全 文 ：第 9卷第 3期 生 物 化 学 杂 志
1 9 9 3年 6月 C h in es eB主o e hem ia el Jo n a r ul
V o l
.导 , N o 3
尹u 乒 . , i , 。 3
扩 >< 。 ~ 。 “ 0 。 。 “ >< “ 飞
{研究简报 l
飞 。 0 ~ 。 0 。 0 。 >< 。 >< 尸
我国产肥皂草种子活性成分的研究
郑 硕 李格娥 颜松民
(北京药物化学研究所 , 北京 1 02 20 5 )
肥皂草 ( S a p d n a r i a o f ic an ils ) 石竹科的一种观赏植物 , 原产欧洲 , 我国北方庭园有栽
培 。 全草有毒 , 根和种子毒性较大 。 家畜大量采食茎叶后出现呕吐 、 病痛 、 下痢等肠胃道症
状 。 根含肥皂草武 (S 印 ” ur ib n ) , 有强烈的粘膜刺激和溶血作用 [` ] 。
1 9 8 3年 st i rP ” ` 2 ’ 从欧洲产肥皂草的种子分得 S o oP ir n , 它抑制兔网织细胞裂解液的 蛋白
合成活性 50 % , 所需浓度 ( I C。 。 ) 是 1 . i n g / m L 、 或 0 . s n g / m L 3)I , 是目前活性最强的一种单链
核糖体失活蛋白 l e ( S i n g l e ) e h r a i o r i b o s o m e i n a e t i v i t i n g P r o t e i n a ) , 多用于抗痛药物免疫毒素的
研究 。 为了寻找高活性的核糖体失活蛋 白 ( R I P s) , 我们对国产的肥皂草种子所含蛋白质 活
性成分进行了研究 , 分得两种肥皂草素 , 现将结果报道如下 。
材 料 与 方 法
肥皂草种子购自北京植物园 。 分子量测定按 aF i b an ks 等的方法 【们 , 等电点侧 定 按 C al 一
is m oP ol as 的 方 法 【“ 〕 ; 含糖量测定用酚 一硫酸法 〔” ’ 。 消光系数测定 : 将冻千样品溶于 50 m m ol /
L 磷酸缓冲液 ( PB )S 、 P H 7 . 2 中 , 用 日本产 日立一 3 4 0 型紫外仪测定 l m g /m L 的蛋白 质溶 液
在 2 8 0 n m 波长的吸收值 , 以此推算 l % 溶液的消光系数 。 氨基酸组成分析由北京医 科 大 学
基础医学院细胞生物学教研室进行 。 用 18 一 2 4 9 的小鼠 , 腹腔给药后观察在三天内出现的死
亡数 , 用以计算急性毒性 L D 。。 值 。 参照 W o d w ar d 等 的方法 7[] 侧定其对兔网织细胞裂解液
蛋白合成的抑制活性 。
结 果 与 讨 论
一 、 肥良草案的纯化和鉴定
取 1 0 0 9 种子 , 磨碎 , 用石油醚 (沸 程 30 一 60 ℃ ) 脱 脂 , 得 脱脂 粉 约 809 犷用 8 0 二 L
0
.
1 5m o l / L N a C I
、
s m m o l / L p B s ( p H7
.
2 )提取 , 所得含蛋白溶液用硫酸按分级 ( 4 0一 10 %饱
和度 ) 沉淀 , 沉淀物重新溶 解 , 透 析 , 清 液上 C M二柱 , 用 a 0 m L 含 0一 o · 3 m ol / L N ac l,
s m m o l / L p B S ( P H 6
.
5 ) 作梯度洗脱 , 得两个峰 ( 见 F i g . 1 ) 。 收集峰 I ( 2 2一 2 6号 ) , 浓缩 ,
收稿日期 : 1 9 9 1一 0 4 一 2 0 , 修 回 日期 : 1 9 9 2 一 Dg一 1 4
37 7
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1993. 03. 026
上 Se p ha de x c 一 7 5柱 , 用: s m m o l / L 护H S ( 7 . 2 )洗脱 ,得三个峰 ( F i g . 2 ) ,收集峰 n ( 2 5一 3 3号) ,
浓缩 , 冻干 , 得肥皂草 素 1 1 18 . 7m g , 产 率 0 . 1 2% 。 收集 F i g . 1 中的峰 1 ( 3 0一 3 5号 ) , 浓
缩 , 上 G一 75 柱 , 洗脱 , 也得三个峰 (叭 g , 3) 。 收集峰 n ( 10 一 17 号 ) , 浓缩 , 冻干 , 得肥 皂
草素 1 , 约 4 0m g , 产率 0 . 0 4% 。
3
。
0
甘皿
l
e
.`
.
