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收稿日期:2014－ 06－ 02 (郭薇编辑 韩仰欢校对)
* 基金项目:贵州省教育厅自然科学研究项目(黔教科 2010033 号)
作者单位:1．贵阳医学院药理学教研室，贵州 贵阳 550004;2．上海市普陀区人民医院药剂科
作者简介:王雷鸣(1984 －)，女，江苏徐州人，药师，硕士，研究方向:中药药理与新药筛选。
通讯作者:梁冰，E-mail:bliang163@ 163． com
数字出版日期:2014 － 11 － 4 15:40
数字出版网址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /21． 1234． Ｒ． 20141104． 1540． 040． html
·实验研究·
漆姑草水提物对 K562 细胞凋亡及细胞周期影响*
王雷鸣1，2，梁冰1，李淑芳1，沈祥春1
摘 要:目的 探讨漆姑草水提物(HSJ)对人白血病细胞株 K562 细胞凋亡及细胞周期影响。方法 采用四
甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测 HSJ对 K562 细胞的增殖抑制作用;台盼蓝拒染法观察 HSJ对细胞生长曲线影响;
流式细胞仪检测 HSJ对 K562细胞凋亡影响;DNA倍体分析法检测 HSJ对 K562 细胞周期时相影响。结果 HSJ 对
K562细胞增殖抑制率随剂量增加而增加，作用 48 h半数抑制浓度(IC50)为 1. 35 mg /mL;1. 0、2. 0、4. 0 mg /mL HSJ处
理后，K562 细胞凋亡率分别为(8. 39 ± 0. 81)%、(8. 88 ± 1. 12)%、(13. 42 ± 2. 04)%，均高于对照组的
(4. 60 ± 1. 09)%(P ＜ 0. 05);HSJ能够引起细胞周期进程的改变，与对照组比较，HSJ 增加 K562 细胞中 G2 期细胞
比例(P ＜ 0. 05)，降低 S期时相细胞比例(P ＜ 0. 05)，降低增殖指数(PI)(P ＜ 0. 05) ，HSJ 将 K562 细胞阻滞于 G2
期。结论 HSJ对 K562 细胞具有增殖抑制作用，其机制与诱导细胞凋亡和阻滞 K562 细胞在 G2 期有关。
关键词:漆姑草(HSJ);K562;细胞凋亡;细胞周期
中图分类号:Ｒ 181. 2 + 4 文献标志码:A 文章编号:1001-0580(2014)12-1520-03 DOI:10． 11847/zgggws2014-30-12-08
Ｒegulating effects of Herba Saginae Japonicae on apoptosis and cell cycle
of K562 cell strain in vitro
WANG Lei-ming* ，LIANG Bing，LI Shu-fang，et al(* Department of Pharmacology，Guiyang Medical University，Gui-
yang 550004，China)
Abstract:Objective To investigate regulating effects of Herba Saginae Japonicae(HSJ)on apoptosis and cell cy-
cle of K562 cell strain in vitro．Methods The inhibited proliferation of K562 cells was measured with methyl thiazolyl
tetrazolium(MTT)． The effect of HSJ on cell growth was analzyed with trypan blue dye exclusion method． The HSJ-in-
duced apoptosis of K562 cells was detected with annexinV-FITC /PI double staining method． The cell cycle phase of
K562 cells was determined with DNA ploid analysis． Ｒesults There was a positive relation between inhibitive effect of
