全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 2 期 2013 年 1 月

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水蛭 ISSR-PCR 反应体系的建立及优化
张香东 1，刘 庚 1，常素慧 1，白秀娟 1, 2，杨洪雁 2，朱洪强 1*
1. 吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118
2. 东北农业大学动物科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030
摘 要：目的 建立并优化水蛭 ISSR-PCR 反应体系及扩增程序，为水蛭进行遗传多样性研究提供依据。方法 使用引物
ISSR825，采用正交优化方法对影响 PCR 反应的 Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA 进行了体系优化，同时
对引物的最佳退火温度进行了选择。结果 在 25 μL 总体积中，其中包括 10×PCR 缓冲液 2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP
0.25 mmol/L、引物 0.8 μmol/L、Taq DNA 聚合酶 2.5 U、模板 DNA 2.0 ng/μL，最佳退火温度为 49.7 ℃。结论 所建立的最
佳 ISSR-PCR 反应体系稳定可靠，可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析。
关键词：水蛭；ISSR-PCR 体系；正交设计；体系优化；种质资源
中图分类号：R282.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)02 - 0215 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.02.020
Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system for Hirudo nipponica
ZHANG Xiang-dong1, LIU Geng1, CHANG Su-hui1, BAI Xiu-juan1, 2, YANG Hong-yan2, ZHU Hong-qiang1
1. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
2. College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: Objective To establish and optimize the ISSR-PCR reaction system and amplification procedure for Hirudo nipponica and
to provide the basis for its genetic diversity research. Methods Using Primer ISSR825, the orthogonal test design was adopted to
optimize the ISSR-PCR amplification system on H. nipponica in five factors (Mg2+, dNTP, primer, Taq DNA polymerase, and template
DNA) at four levels, and the suitable anneal temperature of the primer was selected. Results The suitable ISSR-PCR system (25 μL
reaction volume) in H. nipponica included 10 × PCR buffer (2.5 μL), Mg2+ (2.0 mmol/L), dNTP (0.25 mmol/L), primer (0.8 μmol/L),
Taq DNA polymerase (2.5 U), and template DNA (2.0 ng/μL); The suitable anneal temperature was 49.7 ℃. Conclusion The
established and optimized ISSR reaction system is stable and reliable, which could provide the basis for the analysis of genetic
diversity, germplasm resources, and genetic relationship of H. nipponica.
Key words: Hirudo nipponica Whitman; ISSR-PCR system; orthogonal design; system optimization; germplasm resources

水蛭是一味传统中药，具有破血、逐瘀、通经
之功效。《中国药典》2010 年版记载为医蛭科动物
水蛭 Hirudo nipponica Whitman、黄蛭科动物蚂蟥
Whitmania pigra Whitman 或柳叶蚂蟥 W. acranulate
Whitman 的干燥全体。水蛭中除了含有熟知的水蛭
素以外，还有多种生物活性成分，包括蛋白酶、蛋
白酶抑制剂、血小板聚集抑制剂、血小板黏附抑制
剂等，在临床中广泛用于脑血栓、冠心病、脑水肿
等的治疗[1]。据报道水蛭还有改善微循环、改善脑
部缺氧、抗纤维化[2]及抑制肿瘤细胞[3]等作用。随
着水蛭及其相关产品的开发，其需求量快速增长，
水蛭已成为世界性的畅销中药材之一。水蛭种质资
源丰富，分布较广，各品种之间的药用效果差异显
著[4]，且水蛭种质资源的内在质量缺乏系统的分析
和评价。因此，有必要从分子水平上对其进行研究，
从而找到药效较好的中药材资源，为水蛭种质资源
的合理开发和利用提供技术指导。
简单序列重复区间扩增多态性分子标记
（intersimple sequence repeat，ISSR）是建立在 PCR 反
应基础上的一种新的所用模板量少的扩增技术，其
产物的多态性比随机扩增多态DNA（random amplified
polymorphic DNA，RAPD）丰富，而且比RAPD 技术
更为稳定可靠[5]。目前已广泛应用于种质鉴定[6-7]、多
样性分析[8-10]及遗传图谱[11-12]等方面的研究。

