全 文 ：收稿日期:2009-09-21;　修订日期:2010-05-30
作者简介:何行玲(1969-),女(汉族),湖北宜昌人 ,现任湖北省宜昌市夷
陵医院主管药师 ,主要从事医院药学方面的研究工作.
耳叶牛皮消颗粒对慢性萎缩性胃炎大鼠 p53
及 PCNA蛋白表达的影响
何行玲1 ,彭传芬 1 ,黄祖明 1 ,郭莲军2
(1.湖北省宜昌市夷陵医院　443100;　2.华中科技大学同济医学院 ,湖北 武汉　430030)
摘要:目的 观察耳叶牛皮消颗粒对实验性慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠 p53基因及增生细胞核抗原(PCNA)表达的影
响。方法 采用热盐水灌胃方法制作 CAG动物模型 ,以不同剂量的耳叶牛皮消颗粒进行治疗后 , 用免疫组化法检测大鼠
胃黏膜 p53及 PCNA蛋白的表达。结果 经过热盐水灌胃造模后 , 大鼠胃黏膜腺体萎缩。以耳叶牛皮消颗粒治疗后 , 大鼠
胃黏膜腺体萎缩明显减轻 , 胃黏膜细胞 p53阳性表达率和 PCNA标记指数显著降低。结论 耳叶牛皮消颗粒治疗 CAG的
机制可能是通过抑制突变型 p53基因及 PCNA蛋白的表达 ,从而恢复细胞增殖与凋亡的平衡来实现的。
关键词:耳叶牛皮消颗粒;　慢性萎缩性胃炎;　p53;　PCNA
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.09.123
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)09-2390-01
　　慢性萎缩性胃炎(CAG)是消化系统疾病治疗中的难点之
一 , 属于癌前病变 , 对人类健康威胁较大。耳叶牛皮消 Cynan-
chumauriculatumRoyleexWight为萝藦科鹅绒藤属植物 , 是广泛
分布于四川 、湖北等地的常用草药 ,具有养阴补虚 、健脾消食之功
效。笔者经研究发现 , 耳叶牛皮消能明显提高小鼠的小肠推进功
能 [ 1] 。进一步以耳叶牛皮消 、黄连 、枳实 、白术 、三七等中药制成
耳叶牛皮消颗粒 , 并观察了其对 CAG大鼠胃黏膜 p53及 PCNA
蛋白表达的影响。现报告如下 。
1　材料
1.1 　动物 清洁级 SD大鼠 ,体质量(200±20)g, ♂,由华中科技
大学同济医学院实验动物中心提供(动物生产许可证号:医动字
第 19-025号)。
1.2　 药物与试剂 耳叶牛皮消颗粒由本院制剂室制备 , 批号:
20070819, 处方组成为耳叶牛皮消 、黄连 、枳实 、党参 、白术 、茯苓 、
三七 、白芍 、法半夏 、甘草 、干姜 , 临用时用蒸馏水配制成合适浓度
的混悬液。抗 p53单克隆抗体(DO-1), 由北京中山生物技术有
限公司提供;PCNA单克隆抗体和 LSAB试剂盒 , 由 DAKO公司
(日本)生产。
2　方法
2.1　模型制作及给药方法 取健康 SD大鼠 110只 , 随机分为 5
组 , 每组 22只 , 即正常组 、模型组和耳叶牛皮消高 、中 、低剂量组。
除正常组外 , 其余各组均采用热盐水灌胃方法制作 CAG动物模
型 [ 2] 。即用 55℃的 15%氯化钠溶液灌胃 , 1次 /d, 每次 2.5 ml,
共 12周。实验开始 , 先处死 5只正常组大鼠 ,并留取胃大体标本
作为对照 , 以后各组每 2周处死 2只大鼠 , 取胃标本进行病理检
查 , 以观察胃黏膜萎缩情况 ,判断造模是否成功。从第 13周开始
灌服药物治疗 , 至第 24周末结束。其中耳叶牛皮消高 、中 、低剂
量组分别予耳叶牛皮消颗粒相当于原生药 5, 2.5和 1.25 g·
kg-1· d-1灌胃 , 正常组和模型组予等量蒸馏水灌胃。
2.2　检测指标及方法 各组实验结束将大鼠断头处死后剖腹取
全胃 , 沿大弯剖开 ,生理盐水漂洗摊平作大体观察 ,沿胃小弯条状
取材。胃黏膜标本经 10%甲醛液固定 , 石蜡包埋切片。免疫组
化采用链霉素抗生物素蛋白 -过氧化酶连接法(S-P), 按试剂
盒内说明书操作。阳性对照为已知阳性组织切片在同一条件下
反应 , 阴性对照以正常兔血清代替第一抗体。结果判断标准参考
文献 [ 3] 。 p53结果按如下方法进行评分:①阳性着色程度:无着
色为 0, 浅着色为 1, 深着色为 2;②阳性着色范围:无着色为 0, 着
色小于 1/3为 1,着色大于 1/3为 2, 弥漫性着色为 3。然后将以
上两项评分相加 ,结果大于或等于三者为阳性病例。 PCNA结果
