全 文 ：不同培养基配方对防止土人参愈伤组织玻璃化作用的研究
赖育菠1，张 杨1，陈志宽1，罗俊明1，刘顺会1，2* ，陆幸妍1，2*
(1．广东药学院生命科学与生物制药学院，广东广州 510006;2．广东省候选药物研究重点实验室，广东广州 510006)
摘要 ［目的］研究不同培养基配方对防止土人参愈伤组织玻璃化的效果。［方法］以 MS + 6-BA 2． 0 mg /L + NAA 0． 5 mg /L +蔗糖 30
g /L为基础培养基(对照组)，将其配方作以下分组调整:①6-BA浓度减半;②添加活性炭( 1 g /L) ;③Ca2 +加倍;④NH4
+减半;⑤采用2，4-
D + KT 代替 6-BA;⑥联合②③④⑤，比较培养基变化对土人参愈伤组织玻璃化率的影响，并观察土人参愈伤组织悬浮培养细胞形态。
［结果］与对照组相比，② ～④组玻璃化率无显著差异( P ＞0． 05) ;⑤组玻璃化率降至 25% ( P ＜0． 05) ;⑥组玻璃化率降为 0，同时⑥组悬
浮细胞密度及活性均高于对照组。［结论］最佳培养基为改良 MS( Ca2 +浓度加倍，NH4
+浓度减半) + 2，4-D 2． 0 mg /L + NAA 2． 0 mg /L
+ KT 0． 5 mg /L +活性炭 1． 0 g /L +蔗糖 30 g /L，可在一定程度上防止土人参愈伤组织玻璃化的发生。
关键词 土人参;培养基配方;愈伤组织培养;玻璃化
中图分类号 S567． 5 + 3 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2013) 08 －03307 －03
Effect of Different Medium Formula on Preventing Callus Vitrification of Talinum paniculatum
LAI Yu-bo et al ( College of Life Sciences and Bio-pharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangdong 510006)
Abstract ［Objective］To investigate the effect of different medium formula on preventing Talinum paniculatum’s callus vitrification． ［Meth-
od］With the MS +6-BA 2． 0 mg /L + NAA 0． 5 mg /L + sugar 30 g /L as the basic medium，the following grouping adjustment was treated in the
basic medium ( control group) : ① reduction in concentration by half of 6-BA; ② adding activated carbon( 1 g /L) ; ③ doubling the concentra-
tion of Ca2 + ; ④ reduction in concentration by half of NH4
+ ; ⑤ 6-BA replaced by 2，4-D + KT; ⑥ combination of ②③④⑤． The effects of
different Medium Formula on T． paniculatum’s callus vitrification rate were compared and the morphological characters of suspension-culture cells
of T． paniculatum callus were observed． ［Result］Compared with the control group，there was no significant difference in vitrification rate of
group ①-④( P ＞0． 05)，while that of group⑤ was reduced to 25% ( P ＜0． 05)，and even to 0 for group⑥． The density and activity of suspen-
