被广泛研究
C
+
型
D2DC
在
C
+
光合途径中催化
D2D
结合大气中
Ca
!
形成四碳酸!后经脱羧作用释放
Ca
!
!并将其供给
C
%
循环使用!起到了
Ca
!
浓缩作用)$!&!!*
C
%
型
"和%或根型#
D2DC
在
C
%
及
C
+
植物中则可能在三
羧酸循环的中间物质的回补反应中行使重要功能!
包括草酰乙酸"
aGG
#(苹果酸等)$*
已有大量报道集中在
D2DC
抗逆功能的研究
在转基因植物中过量表达
C
+
植物
D2DC
!能不同程
度地增强植物抵御和适应外界胁迫的能力除了增
强植物耐旱)%+*%$*(耐盐)##*(耐高温)#*等能力外!
I6*
Y
=34
等)%(*发现!转
+!+,
基因水稻具有耐受重金
属毒害的能力此外!在
!-#)*
中过量表达
+!+,
基因有利于细胞抵御逆境胁迫)$!%%*本研究也发现
原核表达的
D2DC
蛋白在
Q4C5
(
D2H("""
(甲基紫
精"
WT
#(
L
U%,"
"
##,"
的胁迫下能促进菌体生
长!由此推测
D2DC
在非生物胁迫下参与了
!-#)*
耐受非生物胁迫的胁迫生理过程!该结果与
P.0
Y
;
等研究结果相符)$*推测
D2DC
参与胁迫应答可能
存 在两种机制!一是
D2DC
能够催化
D2D
生成
aGG
和%或随后的苹果酸!
aGG
在
?CG
循环中起
重要的回补反应)%*%1*&二是菌体内积累大量的苹果
酸能够作为渗透调节物质帮助抵御胁迫产生的细胞
损伤)%&*+"*因此!
D2DC
作为一种重要的酶!能够促
进菌体积极应对逆境胁迫这进一步佐证了
D2DC
抗逆性能研究在生物逆境生理研究领域的重要性
本研究原核表达了异子蓬
D2DC*#
型
+!+,
基因!该基因的异源表达提高了
!-#)*
耐受非生物
逆境胁迫的能力因此!本研究将为
D2DC
逆境生
理和逆境生物的工程改造提供了信息
参考文献#
)
#
*
!
\UFOHFH
!
ahN2GFXI
!
PDGQHU2
!
%/(*,C7.33=07
L
=@.9.:4A.7079
L
;7/
L
;7@
8
54A6>R4:A6@.45*40>
L
540A*A
8L
6
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@*
R7<
8
54/6/_.A;A;6
L
54/A.>.45
L8
@=]4A6>6;
8
>@7
Y
604/6:73
L
56<9@73>6]657
L
.0
Y
:4/A7@7.5/66>/
)
i
*
,+*(;/+$
:
")*)
2:
!
""1
!
"
%
#$
#%+(
)#%$,
)
!
*
!
Oc\OK
!
WG?P\W\FGU
!
b\F\Wa?a?
!
KGOX,D;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
$
406_6@479/A@=:A=@45R.757
Y8
)
i
*
,>;;1(*@%6
0%A)
?
+*(;/.)*)
2:
!
""+
!
$$
$
(&)1+,
)
%
*
!
QOWWaU,C70A@7579A;6
L
;7/
L
;7@
8
54A.7079
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6.0;.
Y
;6@
L
540A/
)
i
*
,>&#$0%")
?
.)#$%9"/&
:
(;4.)6
5
$
:
"#"
!
""%
!
C"
!
#$
#1&)#&(,
)
+
*
!
WGP\Wa?aC
!
WOXGcGZGP
!
aUKGZG U
!
%/(*,D;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6.0A@.0/.:45
8
57:4A6>.0A;6:;57@7
L
54/A79@.:6
L
54
8
/4:@=:.45@756.043370.=34//.3.54A.70
)
i
*
,+&)#%%4;
2
")
?
/$%=(/);(*>#(4%9
:
)
?
3#%;#%")
?
/$%B;/%43/(/%")
?
>9%&#(
!
!"#"
!
"
##
#$
!!()$!%#,
)
$
*
!
