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白木通籽分离蛋白的理化与功能性质研究
史 卿，杜研学，赵 强，阮 霞，熊 华* ，钟红兰，白春清，黄声芳
( 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047)
摘 要:以白木通籽为原料，采用碱提酸沉法，制备白木通籽分离蛋白(API) ，并对其理化性质与功能性质进行了分析。
结果表明:白木通籽分离蛋白含17 种氨基酸，其中谷氨酸和天门冬氨酸的含量相对较高，有贮藏蛋白的共性。苏氨酸
为白木通籽分离蛋白的第一限制性氨基酸。通过 SDS－PAGE分析，白木通籽分离蛋白的亚基分子量范围为 25～35ku。
圆二色性光谱分析表明，白木通籽分离蛋白的二级结构主要由 β－折叠和无规则卷曲组成，含量分别为 31.2%和
36.6%。白木通籽分离蛋白的等电点在 pH4～5 之间，在此 pH范围内，蛋白的溶解性和起泡能力均最低。
关键词:白木通籽分离蛋白，理化性质，功能性质
Physicochemical and functional properties of protein isolate extracted
from Akebia trifoliata var.australis seed
SHI Qing，DU Yan－xue，ZHAO Qiang，RUAN Xia，XIONG Hua* ，
ZHONG Hong－ lan，BAI Chun－qing，HUANG Sheng－fang
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)
Abstract:Akebia trifoliata var. australis seed protein isolate(API)was prepared using the methods of alkali
extraction and acid precipitation. The physicochemical and functional properties of API were characterized. The
results showed that API contained 17 kinds of amino acids. Glutamic acid and aspartic acid were the most
abundant amino acids in API，consistent with most storage proteins.With respect to nutritional parameter，threonine
was found as the first limiting amino acids for API.From the analysis of SDS－PAGE，molecular weights of API were
from 25.0 ～ 35.0ku. Accounting for 31.2% and 36.6% . β － strand and random coil were found to be the major
secondary structures in API.The isoelectric point of API was between 4 and 5.Protein solubility and the foaming
capacity were minimal at that pH values.
Key words:Akebia trifoliata var.australis seed protein isolate;physicochemical properties;functional properties
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2012)23－0076－05
收稿日期:2012－06－18 * 通讯联系人
作者简介:史卿(1987－) ，女，硕士研究生，研究方向:食物( 含生物质)
资源开发与利用。
基金项目:江西省科技计划项目(20122BBF60061) ; 南昌大学食品科
学与技术国家重点实验室目标导向项目(SKLF － MB －
201005) ;江西省重大招标项目－茶油绿色高效加工及质量
安全技术研究与示范( 赣科发2010［217］号)。
白木通(Akebia trifoliate (Thunb.)Koidz. var.
