全 文 ：收稿日期:2008-05-10
基金项目:江苏省科技项目(BM2006104);南京市科技计划
项目(200701056);江苏省科技厅专项资金项目
(BM2006507)
作者简介:徐霞(1966-), 女 , 研究方向为药用植物活性成
分的研究。
＊通讯作者:冯煦 , E-mail:fengxu@mail.cnbg.net
耳叶牛皮消指纹图谱的研究
徐　霞 ,贾晓东 ,姚欣梅 ,管志建 ,陈为民 ,袁昌齐 ,冯　煦＊
(江苏省中国科学院植物研究所 /南京中山植物园 江苏省药用植物研究开发中心 ,江苏 南京 210014)
摘　要　目的:研究耳叶牛皮消的指纹图谱。方法:高效液相色谱法 ,双波长阵列检测器(DAD),乙腈 -水梯度洗
脱;流速:0.5 ～ 1.0mL/min;检测波长:230、280nm。结果:选择了 10个共有峰 ,并以白首乌二苯酮作参照物确定了
各共有峰的相对保留时间 ,精密度 、稳定性 、重复性试验中各共有峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD均 <3%。
结论:本方法可以作为耳叶牛皮消药材的质量控制方法。
关键词　耳叶牛皮消;白首乌;指纹图谱;HPLC
中图分类号:S567　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-9690(2009)03-0045-04
StudiesontheFingerprintofCynanchumauriculatumRoyleexWight
XuXia, JiaXiaodong, YaoXinmei, GuanZhijian, ChenWeimin, YuanChangqi, FengXu
(JiangsuCenterforResearch＆DevelopmentofMedicinalplants, JiangsuInstituteofBotany, ChinaAc-
ademicofScience/NanjingBotanicalGardenMem.SunYat-Sen, Nanjing210014, China)
Abstract　Aim:ToestablishHPLCfingerprintsofCynanchumauriculatumRoyleexWight.Methods:
HPLCwasapplyedonAgilentC18columnwithacetonitrile-watersolution, flowrateof0.5-1.0 mL/
min.DeterminationwerecarriedoutbyDAD, wavelengthwas230and280nm.Results:10peakswere
selectedascoexistpeaks.TheirrelativetimesweredeterminedbycomparewithCynandioneA.TheRSD
ofrelativeretentiontimeandpeakareaofcoexistpeaksmeettomethodrequirementduringtheinvestiga-
tionofprecision, stabilityandrepeatibitytrials.Alofthe10 batchesofsamplesshareahighsimilarity.
Conclusion:ThismethodcanbeusedforqualitycontrolofCynanchumauriculatumRoyleexWight.
Keywords　CynanchumauriculatumRoyleexWight;RadixCynanchumauriculatum;fingerprint;
HPLC
　　白首乌是一种少常用中药 ,具有补肝肾 、益精
血 、止心痛 、壮筋骨 、悦颜色 、乌须发等功效[ 1] 。白
首乌药材品种来源因地而异 ,中国药典(1977年版)
曾收载泰山白首乌(CynanchumbungeiDecne)的根
茎为中药白首乌[ 2] ,后因多种原因 , 以后各版均未
收载 ,但由于解放前期泰山植被破坏致极 ,泰山白首
乌资源遭到很大破坏濒临绝种。目前 ,民间白首乌
药材的主流商品是耳叶牛皮消(Cynanchumauricu-
latumRoyleexWight),在江苏 、湖北有大量种植 ,药
理实验证明其具有与泰山白首乌显著不同的药理作
用。为了更好的明确两种药源植物的区别 ,指导临
床合理用药 ,我们按照国家药品监督管理局 2000年
颁发的 “中药注射剂指纹图谱技术要求 ”的有关规
定[ 3] ,对产于江苏的不同采集地点的 10批耳叶牛皮
消进行了 HPLC指纹图谱方法的建立 ,并与泰山白
首乌进行了比较。建立其指纹图谱是为了反映其质
量情况 ,为建立稳定 、可靠 、全面的质量控制方法提
供科学依据。
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第 28卷第 3期
2009年 6月 　　　　　　　　　　　　　 中 国 野 生 植 物 资 源ChineseWildPlantResources　　　　　　　　　　 　Vol.28 No.3Jun.2009
1　试验材料及仪器
1.1　样品