收稿日期：2012-07-31
作者简介：张香东（1986—），男，在读硕士，主要研究方向为生药学。E-mail: ZXD254835231@163.com
*通信作者 朱洪强 E-mail: zhq5858588@163.com
网络出版时间：2012-12-18 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20121218.1013.002.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 2 期 2013 年 1 月

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ISSR-PCR 具有重复性高的优点，但如果在不
同的实验条件下，甚至在相同实验条件下其反应体
系不同，也可能产生不同的结果。为了确保 ISSR
分析结果的可靠性和可重复性，有必要对 ISSR-PCR
反应体系进行优化。本研究以水蛭为模板，采用正
交试验设计的方法[13]，对 ISSR 反应体系进行优化，
并对 PCR 反应程序中的退火温度进行选择，以期获
得适合水蛭的最优的 ISSR 反应体系，并用 10 份水
蛭材料对优化后的体系进行验证，为水蛭遗传多样
性的研究提供技术支持。
1 材料
水蛭药材购于哈尔滨中药材大市场，批号为
110901，来源为黑龙江省鹤岗，共分成 10 份。经东
北农业大学白秀娟教授鉴定为水蛭 Hirudo nipponica
Whitman 的干燥体。−20 ℃冰箱保存，用于基因组
的提取及 ISSR-PCR 实验研究。dNTP 购自哈尔滨海
基生物科技有限公司，Taq DNA 聚合酶、Mg2+购自
北京全式金生物科技有限公司。实验所使用的引物
根据哥伦比亚大学发布的 ISSR 引物序列，由北京
华大基因合成，通过预试验，筛选出引物 ISSR825
作 为 此 次 实 验 的 固 定 引 物 ， 引 物 序 列 为
ACACACACACACACACT。
2 方法
2.1 总 DNA 的提取及检测
按照常规酚/氯仿抽提法进行 DNA 提取，使用
紫外分光光度计，测定 DNA 浓度。根据记录的
A260/A280 比值，估测 DNA 质量，一般 A260/A280 在
1.6～1.8，可以满足试验要求。根据记录的 A260 数
值及稀释倍数，换算出待测 DNA 的浓度，并做相
应的稀释，以 50 ng/μL 分装，作为工作液 4 ℃保存
使用，DNA 原液于−20 ℃保存。
2.2 ISSR-PCR 正交试验设计
针对影响 ISSR-PCR 的 5 个主要因素（Mg2+、
dNTP、引物、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA）在 4
个水平上进行正交设计，采用 L16(45) 正交表进行
试验，设计方案见表 1，反应体系中除表中的因素
外，还有 10×缓冲液（Mg2+）2.5 μL，加双蒸水至
25 μL。共 16 组，每组 2 次重复，共 32 管。
表 1 ISSP-PCR 反应体系的正交试验设计
Table 1 Orthogonal test design of ISSR-PCR reaction system
编号 Mg2+ / (mmol·L−1) dNTPs / (mmol·L−1) 引物 / (μmol·L−1) Taq DNA 酶 / U 模板 DNA / (ng·μL−1)
1 2.0 0.10 0.2 1.0 0.8
2 2.0 0.15 0.4 1.5 1.2
3 2.0 0.20 0.6 2.0 1.6
4 2.0 0.25 0.8 2.5 2.0
5 2.6 0.10 0.4 2.0 2.0
6 2.6 0.15 0.2 2.5 1.6
7 2.6 0.20 0.8 1.0 1.2
8 2.6 0.25 0.6 1.5 0.8
9 3.2 0.10 0.6 2.5 1.2
10 3.2 0.15 0.8 2.0 0.8
11 3.2 0.20 0.2 1.5 2.0
12 3.2 0.25 0.4 1.0 1.6
13 4.0 0.10 0.8 1.0 1.6
14 4.0 0.15 0.6 1.5 2.0
15 4.0 0.20 0.4 2.5 0.8
16 4.0 0.25 0.2 2.0 1.2
2.3 ISSR-PCR 扩增
用引物 ISSR825 在 PCR 仪上进行扩增，反应
体系为 25 μL。扩增程序为 94 ℃预变性 5 min；94
℃变性 30 s，51 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 1.5 min，
循环 38 次；72 ℃延伸 8 min，4 ℃保存。用 2.0%
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2.4 退火温度的确定
根据正交试验结果，选择合适的反应体系，设
定温度梯度，通过对比，选出最适退火温度。
2.5 ISSR-PCR 优化所得体系稳定性的验证
用 10 份水蛭的基因组 DNA 对所建立的反应体
系可靠性和稳定性进行检测，反应程序同 ISSR-PCR
扩增反应程序。
3 结果分析
3.1 水蛭基因组 DNA 的提取与检测
水蛭组织的 DNA 用紫外分光光度计测定浓度，
A260/A280值为 1.6～1.8，用琼脂糖凝胶电泳可清晰显现
基因组 DNA 条带（图 1），DNA 可用于后续实验。
3.2 PCR 正交试验设计的直观分析
正交试验在 16 个处理组合中，由于 Mg2+浓度、
dNTP、引物、Taq DNA 聚合酶、DNA 模板 5 种影响
因素组合的不同，扩增效果存在着明显差异（图 2）。
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1～10 为 10 份样品 M-Marker
1－10-Ten samples of H. nipponica M-Marker
图 1 水蛭总 DNA 1%琼脂糖凝胶电泳分析
Fig. 1 1% Agarose gel electrophoresis analysis
of total DNA from H. nipponica