australis(Diels)Rehd) 属于木通科木通属植物，据《中
国药典》2005 版一部记载，其干燥茎藤入药可作木通
用，味苦，性寒，具利尿、活血通脉、抗菌消炎之功
效［1］。白木通果肉呈乳白色，含丰富的淀粉和可溶
性糖，味美可食，果肉中含 17 种氨基酸，蛋白质总
量为 0.98g /100g，维生素 C 含量高达 84mg /100g，
另外还含丰富的钙、钠、锌、镁、钾等矿质元素［2］，其
果肉的营养成分结构与沙棘大体相当。据医学研
究表明，白木通茎藤具利尿、镇痛和抗炎的作用。
白梅荣等［3］通过大鼠代谢笼法、体外抑菌实验、小
鼠耳肿胀法研究比较三叶木通和五叶木通的水煎
剂利尿、抑菌和抗炎作用，结果发现两种木通的利
尿等药理作用基本相同。除此之外，木通中还具有
抗癌功效的成分。白木通果无毒。江西省很多地
区，如九江、萍乡、抚州等地，长期以来白木通都作
为野生水果被食用，囊肉可用于熬糖; 根、茎、叶可
以泡茶;皮、籽、根、茎和叶均可入药。江西省科研
技术人员通过采集白木通野生藤，经过多年驯化种
植，已经培育出高产油、高结果率的新白木通果，平
均产量可达 3000 斤 /亩，最高产量可达 6000 斤 /
亩。通过对白木通籽和果皮基本组成进行成分分
析，证明白木通是非常有价值的资源，急需开发利
用。白木通籽是一种油料籽，有关部门已将其作为
一种特种油来开发以缓解国内食用油资源紧张的
压力。白木通籽中油脂含量为 39.33%、粗蛋白含
量为 17.89%［4］，经提取油脂后，其饼粕中含有大量
的蛋白( 约42%) ，为提高木通籽的综合利用，急需
对蛋白进行开发研究。本文以白木通籽为原料，利
用经典的碱提酸沉法，制备了白木通籽分离蛋白，
系统的探讨了蛋白的理化性质、功能性质及评价，
旨在初步研究白木通籽蛋白的物化特性，为其应用
于工业化生产提供一定的理论基础。
77
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
白木通籽 庐山东林寺果园;大豆油 市售; 牛
血清白蛋白 上海蓝季科技发展有限公司; 四甲基
乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基
胺基甲烷(Tris)、1－苯胺基萘－8－磺酸(ANS)、β－巯
基乙醇、氢氧化钠、盐酸、溴酚蓝、磷酸氢二钠、磷酸
二氢钾等试剂 均为分析纯。
KDY－9820 凯氏定氮仪 厦门精艺兴业科技有
限公司;FD－1 冷冻干燥机 北京神泰伟业仪器设备
有限公司;LXJ－IIB 离心机 上海安亭科学仪器厂;
RH basic 1 磁力搅拌器、高速分散匀浆机 德国 IKA
公司;新世纪T6 紫外分光光度计 北京普析通用仪
器有限公司;L8800 氨基酸自动分析仪、F－4500 荧光
分光光度计 日本日立公司;SPX－250 电泳仪 美
国伯乐公司;MOS－450 圆二色光谱仪 法国 Bio－
Logic公司;Quanta200F 电子扫描显微镜 美国 FEI
公司;精密pH 计 赛多利斯科学仪器( 北京) 有限
公司。
1.2 实验方法
1.2.1 原料前处理 白木通籽干燥去除水分后，手
工去皮，粉碎过筛，按固液比 1∶3 加入正己烷室温下
磁力搅拌脱脂 2h，重复三次，离心、烘干正己烷后得
到脱脂白木通籽粉(DAF)。
1.2.2 白木通籽分离蛋白(API) 的制备 采用碱提
酸沉法制备白木通籽分离蛋白:50g DAF 溶解至
500mL蒸馏水中，用 1mol /L NaOH 调节 pH 至 10.0，
温度 35℃，在磁力搅拌器上搅拌提取 1.5h 后离心
(5000 × g，15min) ，残渣重复提取2 次，合并上清液。
用 1mol /L HCl调节上清液 pH至 4.5，4℃静置 30min
后离心(5000 × g，15min) 弃去上清液，水洗，调pH至
