全 文 ：中国农学通报 2012,28(19):17-21
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
虎榛子(Ostryopsis davidiana)是中国分布范围较
广的特有种之一，隶属桦木科(Betulaceae)，虎榛子属
(Ostryopsis)，主要分布于辽宁西部、内蒙古、河北、山
西、陕西、甘肃、四川北部，是阴山山脉极度退化生态系
统中残存的重要灌木树种[1]。虎榛子野外繁殖，尤其
基金项目：国家自然科学基金项目“内蒙古块菌菌根及其生物生态学特性的研究”(31060111)；内蒙古教育厅基金项目“土生空团菌与宿主植物互作
的基因表达谱分析与差异性表达基因的识别”(NJ09055)。
第一作者简介：薛丽宁，女，1985年出生，内蒙古人，硕士，研究方向：微生物学（资源与环境微生物）。通信地址：010018内蒙古农业大学生命科学学
院，Tel：0471-4309240，E-mail：xue1226happy@yahoo.cn。
通讯作者：姚庆智，男，1974年出生，内蒙古人，副教授，博士，研究方向：微生物学（资源与环境微生物）。通信地址：010018内蒙古农业大学生命科学
学院，Tel：0471-4309240，E-mail：yaoqingzhi@163.com。
收稿日期：2012-03-08，修回日期：2012-05-30。
虎榛子组织培养及其菌根化技术研究
薛丽宁 1，赵慧英 1，姚庆智 1，张文泉 2，闫 伟 2
（1内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特 010018；2内蒙古农业大学林学院，呼和浩特 010019）
摘 要：为了获得大量的虎榛子组培幼苗，并对其进行瓶内菌根合成试验研究，以虎榛子带腋芽的茎段为
外植体，进行外植体的灭菌，基础培养基的筛选，增殖培养和生根培养并对虎榛子组培幼苗进行瓶内菌
根化研究。结果表明：经75%酒精处理30 s，5%NaClO处理7 min，虎榛子成活发芽率达到66%；WPM为
最佳基础培养基；诱导虎榛子芽增殖的最佳培养基为WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.03 mg/L，增殖率达
到436.7%；最佳生根培养基为WPM+NAA 0.2 mg/L，生根率达到100.0%。对生根10天的虎榛子幼苗进
行瓶内菌根合成试验，结果显示：接种土生空团菌[Cenococcum geophilum Fr. (Cg)]CgO5后虎榛子组培
苗各项生长指标均显著提高，试验结果将为虎榛子幼苗快繁及其组培苗菌根化技术提供依据。
关键词：虎榛子；组织培养；增殖；菌根化
中图分类号：Q939.9 文献标志码：A 论文编号：2012-0790
Studies on the Tissue Culture and Mycorrhizal Technology of Ostryopsis davidiana
Xue Lining1, Zhao Huiying1, Yao Qingzhi1, Zhang Wenquan2, Yan Wei2
(1College of Life Science, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018;
2College of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010019)
Abstract: In order to get a number of plantlets and make mycorrhizal synthesis test of Ostryopsis davidiana,
the Ostryopsis davidiana of which the stem segments with axillary buds were taken as the explants. The tissue
culture from aspects of disposal, selection of basic medium, proliferation, rooting and mycorrhizal research of
Ostryopsis davidiana were studied in the experiment. The results showed that: the best way of sterilization was
soaked in 75% alcohol for 30 s, then treated in 5% NaClO for 7 min, then the germination rate could reached to
66%; the optimal basic medium was the WPM; the optimal proliferation medium for the buds was WPM+6-BA
0.5 mg/L+NAA 0.03 mg/L and the proliferation rate reached to 436.7%; for rooting, the optimal medium was
WPM+NAA 0.2 mg/L. The rooting rate was up to 100.0%. Mycorrhizal synthesis test in the tissue culture bottle
of Ostryopsis davidiana after rooting for 10 days showed that multiple growth indices of Ostryopsis davidiana
plantlets were improved definitely after inoculated CgO5. The results provided the theoretical basis for the
rapid propagation and mycorrhizal technology of Ostryopsis davidiana.
