全 文 ：doi:10.3969/ j.issn.1002-7351.2009.02.004
台湾水青冈 ISSR-PCR体系的优化
宋文静1 , 2 ,金则新2 ,李钧敏2 ,李建辉2
(1.杭州师范大学生命与环境科学学院 ,浙江 杭州 310036;
2.台州学院生态研究所 ,浙江 临海 317000)
摘要:分析了 ISSR-PCR体系中 Mg2+、dNTP和 BSA 浓度 ,以及模板 DNA 、引物和 Taq DNA 聚合酶用量等 6 个因素对反
应结果的影响 ,建立了适合于台湾水青冈 ISSR-PCR扩增的反应体系:10 μL PCR反应液中 , 含 10 ng DNA , 1.5 mmol·L-1
Mg 2+, 0.125 mmol·L-1 4×dNTP , 1×Taq DNA聚合酶配套缓冲液(10 mmol·L-1 Tris-HCl , pH 值 9.0 , 50 mmol·L-1 KCl ,
0.1% T riton X-100), 0.6 U Taq DNA 聚合酶 , 2 mg·m L-1 BSA 和 3pmol引物。应用优化的 ISSR-PCR体系从 100 个 I SSR
引物中筛选出 12 个稳定性好 , 重复性高的引物 ,对 22 株台湾水青冈个体的 DNA 进行扩增 , 结果表明优化的 ISSR-PCR体
系完全适合于台湾水青冈的 ISSR分析。
关键词:台湾水青冈;ISSR-PCR体系;优化
中图分类号:S718.43　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-7351(2009)02-0018-05
Optimization of ISSR-PCR System of Fagus hayatae
SONGWen-jing1 , 2 , JIN Ze-xin2 , LI Jun-min2 , LI Jian-hui2
(1.College of Lif e and Environmental Science , Hangzhou Normal University , Hangzhou 310036 , Zhejiang , China;
2.Institute of Ecology , Taizhou College , Linhai 317000 , Zhejiang , China)
Abstract:This paper analyzed the influence of the 6 factors on the reaction results , the facto rs included:the concentration o f Mg2+ ,
dNTP and BSA in ISS R-PCR sy stem , as well as the dosage of the template DNA , primer and Taq DNA polymerase.It established
the response system suitable fo r ISS R-PCR amplification of Fagus hayatae:10μL o f PCR reaction solution , including 10 ng of
DNA , 1.5 mmol·L-1 of Mg 2+, 0.125 mmol·L-1 o f 4 × dNTP , 1×Taq DNA polymerase matching buffer(10 mmol·L-1 T ris-
HCl , pH value of 9.0 , 50 mmol·L-1 of KCl , 0.1% of T riton X-100), 0.6 U of Taq DNA polymerase , 2 mg·mL-1 of BSA and 3
pmol primer.With the application of optimized ISSR-PCR sy stem , 12 stability , high repeatability of primers were selected from the
100 ISSR primers.DNA amplification was carried out on 22 F.hayatae individuals , the results showed that the optimization of IS-
SR-PCR system w as completely suitable for F.hayatae ISSR analysis.
