全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2015)06 － 2558 － 05 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2015． 06． 040
收稿日期:2013 － 11 － 20
基金项目:云南省重点建设学科，楚雄师范学院重点建设学科基
金项目(05YJJSXK03) ;云南省高校科技创新团队支持计划项目
(IＲTSTYN) ;云南省教育厅项目(2014Y443) ;楚雄师范学院院
基金项目(05-YJＲC04) ;楚雄师范学院基金项目(10YJYB02)
作者简介:李雪玲(1965 －) ，女，云南姚安人，副教授，主要研究
方向为植物病理学与微生物方向，E-mail:lxlyaoan@ cxtc． edu．
cn。
高山榕叶枯病病原菌分离鉴定和生物学特性的初步研究
李雪玲1，2，谢美华1，2，杨海艳1，2，陈华红1，2，闫俊梅1，王振吉1，2，范树国1，2
(1．楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄 675000;2．云南省高校应用生物学重点实验室，云南 楚雄 675000)
摘 要:从高山榕发生叶枯病的病叶上分离到一株真菌，菌株编号记为 CX0021D4。利用传统的形态学观察与现代分子生物学技
术相结合的方法，并依据其形态特点与培养性状进行了初步研究。结果表明，病原菌为丝孢纲(Hyphomycetes)瘤座孢目(Tubercu-
lariales)瘤座孢科(Tuberculariaceae)镰刀菌属(Fusarium Link)层生镰孢菌。该菌对营养要求不高，碳源和氮源均能利用，最佳碳
源和氮源分别为葡萄糖和牛肉膏。该菌对温度和 pH值的适应范围均较广，25 ～ 28 ℃菌丝生长速度最快，28 ～ 30 ℃之间孢子萌发
率最高;适宜孢子萌发的 pH值为 7． 0 ～ 8． 0，弱碱性更利于孢子萌发;有无光照对菌落生长没有明显地影响，光照有利于孢子萌发。
供试的 5 种广谱杀菌剂对该菌株的生长影响不同。敌克松和恶霜锰锌对该菌株的生长基本没有抑制作用。抑菌效果最好的是百
菌清，扑海因次之，再次是代森锰锌。
关键词:高山榕;叶枯病;病原鉴定;生物学特性
中图分类号:S432． 2 + 6 文献标识码:A
Pathogen Identification and Biological
Characterstics of Leaf Blight of Ficus altissima
LI Xue-ling1，2，XIE Mei-hua1，2，YANG Hai-yan1，2，CHEN Hua-hong1，2，YAN Jun-mei1，WANG Zhen-ji1，2，FAN Shu-guo1，2
(1． Department of Chemistry and Life Science，Chuxiong Normal University，Yunnan Chuxiong 675000，China;2． Yunnan Province Ap-
plied Biology Key Laboratory of University，Yunnan Chuxiong 675000，China)
Abstract:One fungal strains causing Leaf blight of Ficus altissima were separated and identified，which was noted for CX0021D4． The mor-
phological identification and ITS sequences systematical analysis of the Pathogen were used，and the cultivation characters of the fungi were
further studied． The results showed that the fungal belonged to the species of Fusarium proliferatum． Glucose and beef extract was the best
carbon and nitrogen source for the strain． 25 － 28 ℃ and 28 － 30 ℃ was the appropriate temperature for colony growth and spore germination
respectively． The optimum pH value for conidiophores germination was 7． 0 － 8． 0． Illumination was beneficial for conidiophores germination