Key words: Ostryopsis davidiana; tissue culture; proliferation; mycorrhizal formation
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在恶劣立地条件下主要靠根蘖繁殖，种子只有在雨水
充沛条件下才会产生，而前人对虎榛子栽培技术的研
究仅限于播种育苗后挖掘其根蘖苗进行栽植 [2]。因
此，为了得到大量优质的虎榛子幼苗必须靠无性繁殖
技术[2-4]。目前，离体组织培养已经逐渐成为一些经济
作物、林木和果树的主要繁殖形式[5]。在这种形式的
种苗繁育过程中，由于植物组织培养是在无菌条件下
进行的，因而种苗与菌根真菌接触的机会大为减少，甚
至到了后期也还常常得不到菌根真菌的帮助，导致苗
木生长状况较差，抵抗力较弱，成活率较低。因此，尽
早对组培苗进行高效菌根真菌的人工接种，实现其菌
根化，是培育壮苗的重要途径之一 [6]。土生空团菌
[Cenococcum geophilum Fr.(简称 Cg)]属子囊菌亚门
(Ascomycotina)、大团囊菌科(Elaphomycetaceae)、空团
菌属(Cenococcum)。主要以菌丝体和菌核结构存在，
极少形成有性结构，菌丝黑色[7]，是自然界最为常见的
外生菌根真菌之一，其具有突出的抗旱性和抗贫瘠能
力，在含水量低的土壤中及在各种恶劣生境条件下常
成为优势种群[8-12]。有研究者对内蒙古大青山外生菌
根资源与生态调查发现，虎榛子与土生空团菌共生现
象普遍，在其他植被不断退化的生态系统中，虎榛子能
够正常生长，可能与菌根共生有重要的联系[3]，但是前
人的研究只对虎榛子实生苗进行了菌根合成试验，而
对虎榛子组培苗进行合成试验的研究尚属空白。
因此，笔者以虎榛子带腋芽的茎段为外植体，经过
大量试验，筛选出虎榛子组织培养各阶段的最佳培养
条件，实现其快速无性繁殖，并对虎榛子与土生空团菌
CgO5进行组培苗的菌根化研究，试图探明虎榛子与
土生空团菌菌根关系，以期为虎榛子的培育壮苗以及
植被建设提供新的理论及试验依据。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
试验于 2010年 5月从内蒙古大青山取样，组织培
养及菌根合成试验工作在内蒙古农业大学生命科学学
院实验室进行。
1.2 试验材料
1.2.1 供试外植体 选取虎榛子植株带腋芽的嫩枝
茎段。
1.2.2 供试菌根真菌 选取土生空团菌 (Cenococcum
geophilum)菌株 CgO5（分离于虎榛子 (Ostryopsis
davidiana)菌根组织）。
1.3试验方法
1.3.1 外植体的灭菌 将虎榛子带腋芽的茎段洗净后，
流水冲洗 2 h，在超净台上先用 75%酒精处理 30 s，然
后用无菌水冲洗 3~5次，再分别在 5%NaClO和 0.1%
HgCl2中处理 3~9 min，并不断搅动，再经无菌水漂洗
3~5遍，灭菌滤纸吸干水分，用手术刀切掉茎段两头与
灭菌剂接触的部分，接种到培养基上，第7天观察污染
率和发芽率，第30天统计成活率。
1.3.2 基础培养基筛选试验 以MS、1/2MS、WPM 3种
培养基为基础培养基[13]，不添加任何激素，以带腋芽茎
段为外植体进行预培养。培养基中含琼脂0.8%，蔗糖
3.0%，pH 5.5（以下提到的培养基琼脂、蔗糖含量、pH
均相同）。每个处理接种20个材料，试验重复3次。每
天观察、记录外植体生长情况，连续观察30天。
1.3.3 增殖培养 将在基础培养基上诱导出的新芽分别
接种到不同浓度6-BA+NAA组合的WPM培养基上进
行增殖培养，30天后观察芽增殖情况。6-BA浓度分别
为0.5、1.0 mg/L 2个梯度，NAA浓度分别为0.01、0.02、
0.03、0.04、0.05 mg/L 5个梯度，不同浓度的激素组合
共10个处理，每处理接种20个材料，试验重复3次。
1.3.4 生根培养 生根培养基为：WPM+NAA，NAA浓
度分别为 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 6个梯度，每个
梯度接种 20个材料，试验重复 3次，以探讨不同浓度
NAA对虎榛子生根效果的影响，筛选出适宜的生根培
养基。
1.3.5 组培苗瓶内菌根化研究 虎榛子幼苗接于生根培
养基上生长10天后，将CgO5固体菌种，在超净台中用
无菌打孔器在活化的菌种菌落边缘打取菌丝块（直径
约 0.9 cm），每瓶接入 4个菌丝块，以未接种菌根真菌
CgO5的处理为对照。待虎榛子幼苗生长 120天后分
别随机抽取 15株接种CgO5的组培苗以及 15株未接
种CgO5对照苗测定苗木生长指标(苗高、地径、生物量
等)。观察接种菌根真菌CgO5后对苗木生长的影响，
并统计菌根化率。计算见公式(1)。
菌根化率=(形成菌根株数/接种株数)×100%…(1)
1.3.6 培养条件 培养温度为(25±2)℃，相对湿度60%~
75%，光/暗周期16 h/8 h，光照强度1500~2000 lx。