sion-culture cells of group ⑥ were higher than those of the control group． ［Conclusion］The optimal medium，modified MS ( doubling the con-
centration of Ca2 +，reduction in concentration by half of NH4
+ ) + 2，4-D 2． 0 mg /L + NAA 2． 0 mg /L + KT 0． 5 mg /L + activated carbon
1． 0 g /L + sugar 30 g /L，could effectively prevent the occurrence of Talinum paniculatum’s callus vitrification．
Key words Talinum paniculatum; Medium formula; Callus culture; Vitrification
基金项目 广东药学院 2012 年省级大学生创新创业训练计划项目
( 1057312001) ; 广东药学院 2012 年校级大学生创新实验项
目( 14) 。
作者简介 赖育菠( 1991 － ) ，男，广东东源人，本科生，专业:生物技术。
* 通讯作者，陆幸妍，副教授，从事细胞生物学研究，E-mail:
xingyanlu2005@ 126． com; 刘顺会，副教授，从事生态学研究，
E-mail: Lshhsl100@ 163． com。
收稿日期 2013-03-18
土人参(Talinum paniculatum (Jacq．)Gaertn) ，又名人参
菜，别名玉参、参草、飞来参、土洋参、栌兰等，属马齿苋科一
年生或多年生草本植物［1］。土人参分布于我国福建、浙江、
江苏、安徽、河南、广西、广东、四川、贵州、云南等地，主要含
环烯醚萜，有类似地黄养阴、生津、益精填髓的作用，同时含
三萜皂苷，亦有类似人参大补元气、补脾益气、生津安神、增
强免疫机能之功效，主要用于治疗气虚乏力、体虚自汗、脾虚
泄泻、肺痨咳血、眩晕、月经不调等疾病［2］。随着土人参食疗
功效研究的深入开展，作为一种集食用、药用、观赏为一体的
新型保健食材，其潜在价值正日益显现。与此同时，优质高
产品种的培育也成为其普及和推广的关键［1］。
植物组织培养作为植物快繁的成熟技术常被用来进行
名特优植物品系的大规模育苗，但在植物组织培养过程中，
常可观察到一些半透明状的畸形试管植物，这类植物体被称
为玻璃苗，这种现象称为玻璃化，又称过度水化现象。在草
本和木本植物中，已报道出现玻璃化苗的植物已达 70 多种。
由于玻璃苗的组织结构和生理功能异常，故分化能力低，难
以分化、增殖、生根、移栽成活，已成为组培工作中亟待解决
的一大难题［3 －5］。目前关于植物组织培养中玻璃化现象的
研究主要集中于试管苗，对于愈伤组织层面玻璃化现象的相
关研究国内鲜有报道，特别是关于土人参在组织培养过程中
愈伤组织出现玻璃化现象更是未见文献报道。该研究旨在
通过一系列影响组培过程中玻璃化的单因子和多因子试验，
逐步深入了解并最终克服土人参组培过程中愈伤组织玻璃
化的问题，以便为土人参的快速繁殖提供技术支持，同时也
为进一步探究组织培养过程中组织与微环境相互作用的机
制提供较好的试验素材。
1 材料与方法
1． 1 材料 土人参植株由广东药学院生命科学与生物制药
学院刘顺会副教授馈赠，取其新鲜、嫩绿叶片作为组培材料。
1． 2 方法
1． 2． 1 培养基配制。基础培养基［6］:MS + 6-BA 2． 0 mg /L
+ NAA 0． 5 mg /L +蔗糖 30 g /L，对基础培养基设置 6种处理
(表 1) ，每处理琼脂浓度均为 0． 8%，pH值为 5． 8。将配制好
的培养基置于 121 ℃、1． 05 ×105 Pa下灭菌 21 min。
1． 2． 2 愈伤组织的诱导。取新鲜外植体，消毒后切成 0． 1
cm2大小接种到各培养基上，经暗培养10 d后，转移至光照强
度 2 000 lx、光照时间 12 h /d的条件下培养 15 d，观察愈伤组
织是否出现玻璃化状态并按下列公式计算愈伤组织诱导率
和玻璃化率。
诱导率 =(诱导出愈伤组织外植体数 /接种外植体总数)
×100%
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(8):3307 － 3309 责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.08.147