本实验植物样品包括耳叶牛皮消药材 10份 ,泰
山白首乌 1份 ,所有药材经本所袁昌齐研究员鉴定 ,
凭证样品存放于江苏省药用植物研究开发中心 ,其
编号 、采摘地点及采摘时间等见表 1。样品采收后
洗净 、切片 、晒干 、粉碎 、过 80目筛 、混匀 、真空干燥
备用。
表 1　植物样品情况
批号 学名 产地 采收日期 备注
A031030-1 C.auriculatum江苏滨海港 03 /10 /30 一年生栽培品
A031115-1 C.auriculatum江苏滨海港 03 /11 /15 一年生栽培品
A031130-1 C.auriculatum江苏滨海港 03 /11 /30 一年生栽培品
A031030-2 C.auriculatum江苏滨海港 03 /10 /30 二年生栽培品
A031115-2 C.auriculatum江苏滨海港 03 /11 /15 二年生栽培品
A031130-2 C.auriculatum江苏滨海港 03 /11 /30 二年生栽培品
A021107-2 C.auriculatum江苏滨海港 02 /11 /07 二年生栽培品
A0312BJ C.auriculatum 江苏八巨 03 /12 栽培品
A0312BT C.auriculatum 江苏八滩 03 /12 栽培品
A0312ZD C.auriculatum 江苏振东 03 /12 栽培品
B03 /12 C.bungei 山东泰山 03 /12 野生品
1.2　对照品
白首乌二苯酮 ,本课题组分得 , HPLC检测证明
纯度≥98%。
1.3　试剂及仪器
Agilent1100系列 HPLC, DAD检测器 ,色谱柱:
ZORBAXECLIPSCXDB-C18(4.6mm×250mm)。
甲醇为国产色谱纯和国产分析纯。
2　方　法
2.1　色谱条件
经方法学研究确定色谱条件 ,梯度洗脱程序见
表 2。柱温:30℃;自动进样器 ,进样量:10μL;检测
波长:230, 280 nm。
表 2　梯度洗脱程序
Time/min 乙腈含量 /% Flow(ml/min)
0 30 0.5
10 40 0.5
20 50 0.5
30 60 0.5
40 70 0.5
50 100 0.5
60 100 1.0
2.2　参照物标准液制备
精密称取白首乌二苯酮 10 mg,用甲醇定容至
100 mL,作为参照物溶液备用 。
2.3　供试液制备
精密称取样品 1.0 g,加甲醇 50 mL定容 ,超声
提取 30 min,过滤 ,低温减压浓缩 ,少量甲醇溶解 ,直
接过自制 ODS小柱(直径 1 cm高 8 cm,约 10 g,适
量加压 ,甲醇平衡),用 16 mL甲醇洗脱 ,收集洗脱
液并定容至 25 mL,作为样品供试液备用。
2.4　稳定性试验
取供试品液 ,分别在 0、4、8、12、24 h检测指纹
图。结果各色谱峰的相对保留时间和峰面积比值基
本一致 , RSD<3%,供试品溶液在 24h内稳定 ,符合
指纹图谱技术要求 。
2.5　精密度试验
取供试品溶液 ,连续进样 5次 ,检测指纹图。比
较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积 ,结
果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积
基本一致 , RSD<3%,符合指纹图谱的检测要求。
2.6　重现性试验
取相同编号样品 5份 ,按供试品溶液制备方法
制备供试品 ,检测指纹图。并分别按上述液相条件
测定 ,对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行
统计 , 5份供试品溶液的 RSD<3%,符合指纹图谱
的要求。
2.7　样品测定
精密吸取标准对照品溶液和供试液各 10 μL,
分别注入液相色谱仪 ,按 2.1节中色谱条件测定 ,即
得。以白首乌二苯酮色谱峰(S峰)的保留时间及峰
面积为 1,计算各共有指纹峰的相对保留时间和峰
面积比值 。并按 “中药注射剂指纹图谱研究的技术
要求 ”建立耳叶牛皮消药材的指纹图谱检测标淮 。
3　实验结果
3.1　相对保留值指纹谱的建立
采用相对保留时间标定指纹峰 ,记录 60 min的
色谱图 ,以图谱中白首乌二苯酮为参照物(S),将各
指纹峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间
(设定为 1)比较 ,其比值为各指纹峰的相对保留时
间。计算 10批药材指纹图谱中各指纹峰的技术参
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 野 生 植 物 资 源　　　　　　　　　　　　　　　　第 28卷
数(见表 3、表 4),标定特征指纹峰 10个 ,见图 1。
各特征指纹峰的保留时间为:峰 -1(7.769 min);峰
-2(9.323min);峰 -3(9.739min);峰 -4(20.639
min);峰 -5(22.795 min);峰 -6(24.397 min);峰
-7(28.211 min);峰 -8(32.112 min);峰 -9
(38.891min);峰 -10(43.580min)。
图 1　典型耳叶牛皮消 HPLC色谱图
表 3　HPLC指纹图谱检测结果(相对保留时间)