Key words:Fagus hayatae;ISSR-PCR sy stem;optimization
　　台湾水青冈(Fagus hayatae)隶属壳斗科(Fagaceae)水青冈属 ,是我国特有种。近年来 ,其数量和分布
面积都急剧减少 ,现已列入国家二级保护植物[ 1] 。台湾水青冈在台湾和大陆均有分布 ,其材质坚韧 ,纹理
细密 ,经久耐腐 ,是建筑 、车辆等的优良用材 ,具有很高的经济价值。同时台湾水青冈对于研究海岛和大陆
的植物区系有重要的学术意义 。
简单重复序列区间(inter-simple seuquence repeat , ISS R)又称 inter-SSR ,是由 Zietkiew icz等[ 2]提出的
锚定 SSR新策略 。ISSR标记技术具有成本低 、操作简单 、快速 、灵敏 、检测多态性的能力强 、所需 DNA 模
板量少等优点 ,与 RAPD技术相比 ,其产物具有更加稳定的多态性和更好的重复性[ 3] 。该技术现已广泛
应用于植物品种鉴定 、遗传作图 、基因定位 、分类 、进化及遗传多样性方面的研究[ 4-7] 。但在应用 ISSR标
记技术时 ,不同的体系可产生不同的结果 ,而且各引物并不适合于所有物种 ,因此为了确保 ISSR-PCR体
系扩增结果的可靠性和重复性 ,有必要对其进行优化。
　收稿日期:2008-08-25;修回日期:2009-01-07
　基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y504220)
　作者简介:宋文静(1983-), 女 ,安徽黄山人 , 杭州师范大学硕士研究生 ,从事植物生态学研究。
　通讯作者:金则新 , E-mail:jzx@tzc.edu.cn。
第 36 卷 第 2 期
2 0 0 9 年 6 月
福 建 林 业 科 技
Jour of Fujian Forestry Sci and Tech
Vol.36　No.2
Jun., 2 0 0 9
　　本研究以台湾水青冈叶片基因组 DNA 为模板 ,分析了 ISS R-PCR体系中 Mg2+ 、dN TP 和 BSA 浓度 ,
以及模板 DNA 、引物和 Taq DNA酶用量等 6个因素对反应结果的影响 ,建立了适合于台湾水青冈 ISSR-
PCR扩增的反应体系 ,并据此做了引物筛选 ,以期为台湾水青冈的保护遗传学和分子系统学的研究奠定
基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
实验材料采自浙江省临安市清凉峰自然保护区。随机选取 22株个体 ,每株取 10片左右的健康叶片
置于保鲜袋中 ,封口 ,编号 ,置样品贮藏箱(由超低温冰袋保持冷藏条件)带回实验室 ,洗净 ,晾干 ,于-70℃
冰箱保存备用。
1.2　方法
1.2.1　模板 DNA 提取　采用改进的 SDS法[ 8]提取台湾水青冈叶片基因组 DNA 。DNA 经 0.8%琼脂糖
凝胶电泳 ,用 GIS 凝胶成像分析系统(上海天能科技服务公司)拍照 。依据软件分析荧光面积 ,与标准
DNA分子量参照比较 、定量 ,稀释成 20 ng·μL-1 ,保存于-20℃备用。
1.2.2　ISSR-PCR体系优化
1)ISSR-PCR体系优化采用单因素试验 ,共考察 6个因素(每个因素 4 水平)对扩增结果的影响(表
1)。
2)试验以 ISSR-PCR原初扩增体系和扩增程序为基础 ,每次考察 1个因素。扩增在美国伯乐公司生
产的 PTC-220PCR仪中进行。原初扩增体系为:10 μL PCR反应液中含 10 ng DNA , 0.1 mmol·L-1
dNTP ,0.8 U Taq 酶 ,1.5 mmol·L-1 MgCl2 , 2 mg·mL-1牛血清白蛋白(Bovine serum albumin ,BSA)和 3
pmol引物。扩增程序为:94℃预变性 5 min ,94℃变性 1 min ,57℃退火 1 min(每个循环降低 0.5℃),72℃
延伸 1.5 min ,共 10个循环;94℃变性 1 min ,52℃退火1 min ,72℃延伸 1.5 min ,共 25个循环;72℃延伸 5
min[ 9] 。
3)采用的 ISSR引物序列由加拿大哥伦比亚大学(Universi ty of British Columbia ,Set No.9 ,No.801-
900)提供 ,并由上海生物工程公司合成 。