用 PCNA标记指数(LI)表示:LI=PCNA阳性细胞数 /计数细胞总
数 ×100%。在高倍镜下选取 5个有代表性的视野 , 每个视野记
数 100个细胞 , 计算 PCNA阳性细胞表达率。
2.3　数据处理 采用 t检验和 χ2检验 , SAS统计软件计算机处
理。
3　结果
p53阳性着色位于细胞核 ,呈棕黄色颗粒状 , 各切片显色分
布不均 ,以片状和局灶性为主 , 少数为弥漫性分布。见图 1。 PC-
NA阳性着色位于细胞核 , 呈棕黄色细颗粒状。见图 2。 CAG模
型大鼠在给予耳叶牛皮消颗粒治疗后 , p53阳性表达率和 PCNA
LI明显降低。其中耳叶牛皮消高 、中剂量组 p53阳性表达率明
显低于模型组(P<0.05), 耳叶牛皮消各剂量组 PCNALI显著低
于模型组(P<0.01或 P<0.05)。见表 1。
图 1　p53免疫组化阳性片细胞核着色 DAB显色(400×)
图 2　PCNA免疫组化阳性片细胞核着色 DAB显色(400×)
表 1　各组大鼠胃黏膜 p53及 PCNA蛋白的表达比较( x±s)
组别 动物数 p53阳性表达只 率(%)
PCNA
标记指数
模型 11 6 54.5 40.87±10.74
耳叶牛皮消低剂量 12 3 25.0 28.67±8.03＊
耳叶牛皮消中剂量 12 2 16.7＊ 27.33±6.65＊＊
耳叶牛皮消高剂量 12 2 16.7＊ 26.67±5.92＊＊
　　与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.9
4　讨论
正常胃黏膜细胞的增生与凋亡维持着细胞总数的平衡 ,这种
平衡的失调在 CAG到胃癌的发展过程中起重要作用。细胞凋亡
受众多基因调控 , 其中 p53基因是与人类肿瘤发生相关性最高的
突变基因 , 位于 17号染色体短臂上 , 对细胞的生长有重要的调节
作用。野生型 p53基因能阻止具有癌变倾向的突变细胞出现 ,但
它很容易转变成突变型 p53基因而丧失调节功能 , 导致细胞恶性
增生 [ 4] 。野生型 p53基因表达的蛋白半衰期甚短 ,一般检测方法
难以检出 , 而当基因发生突变时 ,其表达的蛋白质构型发生改变 ,
半衰期延长 , 因此免疫组化测得的 p53蛋白为突变型蛋白。正常
胃黏膜细胞中无突变型 p53表达 , 但在慢性萎缩性胃炎向肠上皮
化生过程中 , 及在异型增生阶段内其阳性表达率增至 60%[ 5] 。
PCNA又称周期素 ,是真核细胞 DNA合成所必需的一种核蛋白 ,
其合成与表达反映了细胞的增殖状态。 PCNA阳性细胞的多少
与肿瘤发展 、预后均有密切关系。 在 CAG的肠化和不典型增生
阶段 , 随着细胞增生活跃程度的加重 , 其 PCNA阳性表达率明显
增高 [ 6] 。本实验对热盐水致 CAG模型大鼠胃黏膜细胞 p53及
PCNA蛋白的表达进行了免疫组化测定 , 发现其 p53和 PCNA阳
性表达率处于较高水平。说明 CAG模型大鼠细胞增殖活性明显
升高 , 易于向恶性转化。给予耳叶牛皮消颗粒治疗后 , 大鼠胃黏
膜细胞 p53阳性表达率和 PCNALI显著降低。提示耳叶牛皮消
颗粒治疗 CAG的分子生物学机制可能是通过抑制突变型 p53基
因及 PCNA蛋白的表达 , 从而恢复细胞增殖与凋亡的平衡来实现
的。
参考文献:
[ 1 ] 　李文胜 ,彭定国 ,屈万红 ,等.耳叶牛皮消对胃肠运动的作用及其机
制研究 [ J] .中国药房 , 2007, 18(33):2575.
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[ 3 ] 　伍银桥 ,王孟薇 ,吴本俨 ,等.胃癌变前后凋亡相关蛋白和PCNA的
表达 [ J] .世界华人消化杂志 , 2004, 12(4):770.
[ 4 ] 　KaelinWG.Theemergingp53genefamily[ J] .NationalCancerInst,
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[ 5 ] 　ShiaoYH, RuggeM, Correap, etal.p53alterationingastricprecan-
cerouslesions[ J] .AmJPathol, 1994, 144:511.
[ 6 ] 　王仰坤 ,纪小龙 ,马乃绪 , 等.萎缩性胃炎中 P53和 PCNA的表达
[ J] .新消化病学杂志 , 1997, 5(4):237.
