全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2010, 22:1069-1072
文章编号:1001-6880(2010)06-1069-04
　
　
　收稿日期:2009-03-25　　　接受日期:2009-07-06
　基金项目:陕西省自然科学基金(SJ08B05);陕西省教育厅基金
(09JS080)
＊通讯作者 Tel:86-29-88303484;E-mail:buhy@nwu.edu.cn
滇黄芩再生植株中黄酮类化合物的组织化
学定位及黄芩苷的含量测定
岑举人 1, 2 ,步怀宇 1＊ ,孔祥鹤 1 ,王英娟 1 ,贾敬芬 1
1西北大学西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室 ,西安 710069;
2北京师范大学生命科学学院 , 北京 100875
摘　要:应用植物组织化学定位方法 , 研究了组织培养滇黄芩再生植株中黄酮类化合物的积累分布状态;并且
通过 HPLC对滇黄芩再生植株中黄芩苷的含量进行测定。结果表明 ,滇黄芩再生植株黄酮类化合物主要存在于
营养器官的表皮和皮层 ,以及茎 、叶腺毛中。同时 ,测定再生植株中黄芩苷的含量表明 ,地下部分(根)含量为 0.
12%;地上部分(茎 、叶)含量为 0.43%。
关键词:滇黄芩;再生植株;组织化学;黄酮类化合物;黄芩苷;HPLC
中图分类号:Q94-334;R284.2 文献标识码:A
HistochemicalLocalizationofFlavonoidsandDeterminationof
BaicalininRegeneratedPlantsofScutelariaamoenaC.H.Wright
CENJu-ren1, 2 , BUHuai-yu1＊ , KONGXiang-he1 , WANGYing-juan1 , JIAJing-fen1
1KeyLaboratoryofResourceBiologyandBiotechnologyinWesternChina(NorthwestUniversity), MinistryofEducation,
Xi an710069 , China;2ColegeofLifesciences, BeijingNormolUniversity, Beijing100875 , China
Abstract:Thehistochemicalmethodwasappliedinthestudyofthelocalizationofflavonoidsintheregeneratedplantlets
ofScutelariaamoenaC.H.Wright.Theresultsshowedthattheflavonoidsweremainlydistributedintheepidermisand
cortexparenchymaofthevegetativeorgans.Theflavonoidswerealsofoundtoaccumulateinthetentaclesofthestems
andleaves.Inaddition, thecontentofbaicalinintheregeneratedplantletswasdeterminedbyHPLC.Thecontentofba-
icalininthestemsandleaves(0.43%)washigherthanthatintheroots(0.12%).
Keywords:ScutellariaamoenaC.H.Wright;regeneratedplantlet;histochemistry;flavonoids;baicalin;HPLC
　　中药滇黄芩(ScutelariaamoenaC.H.Wright)是
西南地区药用黄芩的主流品种 ,用于治疗各种炎症 、
以及胃痉挛和解除乌头中毒引起的多种中枢神经症
状 ,药用历史悠久[ 1] 。药理研究表明黄酮类化合物
是黄芩属药用植物的主要有效成分 ,其中含量高并
具有明显药理作用的是黄芩苷 、黄芩素 、汉黄芩苷和
汉黄芩素[ 2] 。滇黄芩的药用成分与正品黄芩有一定
的差异 ,但是滇黄芩的黄芩苷含量居同属药用植物之
首 ,因此滇黄芩有很大的药用价值及开发潜力[ 3-5] 。
滇黄芩为多年生草本植物 ,生长周期长 。目前
以野生资源为主 ,未形成规模化种植 ,为国家三级重
点保护野生药材 [ 6] 。本研究利用植物组织培养技
术获得的滇黄芩再生植株 ,通过组织化学定位方法
与 HPLC法对滇黄芩试管苗黄酮类化合物及黄芩苷
含量进行了分析 ,对利用生物技术生产黄芩苷和保
护野生滇黄芩资源有一定参考价值。
1　材料与方法
1.1　仪器与材料
植物材料:滇黄芩引种自云南大理 ,栽培在西北
大学生物园。取不带腋芽茎段灭菌后 ,接种于 MS+
2mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA培养基上诱导愈伤
