全 文 ：农业生物技术学报 !#$%&’()(*+$,-#’.#$&’(/,.0-1%’+2((((34456789(((:8;<((((3==>8489
?基金项目!国家自然科学基金资助项目:@A844B44BB和 @A843B47C7;资助
陈丙春!女#7=B= 年生$硕士研究生% DEF&,’<9G-H-4C4IJ73IA-FKA
??通讯作者 L#.1$9)$9-$$0MN%O0%-0A(DEF&,’<(G1&%2#P10%J-&#A0O#A-%KA
收稿日期!344CE4CE4I((((接受日期! 344CE45E4=
&研究论文&
根癌农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化 ?
!# $%& ’ ( )*+ ??
:中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室$北京 7444=C;
,-. 报道了根癌农杆菌:L+$H&-.0$,#F .#F,)&-,0%M’介导的蓝猪耳:Q$0%,& )#$%,0$, ;遗传转化的方法%筛选蓝猪耳转化芽
的最适卡那霉素:R&%;浓度为 C44(F+ST(以稀释 74 倍的菌液浸染叶盘 74U34(F,%$固体共培养基:含 34(!F’ST 乙酰丁香酮;上
VW X共培养 BYZ(O 可获得转化芽诱导率 VBAV[((7I(1 光照$Z(1 黑暗是较理想的共培养光周期(茎段作为外植体$其转化芽诱
导率要高于叶盘的转化芽诱导率$而且其转化芽比叶盘的转化芽健壮(7S3(\]^7449F+ST9R&%^4A59F+ST9_LL 是比较理想的生根
培养基% 实验结果表明$根癌农杆菌介导的蓝猪耳转化获得了抗性再生植株$转化率为 3CA7[%
/01. 蓝猪耳(转化(根癌农杆菌
L+$H&-.0$,#F .#F,)&-,0%MEF0O,&.0O9Q$&%M)$F&.,%9)$9Q$0%,& )#$%,0$,
‘aD@9/,%+E‘1#%9999b_9c,E/9999QL@d9c#9999aL@9c#Ee10%??
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99 Q109 L+$H&-.0$,#F .#F,)&-,0%MEF0O,&.0O9 .$&%M)$F&.,%9 )9 Q$0%,& )#$%,0$, j&M9 ,%h0M.,+&.0OA9 Q109 N.,F&’9
klmnopqrstuvw xy z{|}~
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ØÙÚÛÜÝÞßàáâ ãäå æçèé êëìíî ïðñò óôõö÷ø ùú ûüýþÿ!#$%&’( )*+,-./012 3456 789:;<= >? @ABCD EFG HIJV4(~ÞÇK(ì#ÿìL#ÇÌæ(þ#æÌÞhèÌ(þÇ(
̪(\]( ìþæÞ(~Þ#~(þÇÌèÞÇÞÇ(V4!!~þæS§(èÌþìýÞÇþÇ( Ïþý(B( Ìþ(Z(( èÌ( VW(M 6( èÇ( ̪( ÞÇ#ÌÞþÇ( ýèÌÞþ(þÏ( ýÇýèÌ( ÿ#ì(èì(
NOPQRS TU V WXYZ[\] ^ _‘ab cde fgh ijklm nopqrstuvwxy z{| }~
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º»¼½¾¿ÀÁÂÃÄ ÅÆÇÈ ÉÊË ÌÍÎÏÐ ÑÒÓÔ ÕÖ×ØÙÚÛÜ ÝÞßà áâãä åæçè éêë ìíîï ðñòóôõ ö÷ø ùúûüý þÿ!#$ %&’ ()*+ ,-./01234567 89: ;<=> ?@ ABCDE
FGHIJK LMNOPQRSTU VWX YZ[\ ]^_‘ abc def ghij klmnopqrst uvwxyz{|}~
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±² ³´µ¶·¸¹º»¼½¾¿À ÁÂà ÄÅÆÇ ÈÉ
(©þýÇÞè Ïþ#ýÇÞýÞS(ÌýèÇìÏþý~èÌÞþÇS(ûýþÿèÌýÞ#~ Ì#~ÞÏèÞÇì
蓝猪耳为玄参科蓝猪耳属植物$原产于热带和
亚热带$是一种观赏花卉% 在其发育的四核期$胚囊
从珠孔端伸出$当胚囊完全成熟时$助细胞)卵细胞
和大部分中央细胞均暴露于胚珠组织之外$ 是研究
被子植物胚囊发育和受精的模式植物% 应用蓝猪耳
为材料 $ 已研究了植物双受精的动态过程 :aÞE
ÊËÌÍÎÏÐÑÒ ÓÔ ÕÖ×Ø ÙÚÛÜÝ6(花粉管的生长 :aÞèìªÞè~è(
Þß àáâãäåæçè$花粉管内容物的释放 :aÞèìªÞè~è(Ì èæA
éêëìíî $中央细胞和卵器间的共质体通讯 :aèÇ(Ì èæA6(
ïðñòó$卵器肌动蛋白的组装 :ô#(Ì èæA6(V444;等$随着
分子生物学的进步$ 应用植物基因工程技术已经成
为植物发育生物学研究的重要手段% 但蓝猪耳的遗
传转化的研究非常有限$目前只有 ûÞè(实验室对蓝
猪耳遗传转化方法研究的报道 :ûÞè(èÇ(]ªÞÿèÌè6(
õö÷øù $ 他们仅对生芽培养基和转化菌株对转化效
率的影响作了研究!并没有报道详细的生根实验方
法及相关因子对转化的影响% 我们对根癌农杆菌介
导的蓝猪耳遗传转化方法进行了系统探索$ 获得了
较为完善的蓝猪耳遗传转化方法并摸索出转基因植
株的再生条件!为应用遗传工程手段研究蓝猪耳胚
农 业 生 物 技 术 学 报 !#$$年
囊发育和受精过程分子机制奠定基础!
