全 文 ：第 7 2卷 第 3 期 生物化学与生物物理学报
1 99 5年 5月 A C TA BI O C HI M I C A o tI BO PY HSI C A SI NI O A
Vo f
.
2讯 No .3
M
ay
,
1 9 95
肥皂草毒蛋白的纯化 、 性质及
晶体生长研究关
黄东宏 邱 巍 傅珠现 叶晓明 潘克核
(中国科学院福建物质结构研究所 , 福州 35 以沁 2 )
关键词 肥皂草毒蛋白 ;核塘体失活蛋白; 纯化; 晶体生长
核糖体失活蛋白 ( ir b o o am e峨 n a e 桩 v a 七i n g p r o 七e i n s , 简称 : R I P 日)是一类从植物中分
漓得到的 , 具有抑制真核细胞蛋白质合成活性的蛋白质。 它们主要分为两种 , 单链和双链
核搪体失活蛋白。 单链 R l r 。 , 由于其对完整细胞的毒性很低 , 而对无细胞体系中蛋白质
生物合成具有强烈的抑制作用。 与单克隆抗体结合后制备的免疫毒素 , 其定向性完全取
抉于抗体的特异性 , 因此能用于体内 , 是理想的毒性基团 。 近年来 , 国外学者使用单链
丑 I p 。 作为一个潜在的抗 H I V 制剂 , 已取得令人鼓舞的结果 1[ 。
自从 承 ir p e 等23[ 于 1 98 3 年首次分离得到肥皂草毒蛋白 (简称 : 肥皂草素 ) 以来 , 由于
其含 量高 , 抑制活性强 , 有效组分多 , 是一个十分有代表性的单链 R工称 , 国内外学者对其
进行了多方面的研究闭。 我们在 自己的研究工作中 , 发现按出 i r eP 的方法分离出来的蛋
白质含有不纯的杂质 。 因此 , 我们改进了纯化方法 , 得到了电泳单一纯度的第 5 、 6 和第 9
峰 (简称 5 0 一 5 、 5 0 一 6 和 8 0 一田3 个活性组份 , 经筛选晶体生长条件 , 获得了 5 0 一 6 和 5 0 一 9
一蛋白质晶体。
材 料 和 方 法
.1 材杆 肥皂草种子购自北京植物园 ; OM - S e户 a or se 几的 夕lo w , hP a二` ia 产
品 ; OM ot 3 2 纤维素 , 下V上a七nI a n 产品 ; 蛋白质合成测定试剂盒 , h o m eg a 产品 ; 三轻基氨基
甲烷件仕15 ) , F l uk a 产品 ; 2 一m e七h贝刁 , 夯p e n 七a n d i o l ( M P D ) , M e r e k 产品 ; 聚 乙二醇
( P E 4G 0 0)
,
iS g m a 产品 ; N 一 2一经乙基味嗓一N ,刁一乙磺酸 ( H eP 朋 ) , 购 自华美公司上海分
公司 ; 低分子量标准蛋白 , 购自上海生化所东风生化试剂厂 ; 其他试剂均为分析纯 。
2
. 方法 分子量的测定 : 按 P ia ba n k 。 等山的方法。 等电聚焦 电泳按 G a 加 im oD于
玩尹 , 的方法进行。 氨基酸组份分析 , 在日本岛津 L O一A 高效液相色谱仪上 , 用酸解法测
定蛋白质的氨基酸组成 。 蛋白质合成抑制活性测定: 用 rP o m eg a 公司的无细胞体系蛋 白
质抑制合成测定试剂盒 , 测定荧光素的发光强度以确定毒蛋白对荧光素酶合成的抑制强
渡。 蛋白质晶体生长 : 按 M eP h er so 。 〔们 的方法 , 悬滴气相扩散法 , 室温下墙养 。
本文 1 9 9 3 年 1 2 月 2 9 日收到 , 修改稿 1 9 9 4 年 4 月 5 日收到。
. 中国科学院重大项目和国家自然科学基金重点项目资助。
生 物 化 学 与 生 物物 理 学报 27卷
结 果 与 讨 论
一 、 5 0一肠、 5 0书 和 5 0书 的纯化和鉴定
称取肥皂草种子 1 09 0, 用 80 0 m l 含 0 . 9多 N a ol 的 5 m m ol / L p H 7 . 2 磷酸盐 缓冲
P
e a k 且
ō七
.-内叹
10 2 0 3 0 4 0 50 60 70
一丽
F r a e it o n n帅卜叮
C M
e s e p h ar os e F as t F lo w c of u n江n
oJ了`了`峨含、.甘
匆
经在
。 il r o ln a七Og r p h y o f 七h e s e ed e x tr ao t
C o lum
n , Z o x l
.
6 o m ; 丑o w l a t e , OS m 】两 ;
5功 1 P e r f功Ot fo n .
