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夏枯草联合山慈姑对甲状腺癌细胞的抗增殖作用



全 文 :第22卷第28期 中国现代医学杂志 Vol. 22 No.28
2012年10月 China Journal of Modern Medicine Oct. 2012
收稿日期:2012-04-05
*基金项目:2009年广西研究生教育创新计划课题基金资助项目(No:2009105981002E210);2011年广西中医药管理局中医药民族医药自
筹经费科研资助项目(No:桂卫中[2011]11号);2010年广西大型仪器协作共用补助项目(No:FN021-2010-063)
[通信作者] 卢德成,E-mail:ludecheng@yahoo.com
文章编号: 1005-8982(2012)28-0046-05
·临床论著·
夏枯草联合山慈姑对甲状腺癌细胞的抗增殖作用*
蒙雯雯 1,黄雪梅 2,卢德成 1,罗佐杰 1,梁杏欢 1,周 嘉 1
(1.广西医科大学第一附属医院 内分泌科,广西 南宁 530021;
2.南宁市第一人民医院 内分泌科,广西 南宁 530022)
摘要:目的 探讨夏枯草联合山慈姑对甲状腺癌细胞的抗增殖作用。方法 不同浓度的夏枯草和山慈姑作
用于人甲状腺癌SW579细胞48h后,采用MTT法分别计算出夏枯草和山慈姑对SW579的半数抑制浓度
(IC50);实验分为夏枯草组、山慈姑组、夏枯草与山慈姑联合处理组及阴性对照组,将各组药物分别作用于
SW579细胞48h后,倒置相差显微镜下观察各组药物作用于SW579后细胞的形态学变化;Western blot检测
各组c-myc蛋白的表达。结果 夏枯草对SW579细胞的半数抑制浓度IC50为21mg/mL,山慈姑的半数抑制
浓度IC50为122mg/mL;夏枯草组与联合组能抑制SW579细胞的生长,且联合组的抑制作用较夏枯草组明显;
c-myc蛋白在夏枯草组及联合组的表达均较阴性对照组低,且在联合组的表达较夏枯草组表达更低(P<
0.05),小剂量山慈姑组与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论 夏枯草联合小剂量山慈姑对甲状腺
癌细胞增殖的抑制作用较为明显,为中药联合治疗甲状腺癌提供理论依据。
关键词:夏枯草;山慈姑;甲状腺癌细胞;c-myc;细胞增殖
中图分类号:R730.52;R736.1 文献标识码:A
Prunella vulgaris and cremastra appendiculata anti-
proliferate thyroid cancer cell in vitro*
MENG Wen-wen1, HUANG Xue-mei2, LU De-cheng1, LUO Zuo-jie1,
LIANG Xing-huan1, ZHOU Jia1
(1.Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,
Nanning, Guangxi 530021, P.R.China; 2.Department of Endocrinology, the First Peoples Hospital
of Nanning, Nanning, Guangxi 530022, P.R.China)
Abstract: 【Objective】To investigate the anti-proliferation effect of traditional Chinese medicine prunella vul-
garis and cremastra appendiculata on the thyroid cancer cell line in vitro. 【Methods】The human thyroid cancer
cell line SW579 was incubated particularly with different concentrations of Prunella vulgaris and Cremastra appen-
diculata, then the inhibition concentration 50%(IC50) of each drug can be measured by MTT assay. It can be divided
into four groups: the Prunella aulgaris group, the Cremastra appendiculata group, both of the two drugs and negative
group. The change of the cell morphology can be observed by inverted phase contrast microscope after treating with
different drugs. The expression of c-myc protein in different drug therapeutic teams was detected by Western blot.
【Results】The IC50 value of Prunella vulgaris was 21 mg/mL, and the IC50 value of Cremastra appendiculata was 122
mg/mL. The Prunella vulgaris and the two drugs group can inhibit the cell growth, especially in the two drugs group.