!$$$$材料和方法
!!####!#$
取温室生长的蓝猪耳%&’()*+, -’.(*+)(+$/叶片或
嫩茎用 01乙醇消毒 2$3再用 4#5次氯酸钠消
毒 #$6+*! 叶片去除叶脉用打孔器打成叶盘#嫩茎
切成 7896 左右的小段纵向剖开作为组织培养和
遗传转化的起始材料!
!$####%&’()*
根癌农杆菌 %:;(’<,9=)(+.6 =.6)-,9+)*3/ 菌株
>?@ABCDE由中国农业大学于静娟副教授提供!供试
质粒为 F?G7!7该质粒携有 HIJ 基因其启动子为
KLM启动子筛选标记基因为 NO&!由香港大学黄
毓文老师提供!
!%####+,-./012’3456078
接种含有植物表达载体的根癌农杆菌于 K$6>$
PQR 培养基中 %含 7CC$;S6>$T,*,6U9+* %V,*/和
WXY ;S6>$3=()F=’6U9+*/XZ$[振荡培养过夜吸取 7$
6> 菌液转入新鲜的 PQR 培养基%含 7$6’\S> 的
乙酰丁香酮E$不含抗生素/ 扩大培养至 ]^_CC为 C4Z
‘ abc defgh 室温离心 Wc86+h 用 PQR 重新悬浮菌
体 使用时采用 PQR 溶液分别稀释至原体积的 W$
i$Y$Wc$ic$2c8和 Yc倍用于侵染!
按 W4W 所述方法消毒后 叶盘于根癌农杆菌菌
液中分别浸泡 W$i$2$Y$Wc$ic和 2c86+h! 滤纸吸干
后 将外植体铺在共培养培养基 %jM8k8G::8c4W8
lmnopqrst uvw xyz{ | 乙酰丁香桐 W8f’\S{/上
分别暗培养 i}W! 后 将外植体转入诱导生芽的
选择培养基 %jJ|qrRt8Wv8lmS>8|V,*|9,d<)*g9g\g*8
~ V,h 的浓度为 7
L$fmS{ 以 7$
为浓度梯度#上选择培养! 本实验还进行了乙
酰丁香酮浓度共培养温度光周期外植体液体$
固体共培养对转化芽诱导率的影响的实验 具体方
法见结果与分析!
!&####79:456;+<=
将转化芽分别转入生根培养基中于 Xq$W_$
光照%W!$x’\x!3光强/Z$暗进行培养!
!’####79:!&0 ()*>?
上游引物设计在 KwM 启动子区内 序列为
¡¢£¤¥¦§¨ 下游引
物设计在 ¢IM 基因内 E8序列为 w¤¢¤¢¤¥¢t¥
©ª«¬®¯°±²³´µ¶·¸¹!扩增条件为%ºB8»预变性
8+*ºB8¼变性 ¸C83_D8½退火 W8lgh0!8¾786+*
扩增 Kc个循环循环结束后再延伸 7c86+*!
$8888结果和分析
$!####456@A78
$!!8888卡那霉素筛选浓度 实验结果表明 Bcc8
¿ÀÁÂ 的 V,h 是叶盘的最佳筛选浓度在此浓度下
叶盘外植体的致死率几乎达到 WCC1 与含 YCC8
ÃÄÅÆ ÇÈÉ 的培养基的致死率相当因此确认其为最
佳筛选浓度!