of Fusarium strain． Photoperriod had little influence on mycelial growth． Chlorothalonil was the best fungicides in the test．
Key words:Ficus altissima;Leaf blight;Pathogen identification;Biological characterstics
高山榕(Ficus altissima Bl．) ，又名阔叶榕、大青
树、高榕、鸡榕等，是一种广泛栽培的绿化植物，适用
于作行道树、园景树和庭荫树［1］。在云南，高山榕
也几乎是被西双版纳各民族和大理白族共同崇拜的
“神树”，在西双版纳各民族的村社和大理白族的村
落里，都可以见到一些树干粗大、树冠宽广、枝叶茂
盛的高山榕。近年来，由于高山榕的广泛栽培，病害
发生严重，尤其是高山榕叶片黄化卷曲现象日趋普
遍，影响了树势生长及观赏价值。分离与鉴定病原
菌是开展高山榕抗病防治研究的基础。本试验从自
然感病的高山榕上分离纯化得到一株对高山榕具有
寄生作用的真菌，利用传统的形态学观察与现代分
子生物学技术相结合的方法，对高山榕叶枯病病原
菌进行了鉴定［2］，并依据其形态特点与培养性状进
行了初步研究，为高山榕叶片黄化枯萎病的防治奠
定基础，同时也为进一步了解该病害的发病规律提
供一定的理论依据。
8552
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2015 年 28 卷 6 期
Vol. 28 No. 6
1 材料与方法
1． 1 病样采集及病原真菌分离与致病性测定
高山榕叶枯病罹病样品采自云南省元谋县，从
病株黄化和枯萎叶片中分离得到 1 株真菌，菌株编
号为 CX0021D4。依据 KOCH 法则，将单孢菌株在
PDA平板 28 ℃ 培养 3 d，同时用注射接种法和菌液
浸叶接种法，将上述菌株接种于健康高山榕叶片上，
进行致病性鉴定。取接种后发病植株叶片病健交界
处组织，用体积分数为 75 %乙醇处理 10 s，0． 1 %
升汞表面消毒 3 min，无菌水冲洗 3 次后置于 PDA
平板上 28 ℃下培养 3 d。
1． 2 病原菌鉴定
1． 2． 1 形态学鉴定 将直径为 5 mm 病原菌菌丝
块接种在 PDA平板上，25 ℃培养，对病原菌在培养
基上的菌落形态、生长情况、颜色以及孢子形状、大
小、产孢结构等每天定时进行观察描述，然后依据镰
刀菌的分类系统对镰刀菌菌株进行鉴定［3 ～ 5］。
1． 2． 2 分子生物学鉴定 将供试菌株用 PDA 液体
培养基培养，过滤回收菌丝体，然后用 CTAB法［6］提
取病原菌全基因组 DNA，进行 ITS-PCＲ 扩增。引物
序列为 ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’;
ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’。获
得的 ITS 序列在 GenBank 数据库(http:/ / www． nc-
bi． nim． nih． gov /blast)中进行同源性比较，用 Bi-
oEdit、Clustal x和 MEGA 4． 1 软件采用 NJ法进行系
统分析。
1． 3 生物学特性研究
1． 3． 1 不同碳源对菌落生长的影响 以察氏培养
基为基础培养基，分别以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半
乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源。每种培养
基中分别接种直径为 5 mm 的菌块，25 ℃恒温黑暗
培养，5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。每个处
理设 3 个重复［5 ～ 6］。
1． 3． 2 不同氮源对菌落生长的影响 以察氏培养
基为基础培养基，分别以硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵、甘
氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源，每种培
养基中分别接种直径为 5 mm 的菌块，25 ℃恒温黑
暗培养，5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。每个
处理设 3 个重复。
1． 3． 3 不同环境条件对菌落生长和分子孢子萌发
的影响 ① 不同温度处理。取直径为 5 mm的菌块
接种于察氏培养基中央，分别在 5、10、15、20、25、
28、30、32、35、40、45 ℃下恒温黑暗培养，5 d 后测量
菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培
养条件同菌落培养，24 h 后镜检孢子萌发率，每次