7.0 后置于超低温冰箱中－80℃预冻过夜，后置于真
空冷冻干燥箱中干燥。
1.2.3 白木通籽化学组成分析 采用国家标准方
法对样品的水分、灰分、蛋白、脂肪和纤维素进行
测定。
1.2.4 氨基酸组成及评价 称取白木通籽分离蛋白
0.25g，将样品置于水解管中，加入含有 10mmol /L 多
酚的 6mol /L盐酸溶液，真空封口。在 110℃下水解
24h，冷却后定容、过滤和蒸干，采用氨基酸自动分析
仪上样测定蛋白质的氨基酸含量。氨基酸含量以
g /100g蛋白表示。
1.2.4.1 氨基酸评分(%) 以FAO /WHO(2007)［5］
小孩推荐模式为参考按照如下公式计算:
氨基酸评分(%)=每克被测蛋白样品中某一必
需氨基酸含量(mg)/FAO /WHO 标准模式中相同必
需氨基酸含量(mg)× 100 式(1)
1.2.4.2 九种必需氨基酸的数量与总氨基酸的数量
之比 E /T(%)。
1.2.4.3 蛋白质功效比值(PER) 的估算 Alsmeyer［6］
等人提出的回归方程计算:
PER(Ⅰ)= －0.684 + 0.456(Leu)－0.047(Pro)
PER(Ⅱ)= －0.468 + 0.454(Leu)－0.105(Tyr)
式(2)
PER(Ⅲ)= －1.816 + 0.435(Met)+ 0.780(Leu)
+ 0.21l(His)－0.944(Tyr)
1.2.4.4 蛋白质生物价(BV) 的估算 根据Morup 和
Olesen［7］提出的回归方程计算:
BV =102. 15 × q0. 41Lys × q
0. 60
Phe + Tyr × q
0. 77
Met + Cys × q
2. 4
Thr × q
0. 21
Trp
式(3)
其中，当 ai 样品≤ai 参考时，qi =
ai 样品
ai 参考
; 当ai
样品≥ai参考时，qi =
ai 参考
ai 样品
。ai代表一种蛋白中某
种必需氨基酸的含量与必需氨基酸总量的比值。
1.2.5 十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
－PAGE) 分析 参考Laemmli 方法［8］采用不连续缓
冲液系统，浓缩胶和分离胶质量浓度分别为 5%和
12.5%。蛋白样品溶解于 0.05mol /L Tris－ HCl 缓冲
溶液( 含质量分数1%的 SDS，1%的 β－巯基乙醇，
40%的蔗糖和 0.02%的溴酚蓝) 中配制成质量浓度
1mg /mL的溶液，样品上样前在沸水中加热 5min，离
心(10000 × g，10min)。取上清液 10μL 进样，电泳在
室温条件下，浓缩胶中电流恒定为 15mA，当样品前
沿到达分离胶时电流改为 25mA。电泳结束后，用
0.05%考马斯亮蓝 R－250 溶液( 染料溶解于体积比
为 46∶227∶227 的冰乙酸、甲醇和水混合溶液中) 染色
3h，后用体积比为 50∶75∶875 的甲醇、乙酸和水混合
溶液对凝胶脱色 6h。蛋白标品的分子量范围
15～170ku。
1.2.6 扫描电镜(SEM) 观察 采用FEI 公司的
Quanta 200F 型电子扫描显微镜(Scanning Electron
Microscope，SEM) 对蛋白显微形态进行观察。蛋白样
品经过粘台、喷金等步骤后，在加速电压为 20kV 的
条件下用 SEM进行观察。
1.2.7 圆二色谱分析 蛋白样品的二级结构组成采
用法国 Bio－Logic公司的 MOS－450 型旋光分光计测
定。称取一定质量的蛋白样品，分散于 10mmol /L 磷
酸缓冲液(pH7.2) 中使蛋白质量浓度为0.1mg /mL。
测定前过微孔滤膜(0.45μm) ，采用远紫外区CD 光
谱，扫描范围为 190～250nm，样品池光程 1mm，每个