$!$8888浸染时间$菌液浓度和共培养时间对转化芽
诱导率的影响 实验结果表明%在 WÊXc86gh 内转
化芽诱导率随时间的延长而升高在 Xc˸c8+É 转
化芽诱导率随时间的延长而下降以 7cÌXc8fgh 的
浸染时间为最佳转化芽诱导率为 7¸v01! 稀释 7c
倍的菌液浓度浸染效果最理想 转化芽诱导率为
ÍÎÏÐÑ!共培养 0ÒZ8Ó的效果比较理想转化芽诱导
率为 ÍÎv05%图表略/!
$!%8888乙酰丁香酮浓度对转化芽诱导率的影响
实验中发现在根癌农杆菌菌液中加入乙酰丁香酮
$终浓度为 ÍCC!f’\Å{/ 共培养培养基不加乙酰丁
香酮转化芽诱导率为 ÍivÍ5 而在根癌农杆菌菌液
和共培养培养基中都不加乙酰丁香酮 转化芽诱导
率仅为 Ðv0_5 说明根癌农杆菌经乙酰丁香酮的活
化预处理其毒性基因得到高效表达!在共培养培养
基中加入乙酰丁香酮发现 iC8f’\Å{ 的效果最好
转化芽诱导率可达 i0vi5%图 Í/!
图 Ív乙酰丁香酮对转化芽诱导率的影响
Ô+mvÍv8Q--)9=38’-8È9)=’3U(+hm’h8’h8+hÓ.9)Ó88()m)h)(È=)Ó8<.Ó3
$!&####共培养温度对转化芽诱导率的影响 由图
Õ可知!¸8Ö和 iZ8×共培养的效果以 iK8Ø为最佳
ÙÚ Û次之Wq8Ü最差! 转化时让根癌农杆菌处于缓
慢生长状态比其处于快速生长状态更有利于提高转
化芽诱导率!
$!’####共培养光周期对转化芽诱导率的影响 叶
盘浸染后 将其放入不同的光照下共培养% ~B8 全
Kbb
第 !期 陈丙春等#根癌农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化
! ! #$%&’()*+,-./01
$%&’()*++(,-./+,/,0’-12%-1/345/-/4(61/7.8/31370,-1/36%-1//+6(9(3(6%-(7&07.
光照!:;5 全黑暗!<=5 光照><:?!!@/’A@:A. 光强B!C8
5 黑暗 由表 < 可见!<=85 光照 ><:?!!@/’A@:A. 光
强B!C85 黑暗效果最理想!:;85 全黑暗培养的效果优
于 :;85全光照 说明植物处于其适宜的光周期下有
利于提高转化芽诱导率
图 :D共培养温度对转化芽诱导率的影响
E19D:D8*++(,-.8/+8,/,0’-12%-1/38-(@4(6%-06(8/381370,(78
6(9(3(6%-(78&07.88
#$!$%888!不同外植体对转化芽诱导率的影响 用不
同外植体进行的实验的结果表明#茎段的转化芽诱
导率要高于叶盘!而且其转化芽出现比叶盘转化芽
早 !F;87!比叶片的转化芽健壮G表 :$图 !B
#$!$&8888液体% 固体共培养对转化芽诱导率的影响
转化过的叶盘外植体分别接入 HI 液体共培养基%
JK 固体共培养基!分别共培养 ;%L%=%M 和 C87 由
图 ;可以看出#固体共培养的效果优于液体共培养!
在 ;NCO7 内液体共培养的转化芽诱导率随时间的
延长而下降! 而固体共培养的转化芽诱导率随时间
的延长而上升
! #23456()*+,7.801
$%&’(8:88*++(,-.8/+871++(6(3-8(P4’%3-.8/381370,-1/386%-1/8/+8
6(9(3(6%-(78&07.
#’#)9:;<=>?@A
在转化芽的生根过程中!Q%3对
生根有强烈的抑制作用! 转化芽在
含有 不能生根 当 JK盐浓度降低到
VWXYZ 和
光周期 叶盘数 诱导出转化芽数 转化芽诱导率 W[
88888888888\5/-/4(61/7.88888888888888888888888888]/D8/+88888888888888]/D8/+81370,(78888888888888888888^370,-1/3O6%-1/O/+O
OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO’(%+O71.,.OOOOOOOOOO6(9(3(6%-(7O&07.OOOOOOOOOOOOOOOOOO6(9(3(6%-(7O&07.
全黑暗 L
<=O5 光照 W<:?O!@/’&@!:&.!