表 1　台湾水青冈 ISSR-PCR体系优化的因素和水平
水平 Mg2+/ mmol·L-1
dNTP/ mmol·L-1 模板 DNA/ng BSA/mg·mL -1 引物/pmo l Taq 酶/ U
1 1.50 0.025 4 0 1.2 0.4
2 1.75 0.050 6 1 1.8 0.6
3 2.00 0.075 10 2 3.0 0.8
4 2.25 0.125 16 3 4.8 1.0
2　结果与分析
2.1　Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
Mg2+浓度是影响 PCR结果的重要变量之一 ,它可以通过影响 Taq DNA 聚合酶的活性 ,从而影响
PCR扩增[ 10] 。从图 1(泳道 1 ～ 4)可以看出 , Mg2+浓度在 1.50 ～ 2.25 mmol·L-1之间变化时对 ISSR扩
增的结果没有明显的影响 。由于 1.5 mmol·L -1的 Mg2+浓度是 1×Taq酶配套缓冲液中所具有的 ,所以
从经济性和方便性考虑 ,在实验过程中无须再额外加入 Mg2+。
2.2　dNTP 浓度对 ISS R扩增的影响
底物 dNTP 浓度过高 ,会导致聚合酶错误掺入 ,浓度过低 ,又会影响合成效率 ,甚至会因 dNTP 过早消
耗而使产物单链化 ,影响扩增效果 ,所以 dN TP浓度的变化对 ISSR条带的数量和强弱影响较大 。一般取
dNTP 浓度在 0.02 ～ 0.2 mmol·L-1之间[ 11] 。由图 1(泳道 5 ～ 8)可知 ,当 dNTP 浓度为 0.025 mmol·L-1
·19·第 2 期 宋文静 , 等:台湾水青冈 ISSR-PCR体系的优化
时 ,谱带少且相对较弱 ,产物不稳定;当浓度逐渐上升时 ,谱带强度随之增强 。当浓度增加到 0.125 mmol·
L
-1时 ,谱带多而清晰 。因此本实验中采用的 dN TP 浓度以 0.125 mmol·L-1较为适宜。
2.3　模板 DNA用量对 ISSR扩增的影响
从图 1(泳道 9 ～ 12)可以看出 ,台湾水青冈的模板 DNA量对 PCR扩增产物的谱带数量影响不大 。但
当模板 DNA 的用量为 4 ng 和 6 ng 时 ,谱带强度较弱;当 DNA的用量为 10 ng 时 ,谱带强度较高;当 DNA
用量为 16 ng 时 ,谱带强度高但不是很清晰 。因此反应体系中模板 DNA的浓度取 10 ng 较为适宜 。
2.4　BSA 浓度对 ISSR扩增的影响
DNA中的多酚类化合物可与 Taq酶作用而明显地影响 PCR扩增 ,BSA可以通过其分子中富含赖氨
酸的阳离子与多酚化合物的阴离子相互作用消除内源的多酚类化合物 ,从而提高酶的活性 ,最终起到改善
PCR反应的作用 ,同时可以降低 ISSR扩增的背景[ 12] 。BSA 对台湾水青冈 ISSR扩增具有明显的影响(图
1泳道 13 ～ 16):不添加 BSA 时 ,谱带不能全部显示;当 BSA 质量浓度从 1 mg·mL-1增加到 3 mg·mL-1
时 ,谱带的强度逐渐增加 。在 2 mg·mL-1和 3 mg·mL-1时 ,谱带较多 ,但差异不大 。因此 ,本实验确定
BSA质量浓度为 2 mg·mL-1 。
2.5　引物用量对 ISS R扩增的影响
本实验共设置了 4个引物梯度 ,结果如图1(泳道 17 ～ 20)所示:引物用量为 1.2 pmol和 1.8 pmol时 ,
小片段的谱带缺失 ,且谱带的亮度较差;而当用量为3 pmol和 4.8 pmol时 ,谱带的数量一致 ,且谱带清晰 。
尤其当引物用量为 3 pmol时 ,谱带亮度最佳 ,是较为理想的浓度 。
2.6　Taq DNA聚合酶用量对 ISSR扩增的影响
Taq DNA 聚合酶的使用量也是影响实验的一个重要因素。 Taq 酶的用量过多不仅成本高 ,而且容
易产生非特异性扩增产物;用量过低则会导致产物的合成效率下降[ 9] 。一般随机扩增反应中 , Taq 酶的
用量在 0.5 ～ 5 U之间[ 13] 。本实验设置了0.4 U 、0.6 U 、0.8 U 和1.0 U 4个梯度 ,在 4个梯度下 ,扩增条
带的数量和清晰度都较好 ,没有明显差异(图 1泳道 21 ～ 24)。但是考虑到酶过少 ,会影响扩增的稳定性 ,
所以我们在实验时选中间值 0.6 U。
图 1　6 因素对台湾水青冈 ISSR-PCR扩增的影响(UBC807)