1～16 为处理号 M-Marker
1—16-treatment number M-Marker
图 2 ISSR-PCR 正交试验设计电泳结果
Fig. 2 Electrophoresis results of ISSR-PCR orthogonal test design
体系 11 无条带，体系 1、5、6、9、12、15 虽然有
条带，但扩增效果差，条带弱且多态性低。综合比
较，体系 2、3、4、10、13 的条带特异性好，其中
体系 4 条带多特异性最好。因此确定水蛭 ISSR-PCR
反应的最佳体系为：反应总体系 25 μL 其中包括
10×PCR 缓冲液 2.5 μL，Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTP
0.25 mmol/L，引物 0.8 μmol/L，Taq DNA 聚合酶 2.5
U，模板 DNA 2.0 ng/μL，加双蒸水补足 25 μL。
3.3 体系中不同因素对 ISSR-PCR 的影响
为了建立水蛭 ISSR-PCR 最优体系，对影响
ISSR-PCR 扩增的因素模板 DNA、Taq DNA 聚合
酶、Mg2+浓度、引物浓度、dNTP 的浓度设置了不
同处理。结果表明，模板 DNA 对 ISSR-PCR 扩增
的结果无显著影响；Taq DNA 聚合酶在一定范围内
随着酶量的增加扩增条带的清晰度亦增加，当酶量
在 2.5 U 时，条带最清晰；Mg2+是影响 ISSR-PCR
反应的主要因素，在试验中设置的 Mg2+浓度梯度均
能扩增出条带，但随着 Mg2+浓度的升高，扩增条带
特异性越来越差，且清晰度不高。在 2.0 mmol/L 处
扩增的条带最清晰，多态性最好，选为最适浓度；
引物浓度对扩增的影响也较大，引物浓度较在 0.2
μmol/L 时，条带较少或者模糊不清，随着引物浓度
的升高，扩增条带的清晰度和多态性都增强，当引
物浓度在 0.8 μmol/L 时最好。dNTP 的浓度决定着
ISSR-PCR 反应的成败，dNTP 与 Mg2+、Taq DNA
聚合酶相互影响，无论哪个因素的浓度过高或过低，
都影响扩增条带的有无，当三者浓度的比例在一定的
范围时即可扩增出清晰、多态性好的条带，综合各因
素的相互作用得出适宜的 dNTP 浓度为 0.25 mmol/L。
3.4 退火温度的确定
用以上所得最佳体系进行 48～54 ℃退火温度
梯度实验。电泳结果表明（图 3），在温度较低时，
扩增条带虽清晰，但多态性不好，随着退火温度的
升高，扩增条带的清晰度和多态性增强，若超过一
定的退火温度，有的引物的多态性减弱。由此确定，
该实验所用引物 ISSR825 的退火温度为 49.7 ℃。