The c-myc protein of the Prunella vulgaris group and the two drugs group were lower than the negative group (P <
0.05), especially in the two drugs group(P <0.05), there is no difference between the small dose of Cremastra appen-
diculata and the negative group (P >0.05). 【Conclusions】The traditional Chinese medicine Prunella vulgaris and
cremastra appendiculata can anti-proliferate the growth of SW579 cell line, the small dose of cremastra appendicu-
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第28期 蒙雯雯,等:夏枯草联合山慈姑对甲状腺癌细胞的抗增殖作用
从天然药物中寻找具有抗肿瘤活性的药物成为
近年研究有关肿瘤治疗的热点。夏枯草为唇形科植
物,其主要的药用部分为其干燥成熟果穗,具有清肝
明目,软坚散结之功效,常用于治疗头痛眩晕、高血
压症、乳痈肿痛、乳癌、甲状腺肿大、淋巴结结核,尤
其对淋巴系统肿瘤有明显的疗效[1]。山慈姑为兰科植
物杜鹃兰 Cremastra appendiculata(D.Don)Makino、
独蒜兰 Pleione bulbocodiodes(Franch.)Rolfe 或云南
独蒜兰 Pleioneyunnannesis Rolfe的干燥假球茎,具
有清热解毒、软坚散结、镇痛、抗肿瘤的功效[2]。原癌
基因c-myc编码具有调节转录作用的DNA结合蛋
白,参与调控细胞的代谢、增殖、分化、黏附和凋亡过
程,还与人类肿瘤的发展和演进有关[3],c-myc的过
度表达是许多肿瘤的特征。本实验研究以甲状腺癌
SW579细胞为研究对象,探讨夏枯草和山慈姑处理
SW579细胞后对甲状腺癌的抗增殖作用及细胞内
c-myc蛋白的表达情况,为中药夏枯草和山慈姑治
疗甲状腺癌提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
甲状腺癌SW579细胞购自中科院上海细胞所。
主要试剂及配制:①夏枯草提取物:夏枯草40g加
水400mL,煮沸30min后过滤除渣,此时滤液浓度
为1g/mL,经120℃ 30min高压灭菌后,用直径0.22
μL的微孔滤膜正压过滤,使用时用L-15培养基稀
释至所需浓度。②山慈姑提取物:山慈姑40g加水
400 mL,煮沸40min后过滤除渣,此时滤液浓度为
1 g/mL,经 120℃ 30 min 高压灭菌后,用直径
0.22μL的微孔滤膜正压过滤,使用时用L-15培养
基稀释至所需浓度。L-15培养基购自博士德生物公
司,胎牛血清购自杭州四季青生物公司,胰蛋白酶、
二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)购自Amresco公
司,兔抗人c-myc抗体购自Cell Signaling公司,辣
根过氧化酶标记山羊抗兔 IgG 购自 Santa Cruz 公
司,内参β-actin购自上海康成有限公司,垂直电泳
槽及电转槽为美国Bio-Rad公司,倒置相差显微镜
为德国Carl Zeiss,酶标仪为美国Bio-Rad iMARK。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及实验分组人甲状腺癌 SW579
细胞于含10%胎牛血清的L-15培养基中培养,置
于37℃无二氧化碳培养箱内培养。实验组分4组:
①夏枯草组:夏枯草提取液为IC50浓度组;②山慈姑
组:小剂量山慈姑提取液组(与阴性对照组的细胞抑
制率无统计学差异的药物浓度);③联合组:夏枯草
及小剂量山慈姑联合处理组,④阴性对照组(培养液
中只有细胞无药物)。
1.2.2 药物半数有效抑制浓度(IC50) 将处于对数
生长期 细胞消化后制成单细胞悬液,调整密度为
8×104个/mL接种于96孔板中,100μL/孔。细胞