M:200 bp标准分子量参照物;1 ～ 4:Mg2+浓度分别为 1.50 mmol·L-1、1.75 mmol·L-1、2.00 mmol·
L-1 、2.25 mmol·L-1;5 ～ 8:dNTP 浓度分别为 0.025 mmol·L-1、0.050 mmol·L-1 、0.075 mmol·L-1 、
0.125 mmol·L-1;9～ 12:DNA 用量分别为 4 ng、6 ng、10 ng、16 ng;13 ～ 16:BSA 质量浓度分别为 0 mg·
mL-1、1 mg·mL -1、2 mg·mL -1、3 mg·mL -1;17～ 20:引物用量分别为 1.2 pmol、1.8 pmol、3.0 pmol、4.8
pmol;21 ～ 24:Taq 酶用量分别为 0.4 U 、0.6 U 、0.8 U、1.0 U 。
通过以上优化实验 ,建立了适合于台湾水青冈 ISS R-PCR的扩增体系 ,即 10 μL PCR反应体积中 ,含
10 ng 模板 DNA ,1.5 mmol·L-1 Mg2+ ,0.125 mmol·L-1 dNTP ,0.6 U Taq DNA聚合酶 , 2 mg·mL-1 BSA
和 3 pmol引物 。按此反应体系 ,经过重复性实验 ,从 100个 ISSR引物中共筛选出 12个扩增条带清晰 、重
复性好 、稳定性高的引物(表 2)用于台湾水青冈 22株个体的 ISSR-PCR扩增 。
·20· 福 建 林 业 科 技 第 36 卷
22株个体 , 12个引物扩增出的谱带数目从 10 ～ 19条不等 ,条带片段大小分布在 200 ～ 2 300 bp之间 ,
其中引物 UBC808的扩增结果见图 2。这说明优化的 ISSR-PCR体系完全适合于台湾水青冈的 ISSR分
析。
表 2　筛选的 12 个随机引物的序列
引物 序列 引物 序列 引物 序列
UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGT UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC UBC842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG
UBC808 AGAGAGAGAGAGAGAGC UBC823 TCTCTCTCTCTCTCTCC UBC864 ATGATGATGATGATGATG
UBC809 AGAGAGAGAGAGAGAGG UBC827 ACACACACACACACACG UBC866 CTCCTCCTCCTCCTCCTC
UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT UBC868 GAAGAAGAAGAAGAAGAA
图 2　UBC808 对台湾水青冈 22 株个体的 ISSR-PCR扩增结果
3　结论
PCR扩增容易受到 Taq DNA聚合酶用量 、DNA 模板用量与纯度 、Mg 2+与 dNTP 浓度 、引物用量等
诸多因子的影响 ,同时由于不同的物种在 ISSR-PCR扩增中所需要的引物不一样 ,所以需要优化 PCR反
应的各种条件 ,以期得到较好的实验结果。本实验通过对 Mg2+浓度 、4×dNTP 浓度 、模板 DNA 用量 、引
物用量 、BSA浓度 、Taq DNA 聚合酶用量等 6个因素进行筛选和优化 ,最终确立了台湾水青冈 ISSR-PCR
分析的最佳反应体系:10 μL 的 PCR反应体积 ,10 ng 模板DNA ,1.5 mmol·L-1 Mg2+ , 0.125 mmol·L -1 4
×dN TP ,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol·L-1 Tris-HCl , pH 值 9.0 ,50 mmol·L-1 KCl , 0.1%Triton X-
100),0.6 U Taq DNA聚合酶 ,2 mg·mL-1 BSA 和 3 pmol引物 。采取该反应体系 ,从 100个引物中筛选
出了 12个扩增效果好的引物 。用这 12个引物对清凉峰台湾水青冈 22株个体 DNA进行了 ISSR-PCR扩
增 ,获得较理想的实验结果 ,为进一步深入开展台湾水青冈保护遗传学和分子系统学研究奠定了实验基
础。
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