1～10 对应温度为 48.3、48.6、49.1、49.7、50.5、51.2、51.9、52.6、
53.2、53.6 ℃ M-Marker
The annealing temperature of 1—10 is 48.3, 48.6, 49.1, 49.7, 50.5,
51.2, 51.9, 52.6, 53.2, and 53.6 ℃ M-Marker
图 3 退火温度对 ISSR 反应的影响
Fig. 3 Effect of annealing temperature on ISSR-PCR reaction
3.5 优化体系的验证
采用最优PCR反应体系，用10份水蛭进行PCR
扩增以检测体系的稳定性，产物用 2%琼脂糖凝胶
电泳检测。结果如图 4，从图中的验证结果来看，
不同模板 DNA 均能获得清晰明亮、重复性好、多
态性高的电泳条带，说明经优化的 ISSR-PCR 反应
体系稳定性好，可用于后续实验。
4 讨论
ISSR 技术是一种具有较多优点的分子标记技
术，适用于各类生物资源和遗传多样性的分子研究，
但其扩增反应易受反应体系内各因子浓度和反应程
序的影响。且对于不同的物种，其实验参数均有差
异，没有一种普遍适宜的反应条件。因此，为了使
ISSR 研究获得科学、稳定、准确、可重复的结果，
为种质资源和遗传多样性研究提供可靠的实验数据，

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
2 000 bp
1 000 bp
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500 bp
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
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1～10-10 份水蛭样品 M-Marker
1—10-ten samples of H. nipponica M-Marker
图 4 用最优体系对 10 份水蛭个体扩增的结果
Fig. 4 Amplication of ten samples of H. nipponica
with optimized ISSR-PCR reaction system
在进行某物种 ISSR 分子标记研究的前期，筛选出
适合该物种的 ISSR 引物，根据各引物选取适合的
退火温度，确立和优化适应该物种的 ISSR-PCR 体
系是非常必要的工作。
反应体系中 Mg2+浓度十分重要，浓度过高，反
应特异性降低，易出现非特异性扩增，浓度过低则
会降低Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少[14]；
dNTP是 PCR反应的原料，参与新链 DNA的合成，
其浓度大小与 ISSR 扩增条带数量及强弱密切相
关[15]，浓度过低会降低 PCR 产物的产量，同时，
dNTP 能与 Mg2+结合，浓度过高将使游离的 Mg2+
浓度降低[16]；Taq DNA 酶的活性与用量直接关系到
PCR 扩增反应的成败，是 PCR 反应中最重要的因
子。Taq DNA 酶浓度过低扩增速率低，条带少且弱；
酶浓度过高则会产生非特异性条带，而且增加了成
本[17]；引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，
且会在引物之间形成引物二聚体，当引物浓度偏低
时，会导致条带数目稀少、模糊[18]；ISSR 反应对模
板浓度不太敏感[19]；就反应程序而言，变性、退火
和延伸的时间及温度对反应结果都有一定的影响。
本研究综合考虑各因素之间的互相作用，采用
5 因素 4 水平的正交试验的方法确定了水蛭
ISSR-PCR 反应的最佳体系：10×PCR 缓冲液 2.5
μL，Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，引物 0.8
μmol/L，Taq DNA 聚合酶 2.5 U，模板 DNA 2.0 ng/μL，
加双蒸水补足 25 μL，最佳退火温度为 49.7 ℃。同时
用 10 份水蛭个体对最佳体系进行了稳定性验证。此
最佳体系的获得为利用 ISSR 标记技术开展水蛭遗传
多样性分析和构建遗传图谱提供一定的依据。
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