/
·
/I
冷二二
/
一
7
乙产
1
.
0
吕 I
考 《 l `一 ; I一 l。· 3 二 ” ` 5 } } 1
0
·
, 薯 } { 00O,`三
邑叫
/
/
}
.
_ 一 , _ 一 7
,一 、 1
/
一 、 、
1
1.恤吸.、.\、.
. 、 , 沪
2010 2 0 3 0
F r a e t io n n u m b e r
4O
0 3 0 4 O
F r a e 毛i o n n u m b e r
F i g
.
1 CM 。
: e o l u m n e h r o m a 七o g r a Ph y
s e e d
s e x t r a e七
C o l u m n 7 0 x 2
,
6 e m
F l
o
w
r a七e 4 5m L / h 6m L p e r 七u b e
t h
e
F i g
。
2 S
e p h
a
d e x G
一了5 g e l f i l t r a 七i o n o f P e a k
1 o f CM
。 : 。 o l u m n e h r o m a 乞o g a P h y
C o l u m n 7 5 x 2
.
6 e m
F l o w r a t e 5 0m L / h 6m L p e r 七u b e
.1of
/ 、 l
1
.
0
品”丈
0
.
5
/
{
/ 一气
.`了口//1 _ _ _
`、
0 1 0 20 3 0
F r a c t io n n u m b
e r
、 、 一 ~ 沪
,
. .
. ~
-
日` . . .
4 O 5 O
F l g
.
3 S e P h
a
d
e x G
一
75 g e l f i l t
r a 乞i o n o f P e a k
1 o f C M
。 : e o l u m n e h r o m a t o g r a P h y
C o lu m n 7 5 x 2
.
6 e m
F l o w
r a 七e 5 6m L / h 7m L p e r 七u b e
F ig
.
4 S D S
一
P A G E o f
s a p o r i n ( e h )
1
.
s
t
a n d
a r
d P
r o t e i n s
2
、
s a P o r i n ( e h )
一
I
3
.
s a p o r i n ( c h ) 一 1
肥皂草素 I 、 且经 SD S一 P A G E 鉴定 , 结果 ( iF g . 4) 表明为单一蛋白区带 。
二 、 理化性质
用 S D S一 P A G E 测得肥皂草素 I
1
.飞% , 等电点均为 9 . 6 。 据报道
、
1 的分子量分别为 2 6 0 0 0 和 2 5 5 0 0 , 含 糖 量 1 0 . 1% 和
s a P o r i n ha 分子量为 2 9 5 0 0 , 等电点 ) 9 . 5 , 但不含糖 。 肥皂
草素 I 的消光系数 E奚普。 , ; 。 。 = 6 . 0 , 与 S a P o r i n 一 6相同 [3 1 。
3 7 8
肥皂章素和 弓a oP r而 的氨基酸组成见 aT b el l 。从表中看出 ,四种蛋白的门冬氮酸 、 谷氨酸、
赖氨酸和亮氮酸含量均较高 , 胧氨酸和组氨酸含量少或无 。 这是它们的相同点 ; 但肥皂草素
n 的甘氨酸含量特别高 。
T a b l e 1 A m i n o a e i d e o m P o s i t i o n o f s a P o r i n ( e h ) a n d s a P o r i n
A m i n o a e i d s a P o r i n ( e h )
一 1 s a P o r i n ( e h ) 一 1 日 a P o r i n 一 6 日a P o r i n 一 9
,几目上5丹舀通介口J份.…九口ō七.舀no.18ù恤U曰11.上0自,,人A s PT h rS G r
G l u
G l y
A l
a
C y
s
V a l
M O乞
I l e
L e U
T y
r
P h e
L y s
H 15
A
r g
P r o
2 8
。
1 3
。
;: :
1 4
.
9
1 6
。
8
0
1 6
。
1
0
。
5
12
。
3
18
。
7
7
。
6
11
.