POQHUi
!
F2BBXHW
!
GHGFZGNG
!
%/(*,W756:=54@40>/A@=:A=@454045
8
/./79C
+
*/
L
6:.9.:D2DC./797@39@73+%;;"%/19
2
*(1#19
L
54
8
/4@756.0/A@6//4>4
L
A4A.70
)
i
*
,C%;%
!
"#!
!
DFF
"
!
#$
!!+)!%#,
)
(
*
!
?OQHOD
!
I\FKiU,G/
L
6:A/79:4@R7036A4R75./3.0D%*A/"#$(
)
i
*
,+*(;/3#%;#%E%//%&"
!
#&1%
!
B=
"
%
#$
!&)!1$,
)

*
!
H2QQOBGKOPP
!
FGaP
!
HF22QUGWK
!
%/(*,I4:A6@.45*40>
L
540A*A
8L
6
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
L
75
8L
6
L
A.>6/.0A6@4:A.0A;6
;6A6@7*75.
Y
736@.:C54//*!D2DC:73
L
56<79>6]657
L
.0
Y
:4/A7@7.5/66>/
)
i
*
,F$%+*(;/G)1&;(*
!
""
!
D=
"
$
#$
1%&)1+&,
)
1
*
!
CUaNN2?F
!
TOBGNi
!
ahN2GFX W U,D;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
$
4=R.
^
=.A7=/;.
Y
;5
8
@6
Y
=54A6>60`
8
36.0
L
540A/
)
i
*
,>;;1(*
@%0%A)
?
+*(;/+$
:
")*)
2:
(;4+*(;/H)*%#1*(&.)*)
2:
!
#&&(
!
+
$
!%)!&1,
)
&
*
!
ahN2GFXI
!
DGFKi
!
DNGM?aQZC,?;6@634@J4R56>.]6@/.A
8
79
L
540A
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
"
D2DC
#$
@6:60A.0/.
Y
;A/.0A7
A;6
L
;
8
/.757
Y
.:459=0:A.70/40>
L
7/A*A@40/54A.7045:70A@75/79070*
L
;7A7/
8
0A;6A.:D2DC/
)
i
*
,.)#$%9#(*G)1&;(*
!
"##
!
CBE
"
#
#$
#$)%+,
)
#"
*
!
TOBGNi
!
CUaNN2?F,F6
Y
=54A7@
8L
;7/
L
;7@
8
54A.7079C
+
D2D:4@R7<
8
54/6
)
i
*
,F&%;4"+*(;/3#%;#%
!
#&&
!
=
"
(
#$
!%")!%,
)
##
*
!
PGQCU2cF
!
bNaF2PG
!
C2i\Babi,>&(I4)
5
""
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
Y
606/60:7>6.33=0757
Y
.:45
8
=0@654A6>
L
75
8
*
L
6
L
A.>6/40>4@6>.996@60A.45
8
6<
L
@6//6>.0@6/
L
70/6A7>@7=
Y
;A40>/45A/A@6//
)
i
*
,+*(;/(
!
""(
!
==B
"
$
#$
&"#)&"&,
)
#!
*
!
CGFWa*PONTGG2
!
I2FQGFB2PBGPONTGG
!
K2XPGi
!
%/(*,?;64:A.].A.6/79D2D:4@R7<
8
54/640>A;6C
+
4:.>>6:4@R7<
8
54/6/
4@65.AA56:;40
Y
6>R
8
>@7=
Y
;A/A@6//.0A;@66C
+
Y
@4//6/79>.996@60A/=RA
8L
6/
)
i
*
,+$)/)"
:
;/$%""@%"%(&#$
!
""1
!
HG
"
%
#$
!!%)!%%,
)
#%
*
!
HaQcGN2cWC
!
PGQCU2cF
!
C2i\Babi,GR.7A.:/A@6//6/4996:A.0
Y
_4A6@R4540:6.0>=:6
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/66<
L
@6/*
/.70.0@77A/79_;64A/66>5.0
Y
/
)
i
*
,+*(;/(
!
""%
!
="
(
#$
&1$)&&!,
)
#+
*
!
BOc2QHF2W2ND
!