组织并分化芽点 ,芽点在 MS+2mg/L6-BA+0.2
mg/LNAA培养基上扩繁丛生芽。在 1/2 MS+0.2
mg/LIBA培养基诱导生根获得滇黄芩再生植株。
扦插继代培养于相同培养基 , 30 d后备用。
Leica-DMLB显微镜;Waters2695-2996型高效
液相色谱仪 (美国 Waters公司);DHG-9123A型电
热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);Ep-
pendorf离心机 (德国 GeneCompanyLimited);
PerkinElmer型紫外分光光度计。
黄芩苷对照品购自中国药品生物制品检定所
(批号 110715-200815);甲醇为色谱纯 ,水为超纯
水 ,其余药品均为分析纯。
1.2　方法
1.2.1　再生植株黄酮类化合物的组织化学定位
对继代培养 30 d的新鲜滇黄芩再生植株的根 、
茎 、叶 ,进行徒手切片 ,材料放置于洁净的载玻片上 ,
滴加适量的 5% NaOH进行显色反应 [ 7] , Leica-DM-
LB显微镜观察并照相 。
1.2.2　再生植株总黄酮含量测定
继代培养 30 d的滇黄芩再生植株 ,分别取根 、
茎 、叶 , 55 ℃,烘干 24 h,研钵捣成细粉备用 。参考
有关方法[ 8]进行黄芩苷的微量提取:精密称取 100
mg干粉 ,加入 70%乙醇 1.5mL,称重 ,超声(80 Hz,
45 ℃)60 min,称重 ,用 70%乙醇补足重量;13, 000
r/min离心 ,精密移取上清 0.5 mL,加入乙醇 4.5
mL稀释 ,作为供试品溶液 。取已制备好的 3份供试
品溶液测定 ,以乙醇为空白溶液 ,在 279 nm处测吸
收度。每个样品重复测定 3次。
以黄芩苷对照品吸收度作标准曲线。
1.2.3　再生植株黄芩苷的 HPLC定量分析
高效液相色谱法的色谱条件为:SymmetryC18
(150 mm ×4.6 mm, 5.0 μm)色谱柱;流动相 100
mmol/L甲醇∶水(40∶60),流速 1.0 mL/min,柱温:
常温;检测波长 279 nm,灵敏度 2.00 AUFS,进样量
20 μL。确定黄芩苷峰保留时间及最佳色谱图。
对照品溶液的配制:精密称取经五氧化二磷减
压干燥至恒重的黄芩苷对照品 6mg,置 10 mL容量
瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,再吸取 1 mL
上述溶液置 10 mL容量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至
刻度 ,摇匀 , 即得黄芩苷 0.06 mg/mL的对照品溶
液。
供试品溶液的制备:分别取地上(根)、地上部
分(茎 、叶)同 1.2.2供试品提取方法 ,最终 13, 000
r/min离心 ,精密移取上清 0.5 mL, 加入甲醇 4.5
mL稀释 ,作为供试品溶液。
黄芩苷的测定:精密量取供试品溶液 20 μL进
样 ,依据标准曲线计算供试品中的黄芩苷含量。
2　结果与分析
2.1　滇黄芩再生植株黄酮类化合物的组织化学定
位
黄酮类化合物经 NaOH溶液染色后立即呈现黄
色 ,且其色度与黄酮类物质的含量成正比。组织化
学定位表明 ,黄酮类化合物在再生植株不同器官中
的分布和积累量不同:在根中 ,主要分布在表皮以及
图 1　滇黄芩再生植株黄酮类化合物的组织化学定位
Fig.1　HistochemicallocalizationofflavonoidsinregeneratedplantsofScutellariaamoenaC.H.Wright
注:图 1-1根横切面 , 1-1a对照 ,未显色;1-1b显色 ,示表皮以及皮层的邻近表皮的薄壁细胞被染色;图 1-2茎横切面 , 1-2a对照 ,未显色;
1-2b显色 ,示表皮 、茎棱角处厚角组织和皮层的薄壁细胞以及头状腺毛的单细胞头被染色;图 1-3叶横切面 , 1-3a对照 , 未显色;1-3b显
色 ,示表皮 、皮层的薄壁细胞和腺毛被染色。 Note:Fig.1-1Crosssectionofroot, 1-1acontrol;1-1bstainedwith5%NaOH, showingepidermis
andcortexparenchymawereyellow;Fig.1-2Crosssectionofstem, 1-2acontrol;1-2bstainedwith5% NaOH, showingepidermis, colenchymax,
cortexparenchymaandtentacleswereyelow;Fig.1-3 Crosssectionofleaf, 1-3acontrol;1-3bstainedwith5% NaOH, showingepidermis, cortex
parenchymaandtentacleswereyelow.