峰号 A0310
30-1
A0311
15-1
A0311
30-1
A0310
30-2
A0311
15-2
A0311
30-2
A0211
07-2
A031
2BJ
A031
2BT
A031
2ZD X
1 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
2 1.200 1.201 1.201 1.199 1.200 1.199 1.201 1.203 1.202 1.198 1.200
3 1.253 1.254 1.254 1.252 1.252 1.251 1.254 1.255 1.255 1.253 1.253
4 2.657 2.657 2.656 2.657 2.655 2.658 2.657 2.659 2.657 2.655 2.657
5 2.934 2.931 2.936 2.934 2.932 2.935 2.934 2.938 2.934 2.939 2.935
6 3.138 3.132 3.131 3.138 3.134 3.137 3.132 3.136 3.135 3.135 3.135
7 3.631 3.632 3.634 3.634 3.631 3.632 3.632 3.635 3.632 3.633 3.633
8 4.136 4.135 4.133 4.135 4.133 4.136 4.133 4.132 4.131 4.131 4.134
9 5.007 5.006 5.006 5.007 5.009 5.005 5.006 5.005 5.006 5.004 5.006
10 5.609 5.608 5.609 5.608 5.607 5.607 5.605 5.609 5.607 5.608 5.608
表 4　HPLC指纹图谱检测结果(相对峰面积比值)
批号
峰 1 峰 2 峰 4 峰 6
占总峰
面积比
相对峰
面积
占总峰
面积比
相对峰
面积
占总峰
面积比
相对峰
面积
占总峰
面积比
相对峰
面积
A031030-1 28.31 1 9.27 0.328 22.25 0.786 15.17 0.536
A031115-1 28.26 1 9.28 0.328 22.19 0.785 14.23 0.503
A031130-1 27.67 1 9.55 0.345 22.71 0.821 14.55 0.526
A031030-2 27.68 1 9.59 0.346 22.70 0.819 15.23 0.549
A031115-2 27.38 1 9.69 0.354 22.55 0.823 15.34 0.560
A031130-2 27.13 1 9.80 0.361 22.39 0.825 14.98 0.552
A021107-2 27.17 1 9.79 0.360 22.46 0.827 14.66 0.540
A0312BJ 30.78 1 10.72 0.348 23.67 0.770 15.02 0.489
A0312BT 27.38 1 9.70 0.354 22.55 0.823 14.36 0.524
A0312ZD 29.75 1 9.97 0.335 23.59 0.793 15.45 0.519
X 28.151 1 9.736 0.3459 22.706 0.8072 14.899 0.5298
3.2　共有指纹峰面积的比值
通过 10批药材测定 ,以图谱中白首乌二苯酮为
参照物(S),将各特征指纹峰面积与同一图谱中参
照物的峰面积比较 ,其比值为特征指纹峰的相对峰
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第 3期　　　　　　　　　　　　　　　徐　霞 , 等:耳叶牛皮消指纹图谱的研究 　　　　　　　　　　　　　　　　
面积。据 “中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 ”
规定 ,各共有指纹峰的面积比值必须相对固定 。峰
-1、4单峰面积占总峰面积百分比 >20%,其差值
<20%;峰 -5、 6、8单峰面积占总峰面积百分比
>10%,而 <20%,其差值 <25%;其余单峰面积比
均 <10%,峰面积比值不做要求 。符合指纹图谱的
要求 。
3.3　泰山白首乌图谱的测定
相同色谱条件下 ,经 HPLC测定得到泰山白首
乌的 HPLC色谱图 ,见图 2。
图 2　泰山白首乌 HPLC色谱图
4　讨　论
(1)本实验不同于含量测定 ,指纹图谱需反映
所有组分组成和含量差异 ,但由于分析条件和检测
条件所限 ,能被 ODS小柱吸附的物质在反相色谱柱
中也难以洗出 ,所以用甲醇液直接过 ODS小柱获得
的供试液 ,能代表本实验所能获得的最大信息量 ,并
减少色谱柱污染 。
(2)同种耳叶牛皮消(Cynanchumauriculatum)
间虽然采收日期不同 ,产地不同 ,但图谱都含有 10
个共有峰 ,且相对峰面积变化不大 ,图形相似 , 10个
共有峰峰面积之和大于总峰面积 80%,具有代表
性 。
(3)在耳叶牛皮消 、泰山白首乌中均发现苯酮
类成分 ,药典中作为药材的萝藦科植物 ,如徐长卿 、
白前 、白薇等也都以丹皮酚为标准品 ,还很有可能苯