N2?UO2CB
!
UGP2QbFG?c*PG\B2FWD
!
%/(*,W6A4R75.:*>6
L
60>60A:;40
Y
6/.0
L
540A:65@6>7<
L
7_6@49A6@7*
7`066<
L
7/=@6
)
i
*
,+*(;/.)*)
2:
!
""&
!
<<
"
#
#$
%$)+!,
)
#$
*
!
ZGQHXW
!
M\ ZH
!
U\N
!
%/(*,2<
L
@6//.707934.`6
Y
60660:7>.0
Y
C
+
*D
8
@=]4A6a@A;7
L
;7/
L
;4A6B.J.04/6
"
++78
#
40>C
+
*D;7/*
+#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
L;76075
L8
@=]4A6C4@R7<
8
54/6
"
+!+,
#
.0A@40/
Y
60.:>&(I4)
5
""
)
i
*
,+*(;/H)*%#1*(&.)*)
2:
@%
5
)&/%&
!
"#!
!
%"
$
#%()#%+,
)
#(
*
!
IGQBXaDGBUXGXG
!
BG??GK
!
cUGQHi
!
%/(*,20;40:6>
L
;7A7/
8
0A;6/./@4A6.0
Y
606A.:45
8
60
Y
.066@6>;4#(@.:66<
L
@6//.0
Y
L
6
L
:
Y
606:5706>9@7334.`6
)
i
*
,+*(;/3#%;#%,!""
!
"
(
#$
#!"+)#!"&,
)
#
*
!
BOQHcP
!
cUa\IX
!
P\QMb
!
%/(*,U.
Y
;5.
Y
;AA756@40:6./60;40:6>R
8
7]6@6<
L
@6//6>D2DC.0@.:6=0>6@>@7=
Y
;A/A@6//
)
i
*
,>#/(
>
2
&);)9#(3;#(
!
"#!
!
BI
"
!
#$
!1$)!&!,
)
#1
*
!
WjNN2FK
!
Ba\IQ2FaTkT
!
PXQKaTkU
!
%/(*,F6
Y
=54A.7079
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6.0DTX
"
Q?Q
#
*.096:A6>A7R4::7
L
540A/
)
i
*
,.)*)
2
#(*,$%9"/&
:
!
""&
!
BHF
"
%
#$
!+$)!$#,
)
#&
*
!
TacQ2P2QPKGXG2T
!
bFGQC2PCUOTF
!
KOOFG?Pa
!
%/(*,K@40` 404A73
8
./07A6//60A.4597@A6@@6/A@.45C
+
L
540A
L
;7A7/
8
0A;6/./
)
i
*
,=(/1&%
!
""#
!
+#+
$
+%)$+(,
)
!"
*
!
2BZGFBPH2
!
bFGQC2PCUOTF
!
TacQ2P2QPKGXG2T,P.0
Y
56*:65C
+
L
;7A7/
8
0A;6/./]6@/=/A;6>=45*:65
"
K@40`
#
L
4@4>.
Y
3
)
i
*
,
>;;1(*@%0%A)
?
+*(;/.)*)
2:
!
""+
!
$$
$
#%)#&(,
)
!#
*
!
NGFGWT
!
CU\aQHPB
!
GKUGQOU
!
%/(*,P
L
6:.6/;4].0
Y
C
+
/.0
Y
56*:65*A
8L
6
L
;7A7/
8
0A;6/./.0A;6:;607
L
7>.4:646943.5
8
6]75]6>4
L
;7A7/
8
0A;6A.:
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/65.J6A;4A79J@40`*A
8L
6C
+
/
L
6:.6/
)
i
*
,+*(;/+$
:
")*)
2:
!
""(
!
"
!
#$
(%)(1+,
)
!!
*
!
FaPQaZii
!
2BZGFBPH2
!
FaGNPaQ2U,D7/.A.]6/656:A.7079K@40` 40>070*K@40` C
+
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/643.07
4:.>/.0P=46>7.>646
"
C;607
L
7>.4:646
#)
i
*
,G)1&;(*)
?
!J
5
%&9%;/(*.)/(;
:
!
"#+
!