全光照 W<:?O!@/’&@!:&.!
外植体 外植体数 诱导转化芽数 转化芽诱导率 Wc
8*P4’%3-.8888888888888888]/D8/+88888888888888]/D8/+81370,(7888888^370,-1/386%-1/8/+
88888888888888888888888888888(P4’%3-.8888888888886(9(3(6%-(78&07.888888886(9(3(6%-(78&07.88
叶盘 LL8888888888888888888888888888C8888888888888888888888888888888V;DL88
R(%+871.,.88
茎段 L!88888888888888888888888888V?88888888888888888888888888888888VCDa
Z-(@.88888888888888888888888
图 !D8不同外植体转化芽的再生情况’浸染 ! 周后(
E19D8!D8d(9(3(6%-(78&07.8+6/@871++(6(3-8(P4’%3-.8%+-(6813+(,-(78!8e((‘.8
fD8由茎段再生出的转化芽$ gD8由叶盘再生出的转化芽
fD8d(9(3(6%-(78&07.8+6/@8.-(@8.(,-1/3.h88gD8d(9(3(6%-(78&07.8+6/@8’(%+871.,.D
!?<
农 业 生 物 技 术 学 报 !#$$年
长势却较差!多在发根成苗后 %周左右枯萎死亡我
们还比较了 &’’ 和 (’’ 对生根的影响!发现 (’’
发根的数目虽然极多! 但根的长势却较为细弱!而
)*+ 的生根条数虽不如 ! 多! 但所发出的根却
比较健壮!而且 ,#$-./0的 )**较 1,$-./0 的 )++
生根的效果好 #图 #2 通过比较选择了 1/!3451$
6789 :;< =>?@ ABCD EFG 的生根培养基用于转基因
蓝猪耳的生根培养
图 H?$共培养基和共培养时间对转化芽诱导率的影响
IJB?$H?$KLLMNOPQRL$NRNSTOJU;OJR<$AMVJSA$;
IJ7,$@,$KLLMNOP$RL$YJ
F#Fs?Q培养基为 18!Q34=(**Q1QAf89=:khQ1>>QAf89tQu#uv?$培养基为
wxy z{|}~
#v?培养基为 yQ34
)**Q>,#Q
¡
~n~v?¢Zggn_S_r yz4
(++
unuv?
£¤¥ ¦§¨©ª« ¬ ®¯°±²³´µ¶ · ¸¹º»¼½¾¿ ÀÁ ÃÄÅÆÇ È ÉÊË ÌÍÎ ÏÐÑ
ÒÓÔÕÖ× ØÙ ÚÛÜÝÞßàáâ ãäå æçèéêëìíîïð ñòóôõ
!#$$$$!#$%& %&’’()*
取 õ@ ò 转化植株叶片按 ϵu 法提取总
ö÷ø!以总 ö(ø 为模板进行 ùú 扩增!扩增产物
作 îäyû琼脂糖凝胶电泳分析 以 ö(ø±¾WYgW!为
分子量标准! 在 !ÂÂ和 üÂÂoý之间可见清晰的扩
增条带 #图 þ2! 该条带为所扩增的 îîH%Xý 目的条
带证明目的基因已经整合到蓝猪耳的基因组中经
ùú 检测!在 HH 株再生植株中!阳性植株为 %ü 株!