检 100 个孢子。每个处理设 3 个重复。② 不同 pH
值处理。将察氏培养基 pH值分别调为 3． 0、4． 0、5．
0、6． 0、7． 0、8． 0、9． 0、10． 0、10． 9，于高压灭菌后，取
直径为 5 mm的菌块分别接种于以上不同 pH 培养
基的中央，25 ℃黑暗培养 5 d后测量菌落直径。用
0． 2 mol /L磷酸氢二钠和 0． 2 mol /L 柠檬酸缓冲液
将分生孢子悬浮液 pH值调配为 3． 0、4． 0、5． 0、6． 0、
7． 0、8． 0、9． 0、10． 0、10． 9，置于 25 ℃恒温箱黑暗培
养，24 h后镜检萌发率，每次检 100 个孢子。每个处
理设 3 个重复。
1． 3． 4 不同光照处理 取直径为 5 mm 的菌块接
种于察氏培养基中央，分别置于 24 h 光照、12 /12 h
光暗交替、24 h 黑暗环境中，25 ℃培养 5 d 后测量
菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培
养条件同菌落培养，24 h 后镜检孢子萌发率，每次
检 100 个孢子。每个处理设 3 个重复。
1． 4 不同杀菌剂对菌落生长的影响
将代森锰锌、百菌清、敌克松、恶霜锰锌和扑海
因用无菌水按其常用倍数稀释，每 10 mL 培养基中
加入 1 mL药液制成含药液的平板，对照组加入等量
无菌水。取 5 mm 菌块置于察氏培养基平板中央，
25 ℃黑暗培养 5 d后测量菌落直径。每个处理设 3
个重复。
2 结果与分析
2． 1 CX0021D4 菌株的鉴定
2． 1． 1 形态学鉴定 该病主要发生在叶部，发病时
叶脉两侧出现黄棕色或黑色斑点逐步危害到上部叶
片。行道树上的高山榕自然发病植株分离到的菌株
与接种后发病分离到的菌株培养性状一致。PDA
培养第 3 天菌落半径 1． 3 cm，淡紫色，规则，隆起，
不透明，棉絮状，中心颜色较深，有 0． 2 cm的匍匐菌
丝，背面中心黑褐色，有褶皱，中间紫褐色，外周浅黄
色。第 14 天长满全皿，17 d分泌淡蓝色子实体。后
期菌体厚，淡紫色，中心粉紫色，背面浅黄色，中心浅
紫红色，培养基变浅蓝色(图 1)。挑取 PDA 培养基
上淡蓝色小黑点压碎，在显微镜下观察，可看到有 2
种形态的孢子。大孢子镰形，多孢，无色，有 1 ～ 6 个
横隔，15 ～ 75 μm × 2． 5 ～ 3． 8 μm(平均 43． 1 μm ×
3． 7 μm)。小孢子椭圆形，卵形或短圆柱状，单孢或
双孢，无色，油滴有或无，3． 8 ～ 14 μm × 1． 9 ～ 5 μm
(平均 9 μm × 3 μm)。分生孢子器盘状，基部蓝黑
色，孢子梗扫帚状，分枝有节(图 2)。
95526 期 李雪玲等:高山榕叶枯病病原菌分离鉴定和生物学特性的初步研究
A:PDA培养基正面;B:PDA培养基背面
A． The front of PDA medium;B． The back of PDA medium
图 1 病原菌在 PDA培养基上的菌落形态
Fig． 1 Conial morpholoy of pathogen on the PDA medium
C:分生孢子 Conidia D:分生孢子器 Pycnidium
图 2 病原菌分生孢子及分生孢子器
Fig． 2 Conidia and pycnidium of pathogen
2． 1． 2 病原菌分子生物学鉴定 将 CX0021D菌株
的 5． 8SrDNA-ITS序列在 NCBI 里进行序列比对，结
果显示与 CX0021D同源性在 62 %的 6 个。下载它
们的序列，构建系统发育树，由图 3 可以看出，与其
遗传距离较近的为 Fusarium proliferatum，赵志慧记
载 Fusarium proliferatum小型分生孢子假头状着生，
卵型形、棒腿形，顶端略膨大，基部平截，通常为 0
隔，偶有 1 隔，5 ～ 17． 5 μm ×4 μm，大型分生孢子细
长，直，在孢子的两端略弯曲，呈舟形，3 ～ 5 隔，25 ～
52． 5 μm ×2． 5 ～ 4 μm［7］，供试菌株与其形态基本相
近。形态学结合分子生物分析，供试菌株 CX0021D
为层生镰孢菌 Fusarium proliferatum (Matsush．)Ni-
renberg ex Gerlash ＆ Nirenberg(Gibberlla为 Fusarium
的有性态)。
2． 2 不同氮源和不同碳源对 CX0021D4 菌丝生长
的影响
试验结果表明，不同供试氮源中，菌落生长得最
快的氮源是牛肉膏，与甘氨酸、L-苯丙氨酸作氮源的
图 3 图 3 基于 5． 8SrDNA-ITS碱基序列构建的系统树
Fig． 3 A phylogenetic tree based on 5． 8SrDNA-ITS sequence
0652 西 南 农 业 学 报 28 卷
表 1 不同 N源和 C源对菌丝生长的影响