HSJ on K562 cell proliferation and the concentration of HSJ． The 50% inhibitory concentration(IC50)of HSJ was 1. 35
mg /ml with the treatment of HSJ for 48 hours． The apoptotic ratios of K562 cells were 8. 39 ± 0. 81%，8. 88 ± 1. 12%，
and 13. 42 ± 2. 04% treatd with HSJ of 1. 0，2. 0，and 4. 0 mg /ml，respectively，with a significant difference compared
with that of the control group(4. 60 ± 1. 09 %)(P ＜ 0. 05)． Compared with control，HSJ increased the percentage of the
cells in G2 phase(P ＜ 0. 05) ，decreased the percentage of cells in S phase and the proliferous index(PI) (P ＜ 0. 05，
P ＜0. 05)． Cell cycle of K562 cells with HSJ treatment were blocked in G2 phase．Conclusion HSJ can inhibit the prolifera-
tion of K562 cells and the mechanism maybe involve the induced cell apoptosis and blocked G2 phase of K562 cells．
Key words:Herba Saginae Japonicae(HSJ) ;K562 cell strain;cell apoptosis;cell cycle
漆姑草(Herba Saginae Japonicae，HSJ)又名珍 珠草、地松和大龙叶等，石竹科。HSJ属 1、2 年生小
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草本植物，有提脓、拔毒、散结消肿和抗癌等功效，民
间常用于治疗白血病、疮、痈、淋巴结核等病症［1］。
白血病是造血系统的原发性肿瘤，在中国居民恶性
肿瘤死因中位居第 6 位，是儿童及 ＜ 35 岁人群中死
亡率最高的恶性肿瘤［2 － 3］。目前有少量关于 HSJ治
疗白血病的临床研究［4］，而药理学方面的研究更为
少见。本研究以人慢性髓细胞性白血病急变期细胞
株 K562 细胞为实验对象，观察 HSJ 水提取物对体
外培养的 K562 细胞增殖抑制作用以及对细胞凋亡
和细胞周期影响，旨在为白血病治疗和 HSJ 研究开
发提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂与仪器 HSJ(贵阳市药材市场，经
贵阳医学院龙庆德教授鉴定)，称取 HSJ全草250 g，
加蒸馏水浸泡后加热煮沸，先用强火煮沸，后改用文
火，保持微沸约 1 h，搅拌，趁热过滤。药渣再加蒸馏
水，同法煮沸后过滤，合并滤液，水浴浓缩，得干浸
膏，取适量配成 20 mg /mL 母液，0. 22 μm 滤膜过滤
后，－ 20 ℃保存备用，用前用无血清培养基稀释至
所需浓度;注射用盐酸多柔比星(浙江海正药业有
限公司 1640 培养基(美国 Invitrogen 公司);胎牛血
清(杭州四季青公司);二甲基亚砜(美国 Sigma 公
司);台盼蓝、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tet-
razolium，MTT)(美国 Amresco 公司);凯基 Annexin
V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技
发展有限公司);Cycletest Plus DNA 检测试剂盒
340242［美国碧迪医疗器械(上海)有限公司］。TS-
100-F倒置相差显微镜(日本 Nikon 公司);Elx 800
UV 酶联免疫检测仪(美国 Bio-tek 公司);BD FAC-
SCantoTM Ⅱ Flow Cytometer 338960 流式细胞仪
(美国 Becton Dikson公司)。
1. 2 K562 细胞培养 人白血病细胞株 K562 细胞