培养24h后,分别加入夏枯草提取液和山慈姑提取
液,使夏枯草终浓度为2、20、40、80和200mg/mL,
山慈姑终浓度为10、50、100、150和200mg/mL。48h
后,倒置相差显微镜下观察细胞的形态,用PBS小
心漂洗 2 次,每孔加入 100μL 完全培养基及 5
mg/mL的MTT 10μL。继续培养4h,小心吸弃上
清,每孔加入DMSO 100μL,在全自动酶标仪上低
速震荡10min使结晶完全溶解,DMSO调零在波长
490nm下测定吸光度A值,按下列公式计算细胞的
增殖抑制率:细胞增殖抑制率=(1-实验组A/对照
组 A)×100%。计算出两种药物的半数抑制浓度
IC50。
1.2.3 MTT 法检测各药物组细胞增殖抑制率
MTT法检测药物处理48h后夏枯草组、山慈姑组、
联合组及阴性对照组中细胞的增殖抑制率,倒置相
差显微镜下观察细胞生长状态并拍照记录。
1.2.4 Western blot检测c-myc表达情况分别离
心收集各个实验组的细胞,约1×106个细胞加入
100μL裂解液,冰上吹打裂解30min,4℃,12000
r/min,离心 30 min,小心吸取上清液即为细胞总蛋
白提取液。测定蛋白浓度,依据蛋白浓度上样,
SDS-PAGE凝胶双向电泳,将胶上蛋白电转移至硝
酸纤维膜上,以兔抗人 c-myc抗体为一抗,辣根过
氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗,以β-actin
为内参,进行免疫印迹分析,Quantity-one图像分析
软件进行定量分析。
1.3 统计学处理
采用 SPSS 13.0 统计软件进行分析,数据以
(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,LSD法
对各组数据进行两两比较,检验水准α=0.05,P<
lata can promote the anti-proliferation effect of prunella vulgaris.
Key words: prunella vulgaris; cremastra appendiculata; thyroid cancer cell; c-myc; cell proliferation
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1:山慈姑组;2:空白组;3:夏枯草组;4:联合组
图2 各实验组c-myc蛋白的表达
0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 两种药物IC50
MTT法求出两种药物对SW579细胞半数抑制
浓度(IC50),夏枯草对 SW579 细胞的 IC50为 21
mg/mL,山慈姑对SW579细胞的IC50为122mg/mL。
山慈姑浓度为50mg/mL时对细胞的抑制率与阴性
对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。因此,选择
50mg/mL山慈姑提取液为小剂量山慈姑组,夏枯草
与小剂量山慈姑联合组为夏枯草 IC50与 50mg/mL
小剂量山慈姑提取液。
2.2 各药物组对细胞增殖的影响
MTT法检测各药物组对细胞增殖抑制率,夏枯
草组,山慈姑组,联合组及对照组的细胞增殖抑制率
分别为(49.04±5.18)%、(11.70±4.50)%、(57.60±
6.13)%和0。夏枯草组及联合组能明显抑制SW579
细胞的增殖,与对照组相比差异均有显著性(P=
0.000),且夏枯草组抗增殖作用较联合组明显(P=
0.005),山慈姑组及对照组之间差异无显著性(P=
0.121)。
2.3 SW579细胞形态变化
A B C D
A:夏枯草组;B:山慈姑组;C:联合组;D:空白对照
图1 各药物组处理48h后SW579细胞的形态学变化(×200)
倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,如图1
所示,夏枯草组细胞间隙增大,部分细胞胞质回缩变
圆,联合组SW579细胞数量较夏枯草组明显减少,
细胞回缩变圆,细胞连接消失,胞质皱缩呈细胞凋亡
现象。山慈姑组与对照组SW579细胞数量及形态无
明显变化。
2.4 c-myc蛋白在各药物处理组的表达水平
Western blot 检测各药物组中 SW579 细胞