Table 1 Effect of different carbon source and nitrogen source on mycelia growth
N源 Nitrogen source C源 Carbon source
菌落直径 (cm)
(Mean ± SD)
Colony diameter
显著水平
F0． 05
菌落直径 (cm)
(Mean ± SD)
Colony diameter
F0． 05
显著水平
F0． 05
significant level
硫酸铵 3． 65 ± 0． 44 ab 葡萄糖 4． 84 ± 0． 15 ab
硝酸铵 4． 14 ± 0． 39 ab D-果糖 3． 96 ± 0． 33 c
甘氨酸 3． 38 ± 0． 31 b 甘油 4． 45 ± 0． 29 abc
L-苯丙氨酸 3． 43 ± 0． 68 b D-半乳糖 4． 79 ± 0． 28 ab
牛肉膏 5． 01 ± 0． 23 a 乳糖 4． 3 ± 0． 22 bc
蛋白胨 4． 43 ± 0． 31 ab 可溶性淀粉 5． 06 ± 0． 52 ab
硝酸钠 4． 67 ± 0． 95 ab 蔗糖 5． 15 ± 0． 32 a
培养基生长速度达到显著差异，与其他供试氮源在
5 %差异水平达到极显著差异，依次是硝酸钠、蛋白
胨、硝酸铵、硫酸铵。该菌对供试的 7 种碳源均能利
用，菌落在不同碳源培养基上生长速度有明显差异，
各碳源中以蔗糖最好，其次是可溶性淀粉，最差为
D-果糖(表 1)。
2． 3 光照对 CX0021D4 菌落生长和孢子萌发的影
响
通过 24 h光照，12 h光 /暗交替、无光照培养分
别处理，结果表明(表 2) ，有无光照对菌落生长没有
明显影响，3 种不同的处理相比差异不显著。光照
培养能促进孢子萌发，黑暗培养孢子萌发率低。全
光照和 12 h交替光照处理相比孢子萌发率无显著
差异，但全光照和 12 h交替光照这 2 个处理与无光
照处理相比差异极显著，萌发率较低。
2． 4 温度对 CX0021D4 菌落生长和孢子萌发的影
响
试验结果表明，该病原菌适应的温度范围在 15
～ 35 ℃，在 10 ℃以下和 40 ℃以上，该病原菌菌丝
停止生长。菌落在温度为 25 ～ 28 ℃时生长较快，与
表 2 光照对菌落生长和孢子萌发的影响
Table 2 Effect of different light on colony and the spore germination
处理
Treatment
菌落直径 (cm) (Mean ± SD)
Colony diameter
F0． 05显著水平
F0． 05
significant level
分生孢子萌发率(%)
(Mean ± SD)
Conidial germination rate
F0． 05显著水平
F0． 05 significant level
光照 2． 64 ± 0． 09 a 12． 67 ± 2． 39 a
光 /暗 2． 50 ± 0． 44 a 11． 49 ± 0． 62 a
黑暗 2． 60 ± 0． 45 a 4． 44 ± 0． 63 b
表 3 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响
Table 3 Effect of temperature on mycelial growth growth and spore germination
温度(℃)
Temperature
菌落直径 (cm)
(Mean ± SD)
Colony diameter
F0． 05显著水平
F0． 05 significant level
分生孢子萌发率(%)
(Mean ± SD)
Conidial germination rate
F0． 05显著水平
F0． 05 significant level
5 0 e 5． 56 ± 0． 61 d
10 0 e 10． 59 ± 1． 01 c
15 0． 97 ± 0． 21 d 12． 17 ± 1． 54 abc
20 3． 40 ± 0． 21 b 14． 47 ± 0． 60 ab
25 4． 69 ± 0． 33 a 12． 82 ± 2． 60 abc
28 4． 54 ± 0． 66 a 14． 92 ± 0． 58 a
30 4． 15 ± 0． 11 ab 14． 83 ± 1． 01 a
32 2． 04 ± 0． 21 c 10． 76 ± 1． 58 bc
35 2． 37 ± 0． 18 c 4． 52 ± 0． 66 d
40 0 e 2． 08 ± 1． 01 de
45 0 e 0． 69 ± 0． 60 e
16526 期 李雪玲等:高山榕叶枯病病原菌分离鉴定和生物学特性的初步研究
35
30
25
20
15
10
5
0分
生
孢
子
萌
发
率
(%
)
Co
ni
di
a
ge
rm
in
at
io
n
ra
te
2.5 3 4 5 6 7 8 9 10 10.9