ED
"
#%
#$
%$&$*%(",
)
!%
*
!
?UaWDPaQiB
!
HOIPaQ?i
!
DN2ZQOb
!
%/(*,?;6C5=/A45M_.0>7_/.0A6@94:6
$
b56<.R56/A@4A6
Y
.6/97@3=5A.
L
56/6
^
=60:645.
Y
0360A
4.>6>R
8^
=45.A
8
4045
8
/./A775/
)
i
*
,=1#*%#>#4"@%"%(&#$
!
#&&
!
=C
"
+
#$
1()+11,
)
!+
*
!
B2QHM
!
CGOi
!
NOX
!
%/(*,2<
L
@6//.7040>J07:J>7_079A;6+!+,#
Y
6064996:A:4@R7095=<.0A;6R.7/
8
0A;6/./79A@.4:
8
5
Y
5
8
:6@75/R
8
A;6
Y
@66045
Y
4,$*(9
:
4)9);("&%;$(&4/
)
i
*
,.)/%#$;)*)
2:
E%//%&"
!
"#+
!
BE
"
##
#$
!#&&)!!"1,
)
!$
*
!
QGFGXGQaD
!
K\WGFOQ
!
FGONC,U6A6@757
Y
7=/6<
L
@6//.7079>;(I(%;(DCC#!"(**%&+"
"
4B
L
/943.5
8Y
606
#
L
@7A6:A/!"#$%6
&#$(#)*9@730=A@.60A5.3.A4A.7040>4R.7A.:/A@6//6/
)
i
*
,.)#$%9#(*(;4.)
5
$
:
"#(*@%"%(&#$,)991;#(/);"
!
"#"
!
BHC
"
#
#$
#(%)
#(&,
)
!(
*
!
F\Oc*IGNN2P?GO
!
b2FOG GI
!
QOU
!
%/(*,O0].]73707=R.
^
=.A.04A.7079404
L
56@7A.:
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/67::=@/4A
N
8
/(!+.0
Y
6@3.04A.0
Y
/7@
Y
;=3/66>/
)
i
*
,G)1&;(*)
?
!J
5
%&9%;/(*.)/(;
:
!
"#+
!
ED
"
!
#$
++%)+$#,
)
!
*
!
N2DOQO2CN
!
TOBGNGi
!
CUaNN2?IF
!
%/(*,D;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
$
/A@=:A=@6
!
@6
Y
=54A.7040>6]75=A.70
)
i
*
,+*(;/3#%;#%
!
#&&+
!
HH
"
!
#$
###)#!+,
)
!1
*
!
BaQHN
!
DG?ONP
!
CaQBaQPG
!
%/(*,?;6:70/6@]6>C*A6@3.045A6A@4
L
6
L
A.>679/7@
Y
;=3C
+
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6./.0*
>./
L
60/4R5697@34<.345:4A45
8
A.:4:A.].A
8
!
R=A07A97@;737A6A@436@97@34A.70
)
i
*
,>&#$0%")
?
.)#$%9"/&
:
(;4.)
5
$
:
"#"
!
#&&&
!
BG<
"
#
#$
#!+)#!1,
)
!&
*
!
WG?P\W\FGU
!
MO2X
!
PUOFGKG?GP
!
%/(*,C@
8
/A45/A@=:A=@6/79C
+
97@334.`640>
^
=4A6@04@
8
:73
L
56<79!-#)*
L
;7/
L
;76075*
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6/
)
i
*
,3/&1#/1&%
!
""!
!
"
#!
#$
#!#)#%",
)
%"
*
!
cUGQHHb
"张桂芳#!
cUGaW
"赵
!
明#!
BOQHcP
"丁在松#!
%/(*,C570.0
Y
40>:;4@4:A6@.`4A.7079
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
Y
6069@73!#$;)#$*)(#&1"
2
(**
)
i
*
,>#/(>
2
&);)9#(3;#(
"作物学报#!
""$
!
B<
"
#"
#$
#%($)#%(&
"
.0C;.06/6
#
,
)
%#
*
!
CU2QWQ
"陈明娜#!
XGQHVN
"杨庆利#!
X\PUN
"禹山林#!