液 ( P B )S 浸泡 4 小时以上 , 经高速组织捣碎机
匀浆两次 ( Z x 3 m i n ) , 于 4 0 0 抽提过夜。 离
心 , 上清液用硫酸按 (4 O~ 10 0多饱和度 )分级
沉淀 , 沉淀物用 s m m ol / L p且 6 . S P B S 重新
溶解 、 透析 , 清液上 OM一eP h a加 se P as 七 F卜
o w 柱 , 用含 0 . l m ol / L 和 0 . 2 m ol / L N a o l
的相同卫B S 进行阶段洗脱 , 得两个峰 (图 l) ,
将峰 工和峰 1 对 s m m o l/ L p H 6 . 5 的 P B 3
透析后 , 分别上 OM - 3 2 柱 , 再分别用 4 0 m l
含 0~ 0 . 2 m o l / L 和 0 . 1 、 0 . 3 m ol / L N a血
的同一 F B S 作梯度洗脱 , 共得 9 个峰 (图 Z A
和图 ZB ) 。 其中以第 6 和第 9 峰含量最高。
收集 第 5 、 第 6 和第 9 峰 , 透 析冻 干。
S D -S r A G E 鉴定 , 结果 (图 a) 表明为一条蛋白区带, 加 1多冬琉基 乙醇 , 电泳带不变 。
等电聚焦上也呈现一条带。
ónU
:
通ù八」
口么工沙帷孟六09曰n“0嘴 2
.
0 侧一片一刁:.:〕 . 口 . . 口口 . . . 口 .口 . . . . . 口,
, , 吧二
10 20 3 0 4 0 5 0 60 70
T u b e
`
n U功 b口
80 之尸乞` 1 0 20 印 . 7 0 80
乃 9 . 2人 C M-3 3 o o l u mn o h r o ln a t馆 r a P h y
o f p e ak 1 f
r o m F i g
.
1
C
o lu m n
,
2 0 x 1
.
6 cm ; 且o w ar t e
,
3 0 {m l八 s m l / t u 切-
F i g
.
Z B C M一2 o o l u姗 o h r o m at o g r a P h y
o f P o a k 1 1 f r o m F i g
.
1
C o l恤 n , 2 0 x l . 6 e m , 且o w 了 a 七e , 3 0 m l / h s m l / t u b 氏
二 、 理化性质
用 S D S卜P A G E 测得肥皂草素 5 -0 5 、 8 0 一 6 和 5 0 一 9 的分子量均为 2 95 0 0 , 等电点均大
于 9 . 5 。 氨基基酸组成 (数表略)中 , 均含有较高的天冬氨酸和谷氨酸 , 尤其 S任 9 , 分别达
到 3 5 和 韶 个。 据 K u b ot 淤刀 认为 , 这两种氨基酸在分子中多以酞胺形式存在 , 从而使蛋
白质仍然保持较高的 r 工值。
三、 蛋 白质合 成抑制活性
在 卫, 。二 ge a 测试系 统 中 , 5 0卜6 、 5 0闭 和 5 0 一 9 的 工嘶 分别为 0 . 0习4 , 0 . 004 租

3 3 6生物 化 学 与 生物 物理 学报 27 卷
喊 8 0 .
[ .〕 M e Ph。珊 n, A . , 尸 r妙溯`幻 , a诚 A协 z , s钻 of P 犷。 艺` 二 0 护岁` a Zs , 1 9 8 2 , 9 6 , J 比 n W i le y & OS n , , I n e . , N e ,
Y o r k
.
1 7 ] K ub
a七a , 5 . , e名 a z . , C o n f o r nr : t lo n o f a be r t i f a e i e n 七 P r o t e i an : 竹 i比 ao a 。 七h i n , , nt o m o : e h a : i n an d 月we m -o
. 。工。 h盯加 . B匆。加仍 . B名卯几刀召 . 过川 a , 1 9 8 6 , 87 1 : 1 0 .1
P u r i f i e a t i o n
,
C h a r a c t e r i z a t i o n a n d C r y s t a l
G r o w t h o f S a p o r i n s
H U A N G D o n g 一H o n g
,
Q I U W
e i
,
F U Z h u se j
,
Y E X i a于 M i n g a n d P A N K e se Z h e n
伊“ J翻切 Z解忿“ 耐 e of 五 es ae 砌 h 如 艺he 别娜以讲 e of M创妇几
A
c
ad
e仍幻 州 ; 初 a , 尸翻为。 “ 35 仪旧幻
人 B S T R A C T
丁h r e e as p o ir n 日 w er 6 e p o r a 七e d a n d p u ir if e d fr o m 让 e s e e d e l 龙r a 。切 o f 尽叩咖 r感。哪o感? la Z拓 b y p r e o i p i加么i o n a七4 0” 1 0 0多 。 a加 r a七i o n o f (N H 一) 2 5氏 , a n d OM一 eS p h a r o s e
a n d OM一ce l l u l o o e o o lum
n O h r o m 二切 g r a Phy
.
T h e i r m o l e o n l a r w e i g h 七5 a r e a b o n t
2 9 5 0 0 a n d P l v a l u e 日 h i g h er 让 a n 9 . 5 . T h e y a er 日i n g l问h a in ir b o s o m -e i n a o七i v a t i n g
p or t e i n 。 ( R l卫s ) a n d h a v e 和 t e n 七 a o t i v i七y o f i hn i b i桩 n g p r o七e in o y n让 e o i s . A f七e r
日e r e e n i n g a l a r g e n u m b e r o f o o n d i七i o n s f o r g or w i n g , 恤e P r o七e i n o r y的 a l s f o r 俪 0 o f
七h e m w e r e o b七a i n e d .
K E Y 习叮O R D :s
gr o w 七h
S a和 ir n 。 : R i b 0 0 0 m e 一 i an e七i v a 桩 n g P r o 七e i n ; uP ir if e a 桩 o n : 0厂y 。七a l