样品扫描三次取平均值，测定参数: 分辨率1nm，捕
获时间 1s，带宽 0.5nm，灵敏度 100mdeg /cm。以磷酸
缓冲液为空白对照［9］。
1.2.8 溶解度 将蛋白样品溶于蒸馏水中，配制成
质量分数为 1%的蛋白溶液，于磁力搅拌器上搅拌
30min 使其充分分散，而后用 0.5mol /L 盐酸或
0.5mol /L氢氧化钠将溶液 pH 分别调至 2～12，25℃
继续搅拌溶解 30min 后 5000 × g 离心 15min。用
Lowry法［10］测定上清液中蛋白质的含量，以牛血清蛋
白为标准蛋白。每组实验做三组平行对照。
溶解度(NSI，%)= 上清液中蛋白质的质量
样品中蛋白质的质量
×
100 式(4)
1.2.9 表面疏水性测定 采用荧光探针剂 ANS
法［11］。将样品分散于 0.01mol /L、pH7.0 磷酸缓冲液
中配制成 1mg /mL的原液，后用相同缓冲液将其稀释
成 50、100、150、200、250μg /mL 五个系列浓度的溶
78
液。每 4mL系列浓度的蛋白溶液加入 50μL的 1－苯
胺基－8－萘磺酸(1－ anilino－8－ naphthalene sulfonic
acid，ANS) 溶液(8mmol /L ANS 溶于 0.01mol /L 磷酸
盐缓冲液)。混匀后采用荧光分光光度计测定，操作
条件为:激发波长390nm，扫描范围 400～700nm，扫描
速度 500nm /min，激发狭缝和发射狭缝宽均为 3nm。
响应时间为 0.1s，记录 470nm 波长处的荧光发射强
度，用荧光强度对蛋白溶液浓度作图并进行线性回
归，以线性回归斜率作为表面疏水性的指标。每组
实验做三组平行对照。
1.2.10 起泡性与起泡稳定性 参照文献［12］以不
同 pH(3.0、5.0、7.0、9.0) 的磷酸缓冲溶液配制20mL
质量浓度为 1%的蛋白溶液，采用高速分散匀浆机
均质 1min(15000r /min) 后，迅速记录泡沫所占的体
积 V1;室温下静置30min 后，再次记录泡沫的残余
体积 V2，每组实验做三组平行对照。计算公式如式
5、式 6:
起泡性(%)= V1 /V0 × 100 式(5)
起泡稳定性(%)= V2 /V0 × 100 式(6)
式中:V0 为蛋白溶液的体积，即 20mL。
2 结果与分析
2.1 白木通籽化学组成分析
对白木通籽化学组成进行分析，每个成分测定
三次，取平均值。白木通籽中水分为 6.23%，灰分
3.58%，粗脂肪 38.83%，蛋白质 17.23%。其中粗脂
肪含量与花生中油脂含量相当，蛋白质含量略高于
豆荚中蛋白含量。白木通籽经脱皮和脱脂后，油脂
和蛋白含量分别为 5.12%和 41.83%。白木通籽分
离蛋白的纯度为 86.04%，其提取率为 82.65%。可
见，白木通籽中蛋白含量高，经油脂加工后，脱脂粉
将会作为一种新型的丰富植物蛋白资源而被大力
开发。
2.2 氨基酸组成及评价
表 1 为白木通籽分离蛋白的氨基酸含量分析结
果，并以 FAO /WHO(2007) 推荐模式作对照对其氨
基酸进行评价。数据显示，白木通籽分离蛋白中谷
氨酸和天门冬氨酸含量最高，分别为 17.84g /100g 蛋
白和 11.63g /100g 蛋白。必需氨基酸中，与 FAO /
WHO(2007)2～5 岁小孩的推荐模式相比，白木通籽
分离蛋白含较高的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨
酸、赖氨酸和芳香族氨基酸;苏氨酸和含硫氨基酸含
量与之相比较低。然而，此 8 种必需氨基酸含量均
高于 FAO /WHO(2007) 成人推荐模式。值得一提的
是，赖氨酸一般是谷物中的限制性氨基酸，白木通籽
分离蛋白中赖氨酸含量为 5.91 /100g 蛋白，明显高于