%/(*,C570.0
Y
40>4045
8
/./79
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
Y
606
9@7331(%4(
2
*(1#(
)
i
*
,H(&;%3#%;#%"
"海洋科学#!
""&
!
BB
"
(
#$
()!
"
.0C;.06/6
#
,
)
%!
*
!
王镜岩
,
生物化学)
W
*
,
北京$高等教育出版杜!
""!
$
%1+)%1$,
)
%%
*
!
DGFKP
!
DGCKPD
!
N22i,2<
L
@6//.7079:7>70*7
L
A.3.`6>
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
Y
6069@73C*(#%#)*(/
L
,KF,,!&&&.0
!"#$%&#$(#)*40>.A/4
LL
5.:4A.7097@C
+
:;63.:45
L
@7>=:A.70
)
i
*
,>
55
*%4.)#$%9"/&
:
(;4.)/%#$;)*)
2:
!
!"#!
!
"

#$
#1+$)#
1$%,
)
%+
*
!
B\MU
"杜西河#!
M\ZH
"许为钢#!
U\N
"胡
!
琳#!
%/(*,F6/
L
70/67934.`6C
+
*A
8L
6+!+,40>++78A@40/
Y
60.:>&(I4)
5
""
L
540A/
A7>@7=
Y
;A*/A@6//
)
i
*
,H)*%#1*(&+*(;/.&%%4;
2
"分子植物育种#!
"#%
!
<<
"
+
#$
+)+1+
"
.0C;.06/6
#
,
)
%$
*
!
cUa\IX
!
BOQHcP
!
cUGaW,G56].4A.7079>@7=
Y
;A/A@6//.0;.R.A.7070
L
;7A7/
8
0A;6/./R
8
7]6@6<
L
@6//.7079
5
%
5
#
Y
606.0@.:6
)
i
*
,
>#/(>
2
&);)9#(3;#(
!
"##
!
BG
"
#
#$
##!)##1,
)
%(
*
!
I2H\WGUU
!
aPGKOGW
!
ZG?GQGI2G?
!
%/(*,W6:;40./3/7945=3.0=3A756@40:6.0
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6A@40/
Y
60*
.:@.:6
)
i
*
,G)1&;(*)
?
+*(;/=1/&/);
!
""&
!
B
"
#
#$
1+)&(,
)
%
*
!
DNGM?aQZC
!
DaB2P?Gb2,?;69=0:A.70457@
Y
40.`4A.7040>:70A@7579
L
540A@6/
L
.@4A.70
)
i
*
,+*(;/3#%;#%"
!
""(
!
=D
"
!
#$
#$&)#&1,
)
%1
*
!
WONNGFBCP
!
CUGaXD
!
NOGaiC
!
%/(*,20;40:6>
L
@7>=:A.7079/=::.0.:4:.>R
8
7]6@6<
L
@6//.7079
L
;7/
L
;76075
L8
@=]4A6:4@R7<
8
54/6
.0!"#$%&#$(#)*
)
i
*
,>
55
*%4(;4!;0&);9%;/(*H#&)I)*)
2:
!
#&&(
!
E=
"
$
#$
#1"1)#1#",
)
%&
*
!
Fc2DKGG
!
F\?H
!
KF\DGi,2996:A794R.7A.:/A@6//94:A7@/7095=:A=4A.70/.0:70A60A/793454A640>:.A@4A640>70345.:60`
8
364:*
A.].A
8
.037//
Y
436A7
L
;7@6/
)
i
*
,+$)/)"
:
;/$%/#(
!
""&
!
CG
"
#
#$
#+#)#+$,
)
+"
*
!
IFaGBI2Q?iF
!
NGFP2QFN
!
B2OI2NT
!
%/(*,D;
8
/.757
Y
.:4540>A@40/:@.
L
A.7045@6/
L
70/679E(#/)I(#**1"#("%G?CC%%+A74:.>
/A@6//
)
i
*
,G)1&;(*)
?
.(#/%&)*)
2:
!
"#"
!
"
&
#$
!++$)!+$1,
!编辑"宋亚珍#
$#
&
期 程
!
刚!等$异子蓬
+!+,
基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析