1.3.7 试验仪器 SW-CJ-IF洁净工作台（苏州安泰空气
技术有限公司）；D-1型自动蒸汽灭菌锅（北京发恩科
贸有限公司）；GXZ型智能光照培养箱（宁波东南仪器
有限公司）；赛多利斯酸度计、电子分析天平（赛多利斯
科学仪器（北京）有限公司）；GZX-9070-MBE数显鼓
风干燥、HPX-9082-MBE数显电热培养箱（上海博迅试
验有限公司医疗设备厂）。
1.3.8 试验试剂 蔗糖（天津市北方天医化学试剂厂）；
琼脂（南京博尔迪生物科技有限公司）；硝酸钾（天津市
风船化学试剂科技有限公司）；磷酸二氢钾（天津市申
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薛丽宁等：虎榛子组织培养及其菌根化技术研究
泰化学试剂有限公司）；碘化钾（天津市标准科技有限
公司）；硝酸铵、结晶硫酸镁、氯化钙、硝酸钙、硼酸、硫
酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、乙二
胺四乙酸二钠、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素（天津市
福辰化学试剂厂）；甘氨酸（天津市北联精细化学品开
发有限公司）；肌醇（天津市永大化学试剂开发中心）；
萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤（美国Sigma公司）。以上
试剂均为AR分析纯。
1.3.9 统计分析 数据统计分析采用Microsoft Excel和
SPSS 13.0软件处理，多重比较采用LSD’s检验法。
2 结果与分析
2.1 外植体灭菌
植物组织培养技术首先要解决的是对外植体的消
毒，继而建立无菌培养系，此环节是植物组织培养中难
度较大的环节之一[14]。结果表明（见表1），不同灭菌剂
与不同灭菌时间的处理对虎榛子外植体灭菌效果的影
响存在很大差别。说明虎榛子外植体灭菌应综合考虑
灭菌的时间和灭菌剂，才有助于提高外植体的成活
率。当5%NaClO灭菌时间达到7 min以上，0.1%HgCl2
灭菌时间达到9 min时对虎榛子外植体的污染率无差
处理号
1
2
3
4
5
6
7
8
灭菌剂
5%NaClO
5%NaClO
5%NaClO
5%NaClO
0.1%HgCl2
0.1%HgCl2
0.1%HgCl2
0.1%HgCl2
灭菌时间/min
3
5
7
9
3
5
7
9
平均污染率/%
64ab
44cd
28e
24e
68a
50bc
32de
28e
平均发芽率/%
38c
42c
72a
38c
34c
40c
56b
44c
平均成活率/%
30d
34cd
66a
32cd
28d
36bcd
44b
40bc
表1 不同灭菌剂不同灭菌时间对茎段污染率和发芽率的影响
注：同列不同小写字母表示5%水平的差异显著。下同。
异，5%NaClO灭菌 7 min的平均发芽率以及平均成活
率与其他处理比较差异显著。故本试验条件下灭菌效
果最好的处理是3号，即用5%NaClO灭菌7 min，其外
植体污染率为28%，平均成活率达66%。
2.2 不同培养基对腋芽生长的影响
在建立一项新的培养系统时，选择合适的培养基
是组织培养成功的前提[15]。选取组织培养试验中最常
用的MS、1/2MS和木本植物培养基WPM为基础培养
基，观察虎榛子在 3种基础培养基上的生长状况。根
据试验结果（见表2）可知，虎榛子在WPM培养基中诱
导率与MS以及 1/2MS比较差异显著，大于MS以及
1/2MS培养基，其诱导率达到83.3%。
2.3 不同浓度激素组合对虎榛子芽增殖的影响
植物激素是培养基中的关键物质，在基本培养基
确定的前提下，筛选合适的激素种类和激素配比是组
织培养成功与否的关键[16]。试验结果（见表3）表明，外
处理号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6-BA/(mg/L)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
NAA/(mg/L)
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
接种芽数/个
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
增殖芽数/个
90
154
262
166
138
76
86
108
158
190
增值率/%
150.0d
256.7c
436.7a
276.7bc
230.0c
126.7d
143.3d
180.0d
263.3bc
316.7b
培养基种类
1/2MS
MS
WPM
接种腋芽数/个
60
60
60
成活腋芽数/个
26
36
50
诱导率/%
43.3b
60.0b
83.3a
表2 不同培养基对腋芽生长的影响
表3 不同浓度激素组合对芽增殖的影响
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植体接种 30天后，接入各培养基的芽均可增殖，但不
