全 文 ：· 644· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.9 中国药房 2009年第 20卷第 9期
Δ湖北省重大科学技术成果(EK060478)
*副主任药师。研究方向:中药药理学。电话:0717-8212070。E-
mail:ylqjszx @163.com
复方隔山消颗粒用于大鼠慢性萎缩性胃炎的机制研究 Δ
李文胜 1 *,贾全安 2 ,屈万红 2 ,郭莲军 3(1.湖北宜昌市夷陵区医疗保险局 ,宜昌市 443100;2.湖北宜昌市夷陵
医院 ,宜昌市 443100;3.华中科技大学同济医学院 ,武汉市 430030)
中图分类号 R285.5;R283.627 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)09-0644-02
摘 要 目的:研究复方隔山消颗粒用于大鼠慢性萎缩性胃炎的作用机制 。方法:采用热盐水灌胃方法建立慢性萎缩性胃炎动物模
型 ,灌胃复方隔山消颗粒后检测大鼠血清胃泌素(GAS)和血浆胃动素(M TL)含量;用免疫组化法检测大鼠胃黏膜 p53基因及增生
细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达 。结果:慢性萎缩性胃炎模型大鼠血清 GAS和血浆M TL 含量显著下降;经复方隔山消颗粒灌胃
后 ,大鼠血清GAS和血浆MT L 含量显著升高 ,胃黏膜细胞 p53阳性表达率和 PCNA 标记指数显著降低。结论:复方隔山消颗粒用
于慢性萎缩性胃炎的机制可能与其促进 GAS和M TL 的分泌 、抑制 p53基因及 PCNA 蛋白的表达有关 。
关键词 复方隔山消颗粒;慢性萎缩性胃炎;胃泌素;胃动素;p53基因;增生细胞核抗原
Mechanism of Compound Geshanxiao Granules for Chronic Atrophic Gastritis
LI Wen_sheng(Hubei Yichang Yiling Dist rict M edical I nsurance Bureau , Yichang 443100 , China)
JIA Quan_an , QU Wan_hong(Hubei Yichang Yiling Hospi tal , Yichang 443100 , China)
GUO Lian_jun(Tong ji M edical School , Huazhong Science and Technology University , Wuhan 430030 , Chi-
na)
ABSTRACT OBJECTIVE:T o study the action mechanism of Compound geshanx iao granules for chronic at rophic gast ritis.
M ETHODS:Experimen tal chronic at rophic gastritis m odel w as established in rat s by intragastr ic administ ra tion of hot saline
w a ter , afte r in tragastric wit h Compound geshanxiao granules , the serum level of gastrin(GAS)and plasma level o f motilin
(M TL)in ra ts w ere determined , and the expressions o f rat gastric mucous memb rane p53 genes and the prolifera ting cell nu-
clea r an tigen(PCNA)w ere detected by immunohistochemistry m ethod.RESULTS :Serum GAS level and plasma M T L level
decreased m arkedly in chronic at rophic gast ritis model ra ts.Af ter trea tment w ith Compound geshanx iao granules , se rum GAS
level and plasm a M TL level increased markedly , w hile the positive expression ra tes o f p53 genes and PCNA labe ling index in
gastr ic mucous membrane cells decreased significantly.CONCLUS ION :The ac tion mechanism of Com pound geshanx iao
granules fo r chronic atrophic gastritis might be achieved by promoting secretions of gastr in and m otilin and inhibiting the
positive expressions o f p53 genes and PCNA pro teins.