c-myc蛋白表达水平,如图2所示。夏枯草组,山慈
姑组,联合组及对照组的c-myc蛋白相对表达量分
别为(0.79±0.02)、(0.95±0.04)、(0.57±0.01)和
(0.98±0.01)。在夏枯草组、联合组中c-myc蛋白表
达水平均低于对照组,差异有显著性(P=0.000)。与
夏枯草组比较,联合组c-myc表达降低,差异有显
著性(P=0.000),山慈姑组与对照组间 c-myc 蛋白
表达差异无显著性(P=0.139)。
3 讨论
甲状腺癌是较常见的肿瘤,随着诊断水平的不
断提高,甲状腺癌已经成为发病率增长最快的癌症
之一[4]。甲状腺癌主要以手术治疗为主,术后易出现
复发和远处转移。中药治疗甲状腺癌有悠久的历史,
具有软坚散结,调节免疫,增强机体抗抵抗力等作
用,近年来成为肿瘤辅助治疗的研究热点。
夏枯草对多种肿瘤有不同程度的抑制增殖及促
进凋亡的作用[5]。刘新奎等[6]报道夏枯草提取物对人
淋巴瘤白血病细胞系Raji细胞增殖均有明显的抑
制作用,可明显促进细胞凋亡。本研究用MTT法观
察夏枯草对SW579细胞的增殖抑制作用,结果表明
夏枯草能抑制SW579细胞的生长,镜下观察可见大
多数SW579细胞胞质回缩,细胞间隙增大,呈现凋
亡现象,与文献报道[7]一致,提示夏枯草作用于肿瘤
细胞后能使细胞增殖受抑制,可能与细胞凋亡有关。
山慈姑是中医常用的抗癌药物,常以复方制剂
1 2 3 4
β-actin(43 kD)
c-myc(65 kD)
中国现代医学杂志 第22卷
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被广泛应用,有较好的临床效果。其复方制剂如慈丹
胶囊,对白血病细胞K562和HL60、胃癌FGC85、肝
癌SMMC7721均有抑制作用[8]。有研究表明山慈姑
与化疗药物联用能较明显改善患者的临床症状,提
高原发性肝癌患者的生存率[9]。本研究发现小剂量
50mg/mL的山慈姑,此浓度药物对SW579细胞的
增殖抑制作用与对照组之间差异无显著性(P>
0.05),提示山慈姑在该浓度下对细胞几乎无增殖抑
制作用。将该浓度山慈姑与夏枯草IC50组成复方制
剂联合作用于SW579细胞,发现其对细胞的增殖抑
制作用较单用夏枯草明显,差异有显著性(P<0.05),
镜下观察细胞的形态变化明显,细胞胞质皱缩呈圆
形,细胞间连接消失,呈现凋亡现象,表明小剂量的
山慈姑与夏枯草共同作用于甲状腺癌细胞后,增强
了夏枯草的抗肿瘤活性,提示小剂量山慈姑有促进
夏枯草的抗增殖作用。
近年来肿瘤分子生物学和分子遗传学的研究表
明,原癌基因的激活、抑癌基因的失活可引起多种肿
瘤的发生发展。c-myc属于核蛋白类调控基因,相关
研究证明c-myc原癌基因激活的主要方式是该基
因的扩增和过表达[10],当其高表达时能促进细胞的
增殖与恶性转化[11]。同时c-myc蛋白作为重要的转
录调节因子,具有双向调节作用[12],结合细胞接受何
种信号及所处的生长环境介导细胞增殖或凋亡。本
研究发现,c-myc蛋白在 SW579 细胞中呈高表达,
与文献 [13-14]报道相一致。Western blot 结果表明
c-myc蛋白的表达在夏枯草组及联合组较阴性对照
组低,小剂量山慈姑组不能降低 c-myc蛋白,可促
进夏枯草下调c-myc蛋白的表达,夏枯草组和联合
组下调c-myc蛋白的表达与对细胞增殖抑制作用
相一致。有文献报道[15]抑制c-myc基因的表达可以
使肿瘤退化,可能与细胞凋亡有关。本研究发现,小
剂量山慈姑和夏枯草联合作用于SW579细胞后,细
胞呈现较为典型的凋亡现象,且c-myc蛋白表达较
单用夏枯草降低更为明显,提示c-myc基因参与了
夏枯草和山慈姑所介导的细胞凋亡,从而使甲状腺
癌细胞增殖受到抑制。
目前中药抗肿瘤主要是通过诱导肿瘤细胞的凋
亡而发挥作用。小剂量的山慈姑可促进夏枯草的抗
甲状腺癌细胞增殖作用,可能是通过抑制c-myc蛋
白的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡实现的。肿瘤的
发生发展与多种因素有关,且细胞的增殖和凋亡也
受多种因素的共同参与和调控,此过程中是否还存
在其他凋亡基因的激活有待进一步的研究。
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