(中科院上海细胞库)，培养基为含 10%胎牛血清的
ＲPMI 1640。置于 37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下
培养，细胞生长至近 70%时，收集细胞，离心后弃上
清，重悬细胞，进行传代，每周 3 次左右。
1. 3 指标与方法
1. 3. 1 细胞生长抑制率检测 采用 MTT 法，将
K562 细胞制成 5 × 104 个 /mL 细胞悬液于 96 孔板
培养 24 h后，分别加入终浓度为 0. 5、1. 0、2. 0、4. 0、
8. 0 mg /mL 的 HSJ，阳性对照组加入终浓度为
0. 06 mg /mL多柔比星;同时设阴性对照组和空白对
照组，每组设 3 个复孔。细胞分别继续培养至 24、
48、72 h时，每孔加入 MTT(5 mg /mL)20 μL，继续
培养 4 h，离心弃上清。每孔加入 150 μL 二甲基亚
砜充分溶解结晶。用酶标仪测定波长为 490 nm 吸
光度(A)值。按下式计算细胞生长抑制率，根据 Lo-
gistic 回归法法求出半数抑制浓度(50% inhibitory
concentration，IC50)。
细胞生长抑制率 = 1 － 实验组 A 值 －空白 A 值
对照组 A 值 －空白组 A 值
× 100%
1. 3. 2 细胞生长曲线观察 采用台盼蓝拒染法，将
5 × 104 个 /mL K562 细胞悬液接种于 24 孔培养板，
每孔 1 mL。培养 24 h 后，加入 HSJ，终浓度分别为
0. 75、1. 0、1. 5、2. 0、3. 0、4. 0 mg /mL，对照组加等体
积无血清培养基，于加入 HSJ后 1、2、3、4、5 d各取 3
孔细胞，用台盼蓝染液(0. 4 g /mL)染色后于细胞计
数板中计数，每孔计数 3 次，得出细胞浓度平均值。
以培养时间为横坐标，细胞浓度为纵坐标，绘制生长
曲线。
1. 3. 3 细胞凋亡率检测 K562 细胞经 HSJ 作用
48 h后，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液(phosphate
buffered saline，PBS)洗涤;取 1 × 106 个细胞，离心
弃上清;PBS 重悬细胞后离心弃上清，重复 2 次;收
集 1 × 105 个细胞;加入 500 μL 的 bingding buffer悬
浮细胞;加入 5 μL Annexin V -FITC 混匀后，加入
5 μL 碘化吡啶，混匀;避光室温反应;流式细胞仪检
测细胞凋亡率。
1. 3. 4 细胞周期检测 采用 DNA 倍体分析法，取
对数生长期细胞，调整细胞 5 × 104 个 /mL 浓度，培
养 24 h 后加入 HSJ，终浓度分别为 1. 0、2. 0、
4. 0 mg /mL;继续培养 48 h，离心收集细胞，PBS 洗
涤 2 次，弃上清;加入 70%乙醇固定;离心弃上清，
加入 100 μg /mL ＲNase，37℃水浴 30 min;碘化吡啶
(50 μg /mL)染色;流式细胞仪检测;计算各期细胞
比例，并按下式计算增殖指数(proliferous index，
PI)［5］:
PI =
(S + G2)
(G1 + S + G2)
× 100%
1. 4 统计分析 应用软件 SPSS 16. 0 进行统计分
析，计量资料多组间比较采用方差分析，两两比较采
用 t检验，以 P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 HSJ对 K562细胞增殖抑制率影响(表 1) 经不
同浓度HSJ作用后，K562 细胞的生长明显减慢，细胞
增殖能力受到不同程度抑制;K562细胞增殖抑制率随
着 HSJ浓度增加明显增高，同一浓度下，作用时间越
长，细胞增殖抑制率越高。经 HSJ 作用 24、48 和 72 h
后的 IC50分别为 1. 64、1. 35和 1. 01 mg /mL。
表 1 HSJ对 K562 细胞增殖抑制率影响(%，珋x ± s，n = 3)
·1251·中国公共卫生 2014 年 12 月第 30 卷第 12 期 Chin J Public Health，Dec 2014 Vol． 30 No． 12
组别(mg /mL)
HSJ作用时间(h)
24 48 72
对照组 0. 00 ± 0. 00 0. 00 ± 0. 00 0. 00 ± 0. 00
SHJ 0. 5 11. 70 ± 0. 89a 12. 78 ± 3. 03a 21. 41 ± 0. 03ab