阳性植株的概率为 ÿÿäþHû因为转化芽诱导率最高
为 y!äyû!所以转化效率最高为 yHäîû
图 þä部分再生植株的 ùÌú 检测结果
I©.äþäùÌú¾¾Tr©r\cdg.ggd¾^gËýT¾^r
î#H#þÎ转化植株$#!非转化植株$!!野生型植株$ÿ!质粒 ýuEîyî$
Ý!ö(’分子量标准
î#H¾ËþÎ.g\©Nö(’cd\^d¾rc\dgËýT¾^r¾r^gýT¾^grÇ#Î
.g\©Nö(’cd\\$^d¾rc\dgËýT¾^r¾r^gýT¾^grÇ!Î.g\©N
ö(’cd\%©TË$^ýgý¾T^¾r^gýT¾^grÇÿÎýT¾r©ËýuEîyî¾r^gýT¾^grÇ
ÝÎö(’¾dYgdä
!讨论
从影响蓝猪耳的遗传转化的一般因素来看!以
稀释 îð 倍的菌液浓度浸染 îð&yð© 效果最佳$
’( )共培养条件下根癌农杆菌具有最高的浸染活
性! 产生最高的转化率! 这与前人研究结果一致
*+,-./0 12 3456 789:;!进一步印证了%根癌农杆菌具有
最强浸染力的生长温度并不是其最适生长温度!而
是在较缓慢生长温度条件&的观点这也与其它双子
叶植物一致!不同的是!蓝猪耳的共培养的时间比较
长!而且很关键!共培养 !<ÿË 的效果比较理想!时
间短!转化芽诱导率极低!这可能与根癌农杆菌吸收
有关!时间短!不利于根癌农杆菌完全吸收
植物受伤细胞分泌的某些酚类化合物对根癌农
杆菌 =©d 基因的表达有诱导作用 目前广泛使用乙
酰丁香酮来活化农杆菌的 =©d 区! 并在转化中取得
好的转化效果 *>©g©g^ ¾TäÎîüüH$ U¾ú\\gYgT g^ ¾TäÎ
?@ABC 本研究发现仅在根癌农杆菌菌液中加入乙
酰丁香酮! 其转化芽诱导率比不加乙酰丁香酮的转
化芽诱导率提高了 îäî 倍$ 同时根癌农杆菌菌液和
共培养培养基中加入乙酰丁香酮!效果更显著!发现
%ðy
第 !期 陈丙春等#根癌农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化
共培养培养基中加入 $%!&’()* 的乙酰丁香酮的效
果最好! 比不加乙酰丁香酮的转化芽诱导率提高了
!+,-倍 说明在蓝猪耳的遗传转化中乙酰丁香酮可
以诱导根癌农杆菌!使其毒性基因得到高效表达
在根癌农杆菌介导的转化中! 一般认为黑暗共
培养有利于转化!但近期 ./&012 等3-44!5报道光有
利于提高拟南芥农杆菌的转化效率! 认为在根癌农
杆菌介导的转化中! 适宜植物生长发育的光周期促
进 6789: 由根癌农杆菌向植物细胞的转移! 不适
宜其生长发育的光周期抑制 6789: 由根癌农杆菌
向植物细胞的转移 在本研究中发现!;<=>光照!?=>
黑暗的转化芽诱导率要明显高于 -@=> 全黑暗培养
的转化芽诱导率! 而后者的转化芽诱导率高于 -@=>
全光照的转化芽诱导率 这验证了 ./&012的观点!
说明在蓝猪耳的遗传转化过程中! 适宜其生长发育
的光周期促进其转化在根癌农杆菌介导的转化中!
叶盘法是最常用的方法! 在本实验中我们尝试用茎
段作为转化的外植体! 其转化芽的诱导率要高于叶
盘的!而且其转化芽出现早!表现的更加健壮!有利
于继代和生根培养 这可能是由于茎段和叶盘在转
化时处于不同的生理状态造成的 固体共培养是常
用的共培养方式!A/1B’C/ 和 DE2F/1E=G-44!H将液体
共培养应用于欧洲油菜的转化中! 并取得了较高的
转化效率!在蓝猪耳外植体转化中!发现固体共培养
的效果优于液体共培养!@I?=B 内液体共培养的转
化芽诱导率随时间的延长而下降! 而固体共培养的
转化芽诱导率随时间的延长而上升 说明液体共培
养并不适用蓝猪耳的遗传转化! 其原因可能是蓝猪
耳需要较长的共培养时间! 而长时间在液体共培养
基里浸泡的蓝猪耳叶盘!大部分的叶盘颜色发黄!处
于较差的生理状态!不利于转化!而在固体共培养上
的蓝猪耳叶盘处于较好的生理状态!利于转化
在 :JB/ 和 D>J0/E/=K;LLM5=的报道中没有生根培
养基的配方!我们对生根培养基进行了摸索 通过
比较实验选择生根培养基 ;N-OPDQ;44=&RN*=S/TQ4U
V WXYZ [\] 用于转基因蓝猪耳的生根培养!其转化
效率最高为 -@U;^!比 ]JB/ 报道的最高转化效率高
_‘abc 转化植株从浸染起 ?d;4 周可以开花!甚至
在培养瓶中即可完成其生活史 这个优良的转化
系统为应用基因工程手段研究被子植物双受精的细
胞与分子机制奠定基础
! # $
]JB/OeO/TBOD>J0/E/OPaO]X1’0/fE21JgWhW2BJ/E2BOE1/Tij’1W/EJ’TO
’jOE’12TJ/O K6’12TJ/ j’g1TJ21JOHUOk122BJTX DfJ2Tf2lO_LLMlO@M#O
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îü&&tÿJîíúJüÿ= 0¬úF¬¬ÿ= ú>¬= î¬ÿú1í= î¬= íÿ= ú>¬= ¬èè=
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