收稿日期:2009-10-10;　修订日期:2009-12-30
作者简介:李　萍(1972-),女(汉族),陕西华县人 ,现任西安医学院副教
授 ,硕士学位 ,主要从事药理学教学及心血管药理科研工作.
白藜芦醇对大鼠实验性脑血栓形成的影响
李　萍 ,杜洪霞 ,侯　进 ,李　汾
(西安医学院基础医学部 ,陕西 西安　710021)
摘要:目的 观察白藜芦醇对大鼠实验性脑血栓形成的影响。方法 50只大鼠 , 随机分为 5组 ,分别用生理盐水 、尼莫地
平 20mg/kg,白藜芦醇 100, 50, 25 mg/kg灌胃 , 第 8天血栓诱导剂制备脑血栓模型 , 观察药物对脑梗塞区半球伊文氏蓝含
量及梗塞区半球重量与对照半球重量比值的影响。结果 白藜芦醇大 、中 、小剂量组均能减少梗塞侧伊文氏蓝含量 ,降低
梗塞区半球重量与对照半球重量比值。结论 白藜芦醇具有抑制脑血栓形成的作用。
关键词:白藜芦醇;　血栓形成
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.09.124
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)09-2391-01
　　白藜芦醇(resveratrol),化学名称为 3, 5, 4′-三羟基 -1,
2 -二苯乙烯 , 1940年首次从毛叶黎芦 Veratrumgrandiflorum的
根部分离获得 , 植物界分布较广 , 主要存在于虎杖 , 花生 , 葡萄
等七十多种植物中。现有研究表明 , 白藜芦醇具有抑制血小板
聚集 [ 1] , 降血脂 [ 2] , 抗肿瘤 [ 3] , 抗氧化 [ 4]等多种药理作用。本研
究观察了白藜芦醇对大鼠实验性脑血栓形成的影响。
1　材料
1.1　药品和试剂 白藜芦醇购于西安赛德公司(98% , HPLC)
, 实验时用二甲基亚砜(DMSO)溶解后蒸馏水配制为所需的浓
度 , 其中 DMSO质量分数不超过 2%;凝血酶(Thrombase), 美国
sigma公司;二磷酸腺苷(ADP), 美国 sigma公司;肾上腺素
(Adrenaline),上海黄河制药厂。
1.2　动物 健康 SD大鼠 ,雌雄各半 ,体质量(210±15)g, 由西安
交通大学医学院实验动物中心提供。
2　方法
2.1　分组 50只大鼠按体质量和性别随机均衡分为 5组。 ①模
型组 , 生理盐水灌胃;②尼莫地平组 , 尼莫地平 20 mg/kg灌胃;
③白藜芦醇大剂量组 , 白藜芦醇 100 mg/kg灌胃;④白藜芦醇中
剂量组 , 白藜芦醇 50 mg/kg灌胃;⑤白藜芦醇小剂量组 , 白藜芦
醇 25mg/kg灌胃。 1次 /d, 连续 7d, 第 8天制备脑血栓模型前
1h再给药 1次。
2.2　制备脑血栓模型 参考文献方法 [ 5] , 用 3%戊巴比妥钠 30
mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。分离气管 , 行气管插管术;分离右侧
颈总动脉 , 顺颈总动脉向前分离右颈外动脉 ,结扎颈外动脉和颈
总动脉向心端 ,从颈总动脉向远心端插管备用。每只动物从颈总
动脉注入血栓诱导剂 1 ml/kg(ADP1.25 mmol/ L, 凝血酶 1.25
万 U/L, 肾上腺素 1.0 g/L)。 5 min后由右颈总动脉注射 0.2%
伊文氏蓝 5 ml/kg, 5 min后迅速断头处死 ,开颅取出大脑 , 分开左
右半球称取脑湿重。之后将脑组织放入匀浆器中 , 加入 0.5%
Na2SO4及丙酮(3∶7)混合液 5ml, 制成匀浆 ,移入试管密封静置
60 min以上。经 3 000r/min离心 10 min,取上清液在 620 nm处
测其吸光度(A)。以栓塞半球(右侧为栓塞侧 ,左侧为对照侧)的
光密度 A值与其脑重量之比表示伊文氏蓝的含量 , 以此反映脑血
栓的严重程度。以梗塞区半球重量与对照半球重量的比值表示
梗塞侧脑水肿的程度。
2.3　统计学方法 所有实验数据均以 x±s表示 , 统计分析采用
SPSS11.5软件 , 组间比较采用 t检验。
3　结果
3.1　对大鼠脑梗塞区伊文氏蓝含量的影响 脑血栓模型制造后 ,
肉眼可明显看出右侧脑半球蓝染 , 以颅底蓝染程度为甚 , 左半球
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.9 时珍国医国药 2010年第 21卷第 9期