同浓度激素组合的培养基增殖率不同。其中，3号处
理的增殖率与其他处理比较，差异显著，即当 6-BA浓
度为 0.5 mg/L，NAA浓度为 0.03 mg/L时，虎榛子芽的
增殖率达到 436.7%，且该激素浓度组合下，增殖的苗
茎粗壮，叶大而绿，生长状况最佳（见图1A）。
2.4 不同浓度NAA对虎榛子生根的影响
NAA浓度对虎榛子生根率的影响比较大。试验
结果（见表4）显示，在无任何激素的对照培养基上，随
着 NAA的加入，生根率逐渐增加。当 NAA浓度为
0.2 mg/L时，生根率最高达到100.0%，并且根的各项生
长指标最好、根系健壮（见图1B）。但是，当NAA的浓
度超过 0.2 mg/L时，生根率逐渐开始下降。说明高浓
度的激素反而会抑制根的生长。因此，诱导虎榛子生
根培养的最佳NAA浓度为0.2 mg/L，此时生根率达到
100.0%。
2.5 接种CgO5对虎榛子生长的影响
对接种 120天后的虎榛子组培苗进行观察，发现
CgO5菌株与虎榛子组培苗形成了菌根（图 2A箭头所
示），且菌根化率达到 73.3%。接种CgO5对虎榛子组
培苗各项生长指标的影响差异均显著。由表 5可知，
形成菌根的虎榛子组培苗的苗高、地径、干重、根冠比
等都显著的增加了(P<0.01)（见图 2B）。其中，菌根苗
比对照苗的苗高提高了 57.9%；地径提高了 32.7%；地
上干重提高了65.5%；地下干重提高了141.7%；总干重
提高了 96.3%；根冠比提高了 46.3%。这些结果表明，
接种CgO5菌株并形成菌根后，可以显著促进宿主苗
NAA/(mg/L)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
接种幼苗数/个
60
60
60
60
60
60
生根数/个
34
42
60
46
44
38
生根率/%
56.7c
70.0bc
100.0a
76.7b
73.3bc
63.3bc
表4 不同浓度NAA对虎榛子生根的影响
图1 虎榛子增殖及生根培养
A B
A B
图2 虎榛子接种CgO5的生长状况
处理
接种CgO5
不接种CgO5
菌根化率/%
73.3
0
苗高/cm
9.963±1.096A
6.310±0.759B
地径/mm
2.76±0.28A
2.08±0.30B
地上干重/g
0.283±0.026A
0.171±0.013B
地下干重/g
0.278±0.036A
0.115±0.013B
总干重/g
0.530±0.061A
0.270±0.025B
根冠比
0.98±0.049A
0.67±0.046B
表5 接种CgO5对虎榛子生长的影响
注：同列不同大写字母表示1%水平的差异显著。
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薛丽宁等：虎榛子组织培养及其菌根化技术研究
木的生长，尤其是促进宿主的地下生物量和根冠比的
增加，这能使树木最大限度地吸收环境中的水分，从而
提高植物的抗旱性。
3 结论与讨论
外植体表面都可能带有病菌，由于培养基中含有
高浓度的糖类和其他多种有机营养成分，适宜微生物
的生长繁殖，带菌的外植体一旦接触了培养基，细菌、
真菌等自身快速生长的同时，还会排泄对培养植物有
毒的代谢废物，危害培养物的生长，甚至将植物组织全
部杀死。因此，为了获得无菌材料，在接种之前必需经
过灭菌处理。同时，不同外植体对灭菌剂和灭菌时间
的反应的差异是很大的，因此应当正确选择灭菌剂的
种类和处理时间以降低污染率，提高外植体的存活率，
并尽量减少组织死亡。本试验将虎榛子带腋芽的茎段
经 75%酒精处理 30 s，再用 5%NaClO灭菌 7 min，其外
植体污染率为28%，成活率达到66%。
培养基是植物组织培养的物质基础，也是植物组
织培养能否获得成功的重要因素之一。通过对基础培
养基的选择试验发现，采用WPM培养基，对虎榛子腋
芽的诱导率达到 83.3%，诱导出的新芽健壮嫩绿。除
了基础培养基外，激素的种类和质量浓度的搭配也是
关键因素，在植物组织培养中，由于激素的累积作用，
要有效的诱导一种植物产生芽或促进嫩茎的良好增
殖，所需求激素的种类和浓度在不同培养阶段有所不
同。本试验得到虎榛子最佳增殖培养基为：
WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.03 mg/L，增殖率达到
436.7%。最佳生根培养基为WPM+NAA 0.2 mg/L，生
根率达到100.0%。
通过测定与CgO5合成菌根后虎榛子组培苗的各
项生长指标，发现接种CgO5对虎榛子组培苗各项生
长指标的影响差异均显著。形成菌根的虎榛子组培苗
的苗高、地径、干重、根冠比等都显著的增加。该试验
外生菌根真菌只采用了土生空团菌CgO5，对于接种
其他不同外生菌根真菌与虎榛子组培苗是否能形成菌
根，以及是否对虎榛子组培苗的各项生长指标有影响
还有待进一步验证。另外，菌根化对生长是否有促进
作用，还需对已菌根化的再生植株在田间的表现进行
更长期的观测。
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