1070 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.22
皮层的邻近表皮的薄壁细胞 ,含量从外到内逐渐降
低(图 1-1b);茎中主要分布在表皮 、茎棱角处厚角
组织和皮层的薄壁细胞以及头状腺毛的单细胞头中
(图 1-2b);叶中主要分布在表皮 、皮层的薄壁细胞
和腺毛中(图 1-3b)。不加 NaOH溶液染色的再生
植株各器官均未见颜色变化 (图 1-1a, 2a, 3a)。由
NaOH组织化学的显色程度可以看出茎叶中黄酮类
化合物含量相对根较高 ,黄色清晰。
2.2　滇黄芩再生植株中总黄酮含量测定
以黄芩苷为对照品在 279nm处测吸收度 ,绘制
标准曲线 。结果表明黄芩苷浓度与吸收度呈良好线
性关系。回归方程为 y=0.0699x, r=0.9917。以
黄芩苷计量总黄酮含量 ,测定根 、茎和叶 3份供试溶
液 ,结果显示根含量为 7.0815 mg/g,茎含量为 18.
912 mg/g,叶含量为 29.928mg/g。
2.3　滇黄芩再生植株中黄芩苷的含量测定
2.3.1　黄芩苷色谱分析:
黄芩苷对照品及供试样品的色谱图(图 2A, B)
表明 ,黄芩苷的峰保留时间约为 40.2 min。
图 2　黄芩苷对照品(A)、样品(B)HPLC色谱图
Fig.2　HPLCchromatogramsofBaicalin(A)andsample(B)
2.3.2　线性关系考察
精密移取黄芩苷对照品溶液适量于 1.5mLEp-
pendorf管 ,用甲醇稀释 ,配成浓度为 3、6、12、18、24、
30 μg/mL的对照品溶液 。将上述对照品溶液按色
谱条件平行测定 3次(20 μL进样),记录峰面积 。
以平均峰面积 Y对浓度 C(μg/mL)进行线性回归 ,
黄芩苷回归方程和相关系数分别为 Y=60355X-
12822, r=0.9992。可知黄芩苷含量在 3 ～ 30 μg/
mL范围内线性关系良好。
2.3.3　精密度实验
精密吸取黄芩苷供试品溶液 20 μL,重复进样 6
次 ,进行测定 ,黄芩苷峰面积积分值的 RSD为 0.29%。
2.3.4　稳定性实验
精确吸取黄芩苷对照品溶液 20 μL,分别于 0、
2.0、4.0、6.0和 8.0h进行测定 ,黄芩苷峰面积积分
值的 RSD为 0.36%。
2.3.5　重复性实验
精密称取 100mg干重的滇黄芩根 6份 ,制备供
试品溶液 , 色谱条件测定黄芩苷含量的 RSD为
0.25%。
2.3.6　加样回收率实验
精密称取已测含量的滇黄芩根(0.12%)干粉
50 mg, 6份 ,每份准确加入黄芩苷对照品溶液(C=
0.06 mg/mL)1 mL,制备供试品溶液后 ,进行测定。
黄芩苷的平均加样回收率为 98.1%, RSD为 2.
12%,表明测定加样回收率良好。
表 1　加样回收率试验(n=6)
Table1　Addingrecoverytest(n=6)
样品质量
Quality(mg)
样品含量
Content
(μg)
黄芩苷加入量
Adding(μg)
黄芩苷测得量
Detecting(μg)
回收率
Recovery(%)
平均回收率
Average
recovery(%)
RSD(%)
50 60 60 117.723 98.103
50 60 60 120.119 100.099
50 60 60 116.158 96.798
50 60 60 121.438 101.198 98.15% 2.12%
50 60 60 115.913 96.594
50 60 60 115.319 96.099
1071Vol.22 　　　　　　岑举人等:滇黄芩再生植株中黄酮类化合物的组织化学定位及黄芩苷的含量测定 　
2.3.7　黄芩苷的测定
制备的滇黄芩再生植株供试品溶液 ,每次进样
20 μL测定 ,以 3次平均峰面积通过回归方程计算 ,
得到每个样品中黄芩苷的含量。结果表明滇黄芩地下
部分根的黄芩苷含量为 0.12%。地上部分的黄芩苷含
量为 0.43%,高出地下部分的黄芩苷的含量。
3　讨论
组织化学技术是确定有效药用成份在植物组织
中分布和积累的一种有效研究手段 [ 7] 。黄芩的传
统用药部位是根 ,可研究表明黄酮类化合物也分布
在茎叶中 ,具有调血脂 , 保肝 ,解热消炎等药理作
用 [ 9] 。滇黄芩再生植株中黄酮类化合物的组织化
学研究表明 ,黄酮类化合物主要定位于营养器官的
表皮和皮层 ,以及茎 、叶腺毛中 ,并颜色反应显示地
上部分茎叶中含量高于根部。经紫外分光光度法测
定再生植株总黄酮含量 ,也显示茎叶中黄酮含量分
别是传统用药部位根的 2.67和 4.23倍 。此研究结
果为黄芩的不同部位的开发利用提供了实验依据。
国家药典规定黄芩中黄酮类化合物黄芩苷的含
量是检验药用黄芩质量的标准[ 10] 。高效液相色谱
法对滇黄芩再生植株中黄芩苷的含量测定可知地上
部分高于地下部分的含量 ,与组织化学研究结果完
全一致 。但是测定的再生植株黄芩苷含量比已有报
道的野生药材中的含量要低很多[ 4, 8] 。分析可能原
因是:本研究所测定的滇黄芩材料是组织培养再生
植株 ,尚处于幼苗阶段 ,营养物质主要用于生长 ,次
级代谢产物合成的生物转换水平低。而野生黄芩在
自然环境下第一年也主要是根的增殖 ,次年才进行