酮类成分是 C21甾体酯苷的前体。 C21甾体酯苷种类
多 ,含量低 ,少数单体难以在各个种中都能检测到 ,
所以优先考虑用苯酮类成分做参照峰 。
(4)反相液相色谱法因其适用范围广 ,且作为
流动相的水和能与水互溶的有机溶剂均较正相色谱
中的流动相价廉易得 ,因而被首先考虑采用。其次 ,
白首乌药材中所含成分较多 ,性质差异较大 ,采用等
度洗脱的方式很难在短时间内将其有效成分洗脱和
分离 ,因而采用反相梯度色谱法来分离白首乌药材
中极性差异较大的多种组分。为保证梯度洗脱重现
性 ,在实验中采用线性梯度 、简化溶剂系统 、简化梯
度程序。分别考察了甲醇 -水 、甲醇 -乙腈 -水 、乙
腈 -水三种色谱系统 ,在甲醇 -水系统中色谱峰不
能得到良好的分离 ,峰形较差且基线上扬 ,在流动相
中加入一定比例的乙腈后 ,色谱峰明显得到了良好
的分离 ,但出峰时间仍然过长 。乙腈 -水系统不但
色谱峰峰形佳 ,而且出峰时间短 ,故被采用。用 Shi-
madzuUV-2501PC紫外可见分光光度计对样品甲
醇供试液测试表明 ,所有样品供试液在 280nm处均
有较大的吸收峰 ,在 230 ～ 200 nm波长处有很大的
吸收值 ,由于在小于 230nm波长处进行梯度洗脱很
难得到平稳的基线 ,所以选择 230nm作为主要检测
波长 , 280 nm作为对照检测波长。
(5)比较泰山白首乌与耳叶牛皮消 HPLC标准
谱图 ,发现二者差异很大 ,泰山白首乌含有较多极性
较大的成分 ,出峰早 。我们认为极性较大的成分为
苯酮类成分 ,极性较小的成分为 C21甾体酯苷 。作为
白首乌的正品泰山白首乌 C.bungei和作为白首乌
主流商品的耳叶牛皮消 C.auriculatum同属于鹅绒
藤属植物 ,其化学成分有如此大的差异 ,在药理药效
方面也应有明显区别 。耳叶牛皮消 C.auriculatum
已被研究证明具有抗肿瘤 、调节免疫功能 、抗衰老 、
抗缺氧 、降血脂等作用 ,主要有效成分为 C21甾体酯
苷。而泰山白首乌主要含有苯酮类成分 ,可能具有
很好的保肝作用[ 4-5] ,二者不能混用。
参考文献:
[ 1] 　中国医学科学院药物研究所等.中药志 第二册 [ M] .北京:人
民卫生出版社 , 1982:328-336. (下转第 64页)
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 野 生 植 物 资 源　　　　　　　　　　　　　　　　第 28卷
精密称取已知沙苑子苷含量的沙苑子总黄酮
5.0mg,加入 50 μg/mL沙苑子苷对照品储备液 5
mL,取 1 mL上样 ,过固相小柱 ,取 20 μL进 HPLC分
析 ,计算回收率 ,结果见表 1。
表 1　回收率测定结果
样品 已知量/μg
加入量
/μg
测得量
/μg
回收率
/% x RSD
1 4.84 5 9.98 103.05
2 4.84 5 9.87 100.78
3 4.84 5 9.85 100.35
4 4.84 5 9.88 100.96
5 4.84 5 9.98 103.10
6 4.84 5 10.16 106.64
102.48 2.3%
　注:此表格中的已知量 、加入量和测得量为过固相小柱后每毫升洗
脱液中的含量。
2.8　样品测定　
取 3批沙苑子总黄酮粉末 ,按供试品溶液制备
方法 ,各制备 3份供试品溶液 ,进样 20 μL,测量峰
面积 ,计算沙苑子苷含量。结果见表 2。
表 2　样品测定结果
样品 峰面积 含量 /%
1 315328±9315 4.84±0.14
2 368375±13723 5.64±0.21
3 325793±14553 5.00±0.22
3　讨　论
(1)由上述结果可见 ,用 50%甲醇作为溶剂溶
解沙苑子总黄酮后再以同样溶剂作为洗脱液过正相
氨基小柱 ,该小柱可吸附样品中的强极性成分 ,使沙
苑子苷与其他成分达到基线分离 ,此方法回收率良
好 ,可作为沙苑子总黄酮分析方法 。
(2)试验中比较了用流动相 、50%甲醇与 50%
乙醇制备并稀释沙苑子苷对照品储备液的差异 ,发
现用流动相溶解对照品时峰面积与浓度不成比例 ,
数据波动大;而用 50%乙醇溶解对照品时 ,进样量
为 20 μL时较进样量为 10 μL时柱效显著下降 ,可
能与乙醇粘性较大 ,进样量过大时不易洗脱有关 。
(3)当用乙醇为溶剂溶解沙苑子总黄酮时 ,过
正相氨基小柱后直接取洗脱液进样时沙苑子苷峰与
前一峰不能分离 ,分离度降至 0.7左右 。需挥干溶
剂进样 ,而用甲醇溶解沙苑子总黄酮时 ,则不必挥干
溶剂 ,可直接进样。
参考文献:
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大学学报:医学版 , 2002, 22(6):686-687.
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的含量 [ J] .中国中药杂志 , 2005, 30(8):600-602.
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(上接第 48页)
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