pH 值
pH value
图 4 不同 pH值对分生孢子萌发的影响
Fig． 4 Effect of different pH on spore germination
15 ℃处理相比存在显著差异，与其他处理相比显著
水平达到显著差异。孢子萌发温度适应范围广泛，0
～ 40 ℃均能萌发，28 ～ 30 ℃孢子萌发率最高，与 45
℃处理相比存在显著差异，与其他处理相比显著水
平达到显著差异(表 3)。
2． 5 不同 pH值对 CX0021D4 分生孢子萌发的影响
试验结果表明，该病原菌分子孢子在 pH 值 2． 5
～ 10． 9 均能萌发。分生孢子在 pH 值 7． 0 ～ 8． 0 时
萌发率最高(图 4)。
2． 6 不同杀菌剂对 CX0021D4 菌株生长的影响
供试的 5 种广谱杀菌剂对该菌株的生长影响不
同。敌克松和恶霜锰锌对该菌株的生长基本没有抑
制作用。抑菌效果最好的是百菌清，扑海因次之，再
其次是代森锰锌。百菌清抑菌效果与敌克松和恶霜
锰锌相比达到极差异显著，与其他杀菌剂相比达到
显著差异(图 5)。
3 讨 论
3． 1 病原菌的分离鉴定
核酸序列在遗传进化中有高度保守性，其结构
基因也最为保守从而被广泛应用于真菌的系统发育
和分类鉴定研究中［8］。高山榕是具亚热带特色的
绿化树种和庭园观赏树种，目前对高山榕叶片枯萎
病的病原菌还未见报道。为此，文章通过对高山榕
叶枯病病原菌的形态学特征观察结合分子生物学鉴
定进行研究，两者的鉴定结果相互吻合一致。经分
离鉴定，初步确定 CX0021D4 为丝孢纲(Hyphomyce-
tes)为层生镰孢菌 Fusarium proliferatum (Mat-
sush．)Nirenberg ex Gerlash ＆ Nirenberg。
3． 2 病原菌生物学特性研究
本研究结果表明，该菌对营养要求不高，碳源和
氮源均能利用，最适宜生长的碳源为蔗糖，氮源为牛
6
5
4
3
2
1
0
菌
落
直
径
(c
m
)
Co
lo
ny
di
am
et
er
代森猛锌 百菌清 敌克松 恶霜锰 扑海因 CK
杀菌剂
Fungicides
图 5 不同杀菌剂对菌丝生长的影响
Fig． 5 Effect of different germicides on mycelial growth
肉膏。该菌对温度和 pH 值的适应范围均较广，25
～ 28 ℃菌丝生长速度最快，28 ～ 30 ℃孢子萌发率最
高;适宜孢子萌发的 pH值为 7． 0 ～ 8． 0，弱碱性更利
于孢子萌发;有无光照对菌落生长没有明显地影响，
光照有利于孢子萌发。高温、高湿的雨季有利于病
害的迅速传播蔓延［9］，本研究结果与该病害主要发
生在 7 － 8 月的发病规律相一致。
3． 3 广谱杀菌剂对该菌生长的影响
供试的 5 种广谱杀菌剂对该菌株的生长影响不
同。敌克松和恶霜锰锌对该菌株的生长基本没有抑
制作用。抑菌效果最好的是百菌清，扑海因次之，再
其次是代森锰锌。对该病害要如何防治还需进一步
的试验探索。
参考文献:
［1］吴 英． 大理地区高山榕种子育苗技术初探［J］． 林业调查规
划，2007，32(6) :147 － 148．
［2］陈旭玉，甘炳春，冯锦东． 高良姜叶枯病病原菌的分离和鉴定
［J］．安徽农业科学，2014，42(16) :5031 － 5032．
［3］Booth C． The genus fusarium commonwealth mycological institute
［M］． England:Kew Surrey，1971．
［4］Bayford D． The identification of fusarium species［M］． Egham:Inter-
national Mycological Institute Press，1993．
［5］LESLIE J F，SUMMEＲELL B A． The fusarium laboratory manual
［M］． Iowa:Blackwell Professional Publishing，2006．
［6］王茜，廖惠红，黄宏明，等． 柑橘黄龙病病原 DNA 提取方法比较
［J］．南方农业学报，2013，44(2) :225 － 229．
［7］方中达． 植病研究方法［M］． 北京:中国农业出版社，1998．
［8］陆家云． 植物病原真菌学［M］． 北京:中国农业出版社，2001．
［9］赵志慧． 中国禾本科作物上镰孢菌属真菌分类的研究［D］． 沈
阳农业大学博士论文，200．
［10］孙广宇，彭友良，李振歧，等． 核苷酸序列分析在真菌系统学研
究中的应用［J］． 西北农林科技大学学报(自然科学版) ，2003，
31(6) :187 － 192．
［11］傅本重，赵文丽，王立华，等． 吉祥草叶斑病菌的生物学特性及
室内防治药剂筛选［J］． 西南农业学报，2015，28(1) :212 － 216．
(责任编辑 王家银)
2652 西 南 农 业 学 报 28 卷