黄芩苷的大量合成[ 11] 。另外 ,日本学者认为提取加
工方法对黄芩苷的生产极为关键 , 60℃低温干燥可
使黄芩苷含量下降 90%以上 [ 12] 。本实验在制样时
采用了 55℃烘干 ,可能造成测定含量偏低 。
滇黄芩细胞培养技术可缩短生产周期 ,为黄芩
苷提供新的药源 ,在进一步实验中将通过调节培养
基中组分 ,改变培养条件等手段提高滇黄芩再生植
株黄芩苷含量。同时本实验证实滇黄芩茎叶中含有
大量黄酮类化合物 ,具有很高的药用价值 ,对合理利
用和深度开发滇黄芩资源具有一定的指导意义 。
参考文献
1　LiYQ(李娅琼), YouC(游春), YangYW(杨耀文), et
al.TextualresearchofherbalismofScutelariaamoenaC.H.
Wright.JYunnanChinMedCol(云南中医学院学报),
2005, 28:15-17.
2　LiangY(梁英), HanLJ(韩鲁佳).Advancesinresearchof
pharmacologicalactivitiesofflavoniodcompoundsinScutel-
lariabaicalensisGeorgi.JChinaAgricUniv(中国农业大学
学报), 2003, 8:9-14.
3　XiaoLH(肖丽和), WangHY(王红燕), SongSJ(宋少
江), etal.Isolationandidentificationofthechemicalconstit-
uentsofrootsofScutelariaamoenaC.H.Wright.JShenyang
PharmUniv(沈阳药科大学学报), 2003, 20:181-183.
4　LiuML(刘美兰), YangLX(杨立新), WangYH(万元
浩).Determinationofbaicalinandwogonosideinsevenspe-
ciesofRadixScutellariaebyRP-HPLC.ChinJPharmAnal
(药物分析杂志), 2002, 22:99-102.
5　FuH(符洪), XiaoXY(肖新月), ZhangNP(张南平), et
al.Determinationandchromatogram recognitionofmain
chemicalconstituentsinRadixScutellariaeofdifferentre-
source.ChinJPharmAnal(药物分析杂志), 2003, 23:33-
39.
6　ZhaoZL(赵振玲), LiuQN(刘其宁), XiaoZW(肖植文),
etal.Somaticembryoinductionandplantletregenerationof
ScutellariaamoenaC.H.Wright.JSouthwestAgricSci(西南
农业学报), 2006, 19:714 - 715.
7　TanLL(谭玲玲), HuZH(胡正海), CaiX(蔡霞).Histo-
chemicallocalizationandthecontentcompareofmainmedic-
inalcomponentofvegetativeorgansinBupleurum.Chinese
DC.JMolCellBio(分子细胞生物学报 ), 2007, 40:214-
222.
8　XiongCM(熊春媚), GuoYD(郭亚东), MaYH(马银海),
etal.DeterminationofbaicalinandbaicaleinbyRP-HPLC.
FoodandDrug(食品与药品), 2007, 9:15-17.
9　ZhaoTH(赵铁华), ChenSP(陈四平), YangHS(杨鹤
松).Antiviralefectsofactivefractionfromstemsandleaves
ofScutelariabaicalensis.JChinaPharmUniv(中国药科大
学学报), 2006, 37:544-547.
10 PharmacopociaCommiteeofChina(国家药典委员会).
PharmacopoeiaofthePeople sRepublicofChina, PartⅠ
(中华人民共和国药典 , 一部).Beijing:ChemistryIndustry
Press, 2005.211-212.
11 LiY(李燕), WangCL(王春兰), GuoSX(郭顺星).Pres-
entadvancesinefectsofmanyfactorsonflavonoidsaccumu-
lationinplantcallusandcelcultures.ChinJPharm(中国
药学杂志), 2006, 41:651-655.
12 FangQ(方强), QiaoYJ(乔勇进).Advancesresearchin
calusinducementandcellcultureofScutellariabaicalensis
Georgi.NatProdResDev(天然产物研究与开发), 2008,
20:187-192.
1072 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.22