KEY WORDS Compound geshanx iao granules;Ch ronic atrophic gastritis;Gast rin;Motilin;p53 gene;Pro liferating cell
nuclear antigen
慢性萎缩性胃炎(CAG)是消化系统疾病治疗中的难点之
一 ,属于癌前病变 ,对人类健康威胁较大 。隔山消来源于萝 科
植物耳叶牛皮消 ,具有养阴补虚、健脾消食之功效 ,民间常用于
治疗虚损劳伤 、胃痛饱胀等多种疾病 。经笔者研究发现 ,耳叶牛
皮消能明显提高小鼠的小肠推进功能 , 以耳叶牛皮消为主药制
成的复方隔山消颗粒对大鼠实验性 CAG 有较好的治疗作
用 [1 , 2 ]。本实验进一步观察了复方隔山消颗粒对 CAG 大鼠血
中胃肠激素和胃黏膜 p53基因及增生细胞核抗原 (PCNA)表
达的影响 ,旨在探讨其治疗 CAG 的作用机制。
1 材料
1.1 仪器
SN -682型放射免疫γ计数器 (上海核福光电仪器有限
公司);DL -8R型冷冻离心机(上海离心机械研究所)。
1.2 试药
复方隔山消颗粒(湖北宜昌市夷陵医院制剂室制备 ,批号:
20051209 ,处方组成:隔山消 、黄连 、枳实 、党参 、白术 、茯苓 、三
七 、白芍 、法半夏 、甘草 、干姜);正常兔血清(华中科技大学同济
医学院制备);胃泌素(GAS)、胃动素(M TL)放射免疫试剂盒
(北京华英生物技术研究所);抗 p53单克隆抗体(DO -1 ,北京
中山生物技术有限公司);PCNA 单克隆抗体和链霉亲和素蛋
白-生物素酶标免疫组化染色(LSAB)试剂盒(日本 DAKO 公
司)。
1.3 动物
清洁级 SD 大鼠 ,体质量(200±20)g , ♂,由华中科技大学
同济医学院实验动物中心提供 (动物生产许可证号:医动字第
19-025号)。
2 方法
2.1 模型建立及给药方法
取 SD 大鼠 110只 , 随机分为 5组 , 每组 22只 , 即正常对
照 、模型组和隔山消高 、中、低剂量组 。除正常对照组外 ,其余各
组均采用热盐水灌胃方法(用 55 ℃的 15%氯化钠溶液灌胃 ,每
日 1次 ,每次 2.5 mL ,共 12周)建立 CAG 动物模型 [3 ]。实验开
始 ,先处死 5只正常对照组大鼠 ,并留取胃大体标本作为对照 ,
以后各组每 2周处死 2只大鼠 , 取胃标本进行病理检查 , 以观
察胃黏膜萎缩情况 ,判断造模是否成功 。从第 13周开始灌服药
物治疗 ,至第 24周末结束。隔山消高 、中 、低剂量组分别灌胃复
方隔山消颗粒 5 、2.5 、1.25 g ·kg -1·d -1(以原生药计), 正常
对照组和模型组灌胃等量蒸馏水 。
2.2 检测指标
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各组动物于末次给药后禁食 12 h ,断头取血 4 mL ,置于 2
支试管中 ,每管 2 mL 。取一管以 2 000 r ·min -1离心 5 min ,分
离血清于 —20 ℃下保存 ,待测GAS;在另一试管中预置 10%乙
二胺四乙酸二钠(EDTA -Na)30μL 和抑肽酶 30μL , 充分混
匀 ,以 2 000 r ·m in -1离心 10 min ,分离血浆于 —20 ℃下保存 ,
待测M T L(血清 GAS 和血浆M TL 均采用放射免疫法 , 由华
中科技大学同济医学院附属同济医院核医学室测定)。将大鼠
剖腹取全胃 , 沿大弯剖开 , 生理盐水漂洗 , 摊平作大体观察 , 沿
胃小弯条状取材 。胃黏膜标本经 10%甲醛液固定 ,石蜡包埋切
片 。免疫组化采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接 (S -
P)法 ,按试剂盒内说明书操作 。阳性对照为已知胃黏膜 p53基
因表达阳性的胃癌组织切片(在同一条件下反应),阴性对照以
正常兔血清代替第一抗体 。结果判断标准参考文献 [4 ] 。胃黏膜
p 53基因表达结果按如下方法评分:(1)阳性着色程度:无着色
为 0 , 浅着色为 1 , 深着色为 2;(2)阳性着色范围:无着色为 0 ,
着色<1/3为 1 ,着色>1/3为 2 ,弥散性着色为 3。将以上 2项
评分相加 ,结果≥3者为阳性病例。胃黏膜 PCNA 蛋白表达结
果用 PCNA 标记指数(LI)表示:LI=PCNA 阳性细胞数/计
数细胞总数×100%。在高倍镜下选取 5个有代表性的视野 ,每
个视野记数 100个细胞 ,计算 PCNA 阳性细胞表达率 。
2.3 统计学方法
用 SAS 6.12统计软件处理数据 , 组间比较采用 t 检验或
χ2检验 。
3 结果
3.1 复方隔山消颗粒对大鼠血清GAS和血浆MTL的影响
模型组大鼠血清 GAS 和血浆M TL 水平降低 , 经复方隔
山消颗粒治疗后 , 血清GAS和血浆M TL 升高 。其中 , 隔山消
高 、中剂量组血浆 MT L 水平显著高于模型组(P <0.05),隔山
消各剂量组血清 GAS 水平显著高于模型组(P<0.05)。复方