4
1 8
。
1
0
。
3
9
.
8
5
.
0
25
。
7
10
。
9
13
.
1
26
.
9
51
。
0
1 4
。
1
O
15
.
4
1
。
8
9
。
8
1 6
。
6
6
.
8
9
。
7
2 0
。
4
2
。
7
1 1
。
6
4
.
8
1 9
。
3
肠。 4
一ó3.0ùU山几Oj .。口. .…之呀行`.0确0口O甘人UQO,幼,土1占n`二几JI
1 4
.
2 3
。
13
。
8
2 4
。
9
1 4
。
2 2
。
1 7
.
2 6
。
1 2
。
7
7
。
3
1 0
。
8
7
。 日
三 、 生物学性质
肥皂草素 I 、 且对小鼠 L D S 。 分别 2 . 8 2 (2 . 38 一 3 . 3 4) 和 > s m g k/ g , 中毒动物安静 、 麻痹
性眼睑下垂 , 可食到不食 、 肌松 、 呼吸困难 、 瘫痪死亡 。 S aP or in 一6 , 9 观察 6 天的 L D 。。 分别
为 4 和 1 . 7 m g k/ g 。 我们在毒性实验 中发现 , 中毒动物的死亡大多数出现在给药后前三天 ,到
第四天部分动物虽有明显中毒症状 , 但已进入恢复阶段 , 一般不再死亡 。 所以观察三天与六
天的结果不会有明显差别 。 肥皂草 工对无细胞体系蛋白合成的抑制 活 性 (I C 。。 ) 是 0 . O 7 n g /
m L
。 而 S a P 0 r i n 一 6 , 9 均为 1 . I n g / m L 〔“ 了 , 进一步纯化的 S a P o r i n 一 6 为 0 . s n g / m L 〔 8 1 。
经比较看出 ,从我国产肥皂草种子分得的肥皂草素和从欧洲产肥皂草种子分得的 S aP Or in ,
其氨基酸组成 、 等电点 、 消光系数接近或相同 , 但含搪量 、 分子量和生物活性却有较明显的
差别 。 肥皂草素 且的毒性较小 , 在免疫毒素的研究中可能更值得重视 。
鉴于肥皂草素有一定毒性 , 且含量高 (0 . 16 % ) , 可能是种子的主要有毒成分之一 。
致谢 : 蛋自合成试脸结果由军事医学科学院基础所 沈倍奋研究员等提供 , 谨致谢意
献
3口ndl
参 考 文
陈冀胜 , 郑硕 。 中国有毒植物 , 北京 : 科学 出版社 , 1 9 8了.
5 t i
r P e T
, e t a l
.
B i o c无仑仍 J , 1 9 8 3 , 2 16 * 6 1 7一 6 2 5
L a P P i D A
, e t a l
.
B 城o c无e 价 B `o 夕h夕5 R e 习 C o 仍仍韶一 1 9 8 5 , 1 2 9 : 93 4一9 4 2
4 F a i b
a n k s G
, e七 a l . B 云o c h e 小感s ` r 夕, 19 7 1 , 1 0 ( 13 ) : 2 6 0 6一 2 6 1 7
3 7 9
忘
6
7
C a t s im p o o l a . N
,
A 招。 l 力` o e几e 拼 , 2 0 6 5 , 2 6 - 一。一` a Z
奋子资 。 蛋白质和醉学研究方法 (第一册 ) , 北京 , 科学 出版社 , 1 9 8叭
W o o d w a r d W R
, e 七 a l . I n , M o l d a v e K a n d G r o s 日m a n L
( 30 ) N e w Y o r k a n d L
o n d o n , A e a d e m i e P r e s s
,
1 0 7 4 : 7 2 4
3犷
e d
, 万 e `几。 己。 `。 百。 : , 。 o t o夕梦 ,
T h e S t u d y o f B i o a e t i v i t i n g C o m P o n e n t f r o m t h e S e e d s
o f s即 o n a r i a o f f i e i n a l i s i n C h in a
Z h e n g , s h u o L i , G e一 e Y a n , S o n g一m i n
( I : s t 云` 。 `。 o f P h a , 二 a e e 。 忿玄e a l C h e , 云s t , 犷 , B e i了苏: 9 1 0 2 2 0 5 )