大米中赖氨酸的含量(3.7g /100g)［13］。白木通籽分
离蛋白组分与 FAO /WHO(2007) 小孩推荐模式相比
的氨基酸评分结果显示，苏氨酸为白木通籽分离蛋
白的第一限制性氨基酸，含硫氨基酸为分离蛋白的
第二限制性氨基酸。白木通籽分离蛋白 E /T值高于
FAO /WHO衡量理想蛋白资源的推荐值(36%) ，其
PER值与优质蛋白的衡量标准值 2.00 相比属于优质
蛋白。
表 1 白木通籽分离蛋白氨基酸分析结果
(g /100g蛋白) 及其氨基酸评价
Table 1 Amino acid composition
of API and its amino acid score
氨基酸 API 氨基酸评分 FAO/WHO
a 推荐模式
小孩 成人
Asp 11.63
Thr 2.64 77.64 3.4 0.9
Ser 6.01
Glu 17.84
Pro 7.84
Gly 4.43
Ala 4.35
Cys 0.34
Val 5.06 144.57 3.5 1.3
Met 1.96
Ile 3.64 130 2.8 1.3
Leu 8.54 129.39 6.6 1.9
Tyr 4.36
Phe 5.02
Lys 5.91 101.9 5.8 1.6
His 2.43 127.89 1.9 1.6
Arg 8.34
SAAb 2.3 92 2.3 2.3
ARMc 9.38 148.89 9.38 9.38
E /T(%) 39.8
PER Ⅰ 2.84
PER Ⅱ 2.95
PER Ⅲ 2.09
BV 49.25
注:a:FAO/WHO(2007) ;b: 含硫氨基酸( 甲硫氨酸+半胱氨
酸) ;c:芳香族氨基酸( 酪氨酸+苯丙氨酸)。
2.3 SDS－PAGE分析
图 1 为白木通籽分离蛋白在还原状态下的电泳
图谱。由图可知，白木通籽分离蛋白的主要亚基分
子量范围为 25～35ku。与传统蛋白资源( 如花生、大
豆蛋白) 相比，白木通籽分离蛋白的亚基分子量
较小。
图 1 白木通籽分离蛋白 SDS－PAGE电泳图
Fig.1 SDS－PAGE patterns of API
注:M为标准蛋白;1 为分离蛋白。
2.4 表面形态观察
蛋白提取过程中，采用不同的萃取液制备的蛋
白可能会呈现不同的分子形态结构。传统碱提酸沉
法提取得到的白木通籽分离蛋白在 400、1600 倍的扫
描电镜下的表面微观结构如图 2 所示。白木通籽分
离蛋白的分子结构形态类似晶状体，晶状体结构比
79
较疏松，分布不均匀，而且表面也不平整。
图 2 API超微结果
Fig.2 Microphotograms of API in SEM
注:左× 400 倍，右 × 1600 倍。
2.5 圆二色谱结果
采用远紫外圆二色光谱测定白木通籽分离蛋白
的二级结构组成。结果显示，白木通籽分离蛋白的
二级结构由 11.9% 的 α－螺旋，31.2% 的 β－折叠，
20.3%的转角和 36.6%的无规则卷曲构成，如表 2 所
示。这说明 β－折叠和无规则卷曲是白木通籽分离
蛋白的主要二级结构，荞麦蛋白中也发现了相类似
的结果［14］。
图 3 白木通籽分离蛋白的圆二色谱曲线
Fig.3 Circular dichroism spectroscopy of API
表 2 白木通籽分离蛋白圆二色谱结果
Table 2 Secondary structures of API
蛋白样品
二级结构(%)
α－螺旋 β－折叠 转角 无规则卷曲
API 11.9 31.2 20.3 36.6
2.6 溶解性
蛋白质的溶解性是功能性质中最重要的一个性
质，它会极大地影响其他功能性质，同时又受 pH 的
影响。白木通籽分离蛋白溶解性随 pH 的变化曲线
如图 4 所示。白木通籽分离蛋白的溶解性曲线呈现
U形，随着 pH 的增加，溶解度先降低，而后在 pH5～