1. 0 15. 60 ± 1. 11a 29. 20 ± 1. 92ab 30. 65 ± 0. 02ab
2. 0 46. 71 ± 2. 76a 63. 59 ± 4. 02ab 82. 90 ± 4. 34ab
4. 0 91. 88 ± 1. 87a 96. 62 ± 1. 01ab 98. 71 ± 0. 86ab
8. 0 97. 41 ± 0. 69a 98. 46 ± 0. 81ab 99. 42 ± 0. 89ab
多柔比星 0. 03 48. 05 ± 1. 56a 79. 59 ± 2. 36ab 92. 77 ± 2. 31ab
注:与对照组比较，a P ＜ 0. 05;与 24 h比较，b P ＜ 0. 05。
2. 2 HSJ 对 K562 细胞生长曲线影响(图 1) 经
HSJ作用后，K562 细胞浓度明显低于空白对照组，
各 HSJ组细胞生长明显减慢，细胞增殖能力受到不
同程度抑制。
图 1 HSJ对 K562 细胞生长曲线影响
2. 3 HSJ 对细胞凋亡率影响 对照组及 1. 0、2. 0、
4. 0 mg /mL HSJ组 K562 细胞凋亡率分别为(4. 60 ±
1. 09)%、(8. 39 ± 0. 81)%、(8. 88 ± 1. 12)% 和
(13. 42 ± 2. 04)%;与对照组比较，HSJ 各剂量组
K562 细胞凋亡率均升高，差异有统计学意义(P ＜
0. 05)。
2. 4 HSJ对细胞周期影响(表 2) K562 细胞经各
浓度 HSJ作用 48 h 后，G2 期细胞比例呈明显上升
趋势(P ＜ 0. 05)，S 期细胞比例则逐渐下降(P ＜
0. 05)。PI随着 HSJ 浓度增加逐渐下降，与对照组
比较，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。
表 2 HSJ对 K562 细胞细胞周期影响(%，珋x ± s，n = 3)
组别(mg /mL)
各期细胞比例
G1 G2 S
PI
对照组 22. 95 ± 5. 38 23. 52 ± 3. 32 53. 53 ± 7. 33 77. 05 ± 1. 30
HSJ 1. 0 26. 46 ± 6. 32 23. 22 ± 3. 43a 50. 32 ± 1. 32a 73. 54 ± 3. 23a
2. 0 27. 59 ± 6. 44 27. 21 ± 2. 31a 45. 20 ± 1. 22a 72. 41 ± 3. 31a
4. 0 28. 48 ± 2. 45a 34. 15 ± 6. 32a 37. 36 ± 8. 41a 71. 52 ± 2. 36a
注:与对照组比较，a P ＜ 0. 05。
3 讨 论
白血病被认为是多因素联合作用的结果，临床
治疗以化疗为主，但化疗药物毒性大、选择性差、容
易产生多药耐药;与此同时，中草药因在治疗疾病的
同时能调理机体功能而成为药物研发热点。本研究
结果显示，HSJ 水提取物作用后，K562 细胞生长受
到不同程度抑制，细胞增殖能力下降，且在一定范围
内与剂量和作用时间相关，表明 HSJ 对 K562 细胞
具有增殖抑制作用。本研究结果还表明，经 HSJ 水
提取物处理后的 K562 细胞凋亡率均高于对照组，
差异有统计学意义，提示 HSJ 对 K562 的增殖抑制
作用与其诱导 K562 细胞凋亡有关。
细胞周期即是 DNA 合成前期(G1 期)、DNA 合
成期(S 期)、DNA 合成后期(G2 期)、有丝分裂期
(M期)周而复始的细胞的生长、分裂循环［6］。在内
外因素影响下，细胞周期有序进行;而肿瘤细胞的重
要特征之一则是细胞增殖和分化失控，故细胞周期
调控紊乱是导致肿瘤细胞增殖失控的根本原
因［7 － 8］。本研究结果显示，在 HSJ水提取物作用 48 h
后，随 HSJ水提取物浓度增加，K562 细胞增殖指数逐
渐下降;S期细胞比例逐渐减少，G2 期细胞比例呈明
显上升趋势。提示 HSJ 能够降低 K562 细胞增殖活
性，将细胞阻滞于 G2 期，阻止其进入有丝分裂，避免
其走向无限增殖状态。HSJ 对 K562 细胞具有增殖
抑制作用，其作用与诱导 K562 细胞凋亡及阻滞
K562 细胞在 G2 期有关。
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收稿日期:2013－ 02－ 22 (解学魁编辑 韩仰欢校对)
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