玻璃化率 =(玻璃化的外植体数 /植入的外植体总数)×
100%
表 1 培养基配方
分组 基础培养基 配方调整
①对照组
MS + 6-BA 2． 0 mg /L
+ NAA 0． 5 mg /L +
蔗糖 30 g /L
─
②6-BA浓度减半组 6-BA浓度 1． 0 mg /L
③添加活性炭组 添加活性炭 1． 0 g /L
④Ca2 +浓度加倍组 Ca2 +浓度 880 mg /L
⑤NH4
+浓度减半组 NH4
+浓度 825 mg /L
⑥2，4-D + KT + NAA组 采用 2，4-D 2． 0
mg /L + KT 0． 5
mg /L代替 6-BA 2． 0
mg /L
⑦多因素联合组 ③ +④ +⑤ +⑥
1． 2． 3 愈伤组织细胞的悬浮培养和观察。选取疏松、嫩绿
的正常愈伤组织块置于液体培养基中培养，液体培养基:改
良 MS(Ca2 +浓度加倍与 NH4
+浓度减半)+ 2，4-D 2． 0 mg /L
+ NAA 2． 0 mg /L + KT 0． 5 mg /L +蔗糖 30 g /L，并以基础培
养基 MS +6-BA 2． 0 mg /L + NAA 0． 5 mg /L +蔗糖 30 g /L为
对照，每 100 ml锥形瓶盛装 30 ml 培养基，每瓶接种愈伤组
织块 2 ～3 g，在(25 ±2)℃的暗环境中以 100 r /min的转速振
荡培养。
在无菌条件下，用移液枪缓慢吹打均匀悬浮细胞液后，
小心吸取 1 ml置于 24 孔细胞培养板上，在倒置显微镜(100
×)下观察细胞形态。
1． 2． 4 统计学处理。采用 SPSS 13． 0进行数据处理，组间多
重比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA)。P ＜ 0． 05 为
差异有统计学意义，P ＜0． 01为差异有显著统计学意义。
2 结果与分析
2． 1 土人参愈伤组织诱导阶段玻璃化现象的发生 将消
毒处理后土人参的叶片接种于基础培养基上，暗培养 10 d
后，见叶片切口边缘长出颗粒状愈伤组织;移至光照强度
2 000 lx、光照时间 12 h /d 条件下继续培养至第 15 天时，部
分愈伤组织膨大呈半透明状态，含水较多，即愈伤组织发生
玻璃化(图 1)。
图 1 土人参愈伤组织的不同形态
注:与对照组比较:＊＊为 P ＜ 0． 01;与 2，4-D + KT + NAA组比
较:#为 P ＜0． 05;与 6-BA浓度减半组比较:＆为 P ＜0． 01。
图 2 不同配方培养基中土人参愈伤组织玻璃化率的比较
2． 2 培养基配方对土人参愈伤组织的诱导率与玻璃化率的
影响 培养基① ～⑦处理的土人参愈伤组织绣导率分别为
85． 71%、75． 00%、87． 50%、100%、87． 50%、100%、100%。与
对照组 85． 71%的诱导率相比，除 6-BA浓度减半组诱导率降
低至 75． 00%(P ＜ 0． 05)外，其余组的愈伤组织诱导率均高
于对照组(P ＜0． 05) ，且 Ca2 +浓度加倍组、2，4-D + NAA +
KT 组和多因素联合组的愈伤组织诱导率均达 100%。
由图 2可知:与基础培养基组比，联合处理组的愈伤组
织玻璃化率为 0(P ＜0． 01) ;2，4-D + NAA + KT组的愈伤组
织玻璃化率显著降低(P ＜ 0． 05) ;6-BA 浓度减半组、添加活
性炭组、Ca2 +浓度加倍组和 NH4
+浓度减半组差异无统计学
意义(P ＞0． 05)。
2． 3 不同培养基配方诱导土人参愈伤组织细胞的形态观
察 暗培养 14 d的细胞状态见图 3。对照组的悬浮细胞密
8033 安徽农业科学 2013 年
度低，细胞易聚团死亡(图 3A) ;多因素联合组(实验组)的土
人参悬浮细胞均一性好，细胞密度大，呈椭圆形、圆形和不规
则形态，有液泡化，边缘光滑或毛刺，细胞核较大(图 3B)。
图 3 悬浮培养 14 d的土人参愈伤组织细胞形态(100 ×)
3 讨论
至今为止，培养基对植株玻璃化影响的研究已有不少报
道，主要集中在组织培养过程中水势过高的影响、以细胞分
裂素为代表的激素平衡问题和以 NH4
+为代表的矿质元素平
衡问题 3个方面。梁海曼等［7］指出在培养基中提高 Ca2 +的
浓度、降低 NH4
+水平可降低玻璃苗的发生。该研究中，提高
Ca2 +浓度和降低 NH4
+水平对降低土人参愈伤组织的玻璃化
率无明显影响。
有研究表明，在培养基中添加一定浓度的活性炭对玻璃