隔山消颗粒对大鼠血清 GAS 和血浆M T L 的影响见表 1。
表 1 复方隔山消颗粒对大鼠血清GAS和血浆 MTL的影响
(x ±s , n=12)
Tab 1 Serum GAS level and plasma MTL level in rats af-
ter treatment with Compound geshanxiao granules(x ±s ,
n=12)
组别 剂量/ g· kg -1 ·d-1 GAS/pg · mL- 1 MTL/pg ·mL -1
正常对照组 - 50.16±12.93 55.21±10.65
模型组 - 32.73±9.08** 43.52±9.39*
隔山消高剂量组 5.0 45.73±9.82# 53.19±8.92#
隔山消中剂量组 2.5 46.03±12.19# 52.86±11.67#
隔山消低剂量组 1.25 44.69±8.52# 50.37±12.80
与正常对照组比较:*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较:#P<
0.05
vs.no rmal con tro l g roup:*P<0.05 , * *P<0.01;vs.model
g roup:#P<0.05
3.2 复方隔山消颗粒对大鼠胃黏膜 p53基因和 PCNA蛋白
表达的影响
胃黏膜 p53基因阳性着色位于细胞核 ,呈棕黄色颗粒状 。
各切片显色分布不均 , 以片状和局灶性为主 , 少数为弥散性分
布 。胃黏膜 PCNA 蛋白阳性着色位于细胞核 ,呈棕黄色细颗粒
状 。CAG 模型大鼠在给予复方隔山消颗粒治疗后 ,胃黏膜 p53
基因阳性表达率和 PCNA LI 显著降低 。隔山消高 、中剂量组胃
黏膜 p53基因阳性表达率显著低于模型组(P <0.05), 隔山消
各剂量组 PCNA LI 显著低于模型组 (P <0.05 或 P <
0.01)。复方隔山消颗粒对大鼠胃黏膜 p53基因和 PCNA 蛋白
表达的影响见表 2 。
4 讨论
表 2 复方隔山消颗粒对大鼠胃黏膜 p53基因和 PCNA蛋白
表达的影响(x ±s , n=12)
Tab 2 Expressions of gastric mucous membrane p53 genes
and the proliferating cell nuclear antigen(PCNA)af ter tr_
eatment with Compound geshanxiao granules(x ±s , n=12)
组别 剂量/g · kg- 1· d-1 胃黏膜p53基因阳性表达率/只(%) PCNA LI/%
模型组 - 7(58.3) 40.87±10.74
隔山消高剂量组 5.0 2(16.7)* 26.67±5.92**
隔山消中剂量组 2.5 2(16.7)* 27.33±6.65**
隔山消低剂量组 1.25 3(25.0) 28.67±8.03*
与模型组比较:*P<0.05, * *P<0.01
vs.model group:*P<0.05, **P<0.01
GAS 由胃窦G 细胞产生 ,是胃黏膜的主要营养因子 。B型
萎缩性胃炎由于胃窦 G 细胞减少 , 释放的 GAS亦相对减少 ,
使胃黏膜失去激素的滋养作用 , 从而更加重了萎缩 , 形成恶性
循环 [5 ] 。M T L主要作用是刺激胃肠道和胆道运动 ,还能刺激胃
蛋白酶和胰液的分泌 , 有助于胃排空和食物消化 。本实验观察
到 CAG 模型大鼠血清GAS和血浆M T L明显下降 。经过复方
隔山消颗粒相当于原生药 2.5 g ·kg -1 ·d -1以上剂量治疗后 ,
大鼠血清 GAS和血浆M T L 显著升高 。说明复方隔山消颗粒
能促进 GAS 和M TL 等胃肠激素的分泌 ,从而增加胃动力 ,促
进胃液分泌 ,营养和修复损伤的胃黏膜 。
p 53基因位于 17号染色体短臂上 , 与人类肿瘤发生密切
相关 。野生型 p53基因能阻止具有癌变倾向的突变细胞出现 ,
其很容易转变成突变型 p53基因而丧失调节功能 , 导致细胞恶
性增生 [6 ] 。野生型 p53基因表达的蛋白半衰期甚短 , 一般检测
方法难以检出 ,因此免疫组化测得的 p53蛋白为突变型蛋白。
正常胃黏膜细胞中无突变型 p53表达 ,但在慢性萎缩性胃炎向
肠上皮化生过程中及在异型增生阶段内其阳性表达率增至
60%。PCNA 又称周期素 ,其合成与表达能准确地反映细胞的
生长速度和状态 。在 CAG 的肠上皮化生和不典型增生阶段 ,随
着细胞增生活跃程度的加重 ,其 PCNA 阳性表达率明显增高 [7 ]。
本实验结果表明 ,用复方隔山消颗粒治疗后大鼠胃黏膜 p 53基
因阳性表达率和 PCNA LI 显著降低 。提示复方隔山消颗粒治
疗 CAG 的分子生物学机制可能是通过抑制突变型 p53基因及
PCNA 蛋白的表达 , 从而恢复细胞增殖与凋亡的平衡来实现
的 。
参考文献
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(收稿日期:2008-06-18 修回日期:2008-09-22)