10 范围内持续上升。在 pH4～5 内，蛋白溶解度呈现
最低值，此时白木通籽分离蛋白的溶解度为 2.10%。
一般而言，蛋白质的溶解度在其等电点附近是最低
的，越远离等电点，溶解性越好。原因是在等电点
时，电荷斥力消失，从而导致蛋白分子表面电荷为
零［15］。白木通籽分离蛋白的高溶解性能在 pH 达
10.0 以上呈现出来。
2.7 表面疏水性
表面疏水性表明了蛋白质分子疏水性区域的暴
露程度，能够极大地影响蛋白质的表面张力和乳化
活性。表明疏水性数值越高，蛋白分子间凝聚作用
图 4 白木通籽分离蛋白溶解度随 pH变化情况
Fig.4 Solubility of API as influenced by pH
力越低［16］。白木通籽分离蛋白在 pH7.0 时的表面疏
水性为 379.4。
2.8 起泡性与起泡稳定性
pH对蛋白起泡与起泡稳定性的影响如图 5 所
示。一般而言，蛋白质的高溶解性是其拥有良好起
泡性和起泡稳定性的先决条件。蛋白适当的溶解能
够增强表面吸附，对于泡沫的形成十分有利。许多
蛋白在等电点附近容易凝聚，从而降低蛋白成膜的
稳定性［17］。在强酸或强碱环境中，由于蛋白质表面
的静电荷增多，从而使蛋白质的溶解性能和表面活
性增强，最终使蛋白的起泡性能得到增强［18］。图 5
显示，起泡性图像与白木通籽分离蛋白的溶解性曲
线呈现高度的相关性。在 pH5.0 处，API 的起泡性值
最低，为 10.4%。同时，API 在 pH9.0 处呈现最高的
起泡性值(63.1%)。这种起泡性值随着 pH由 5.0 增
加到 9.0 上升的现象是由蛋白质的柔性增强引起的。
蛋白伸展开来使其快速分散到空气与水界面包埋空
气颗粒，从而使起泡能力增强［19］。
图 5 白木通籽蛋白起泡稳定性随 pH变化情况
Fig.5 Foaming capacity and foaming stability of API by pH
3 结论
本实验采用碱提酸沉法对白木通籽中可溶性蛋
白进行了提取，并对其理化性质与功能性质进行了
分析。研究表明，白木通籽分离蛋白含 17 种氨基
酸，其中谷氨酸和天门冬氨酸的含量相对较高，有贮
藏蛋白的共性。苏氨酸为白木通籽分离蛋白的第一
限制性氨基酸。白木通籽分离蛋白的等电点在
pH4～5之间，在此 pH 范围内，蛋白的溶解性和起泡
能力均为最低。这些结果可为白木通籽分离蛋白的
开发、可食用植物蛋白质的资源开发应用提供理论
依据，为开辟白木通附加值的新途径提供参考资料。
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2500－2503.
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母在发酵烟梗提取液时，以葡萄糖为主要的碳源。但
葡萄糖降低将对烟气产生不利影响，因此在后续的应
用中需补加葡萄糖。在整个发酵过程中，有机酸含量
增高，特别是非挥发性有机酸含量显著增高，从而使提
取液酸值升高，非挥发性有机酸对卷烟抽吸质量有重
要作用，它们能与生物碱结合成盐，调节质子化和游离
态烟碱比例，调节烟气 pH，使烟气平和，吸味改进，浓
度增加。烟梗提取液经生香酵母发酵后香气成分总量
在一定程度上得到提高，较未发酵相比，发酵 48h后总
香气成分增加了 172.13%，其中烤烟挥发油最重要的
致香成分之一苯乙醇增加了 47.1倍。
3.3 综上所述，生香酵母发酵烟梗提取液，能明显改
善提取液的性质，这将有利于提高烟梗在制造烟草薄
片中的价值，因为生香酵母的生长需要利用葡萄糖作
为碳源，而葡萄糖对平衡烟气吸味具有积极作用，在下
一步的研究中，需要研究葡萄糖的补加技术。
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