化有较好的抑制作用，张丽珍等［8］在青蒿组织培养中发现随
着活性炭浓度的增加，青蒿试管苗的玻璃化率随之变小。王
爱勤等［9］在培养基中添加 3 g /L的活性炭，可有效降低芦荟
玻璃化的发生。该研究在基础培养基中添加 1． 0 g /L的活性
炭，此时土人参愈伤组织玻璃化发生率为 75%，说明活性炭
无论对植株还是愈伤组织的玻璃化都有一定的抑制效果。
黄花花等［10］通过研究大花萱草“黄绣客”愈伤组织的玻
璃化现象指出，植物激素是影响玻璃化的关键因素。Kevers
等［11］指出，培养基中的细胞分裂素易导致玻璃化。现普遍
认为:6-BA + NAA比 KT + IBA的激素组合更易诱发玻璃化
的产生［12］。该试验表明，与 6-BA + NAA的激素组合 75%的
土人参愈伤组织玻璃化率相比，2，4-D + KT + NAA组的愈伤
组织玻璃化率为 25%，明显降低了土人参愈伤组织的玻璃化
率，李瑶等［13］对香石竹培养的研究也有类似报道。由此，该
研究提出土人参愈伤组织诱导的最佳激素组合为:2，4-D 2． 0
mg /L + NAA 2． 0 mg /L + KT 0． 5 mg /L。
该研究中联合处理组采用 2，4-D + KT + NAA 的激素
组合，并综合考虑活性炭、Ca2 +的浓度和 NH4
+水平对土人参
愈伤组织玻璃化的影响，设计多种因素联合培养基配方为:
改良 MS(Ca2 + 浓度加倍与 NH4
+ 浓度减半)+ 2，4-D 2． 0
mg /L + NAA 2． 0 mg /L + KT 0． 5 mg /L +蔗糖 30 g /L。诱导
结果表明，联合组的土人参愈伤组织诱导率为 100%，显著高
于对照组;玻璃化率为 0，显著低于对照组。此外，土人参愈
伤细胞悬浮细胞培养后，基础培养基组的细胞增殖缓慢，聚
团现象严重，进行继代培养 14 d后，细胞数开始减少，细胞凋
亡变黑;而联合组细胞的原代和继代培养增殖速度较快，在
100倍的显微镜下，细胞清晰可见，多为椭圆状和棒状形态。
综合上述分析，该研究认为，联合培养基的配方能有效
防止土人参愈伤组织诱导过程中玻璃化现象的发生，从而在
一定程度上解决了土人参规模化繁育的关键技术瓶颈，将为
下一步探讨玻璃化形成机制及其玻璃化现象在土人参种质
保存及繁育中的应用奠定坚实基础。
参考文献
［1］王红艳，黄群策．蔬菜新秀———土人参的潜在价值研究［J］．中国农学
通报，2004，20(4):203 －204．
［2］中华本草编委会．中华本草．第 2分册［M］．上海:上海科学技术出版
社，1999:1397．
［3］蔡祖国，符树根，黄宝祥，等．植物组织培养中玻璃化现象的研究进展
［J］．江西林业科技，2005(4):35 －38．
［4］陶铭．组织培养中畸形胚状体及超度含水态苗的研究［J］．西北植物学
报，2001，21(5):1048 －1058．
［5］蔡祖国，徐小彪，周会萍． 植物组织培养中的玻璃化现象及其预防［J］．
生物技术通讯，2005，16(3):353 －355．
［6］安永辉，郭昶，孙振雷，等．人参的组织培养及快繁体系的建立［J］．安
徽农业科学，2008，36(27):11656 －11657．
［7］梁海曼，周菊华．试管苗玻璃化现象的生理生化和机理探讨［J］．武汉
植物学研究，1994，12(3):281 －288．
［8］张丽珍，杨冬业，靳振江，等．青蒿组织培养中克服玻璃化现象研究
［J］．北方园艺，2010(23):120 －122．
［9］王爱勤，何龙飞，裴润梅，等．组培条件对不同品种芦荟试管苗玻璃化
的影响［J］．中国农学通报，2002(5):46 －48．
［10］黄花花，曹冬梅，魏爱丽．大花萱草“黄绣客”愈伤组织玻璃化的初步
研究［J］．山东农业科学，2011，39(3):213 －216．
［11］KEVERS C，COUMANS M，GASPER T． Physiological and biochemical e-
vents leading to vitrification of plant culture in vitro［J］． Physiologia
Plantarum，1986，61:69 －74．
［12］秦静远，王军利，王富容．植物组织培养中的玻璃化现象［J］．杨凌职
业技术学院学报，2004(2):52．
［13］李瑶，王利华，叶鸣明，等．影响香石竹试管苗玻璃化的因素(简报)
［J］．植物生理学通讯，1997，33(4):256 －258．
903341卷 8期 赖育菠等 不同培养基配方对防止土人参愈伤组织玻璃化作用的研究