全 文 ：• 100 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年1月第30卷第1期 CJTCMP , January 2015, Vol . 30, No. 1
广西莪术DNA条形码通用序列的筛选
王娟1，侯艳芳1，白准1，付明磊1，曾建红1，黄凤香1，刁珂2，陈旭1
（1桂林医学院，桂林 541004；2牡丹江肿瘤医院，牡丹江 157000）
摘要：目的：莪术类品种繁多，形态相似，不易鉴别，利用DNA barcoding技术评价目前几个热点的DNA通
用序列对广西莪术鉴别的能力。方法：本研究使用ITS、ITS2、rpoB、rpoC1、matK、psbA-trnH序列的通用引物对
广西莪术进行PCR扩增和测序，通过比较各序列的扩增和测序成功率、种内和种间的变异、barcoding gap，并采取
相似性探索BLAST 1方法评价不同序列的鉴别能力。结果：ITS2序列在所研究的广西莪术中的扩增效率为100%，
其种内种间变异、barcoding gap与其他DNA条形码候选序列相比具有明显的优势，ITS2序列在广西莪术中的鉴定成
功率达到100%，matK、rpoC1和rpoB虽然测序和鉴定成功率都在90%以上，但是其种内及种间差异不明显，ITS虽
然barcoding gap明显，但种内和种间遗传变异重叠比例较大，且测序成功率及鉴定效率不理想，psbA-trnH虽然在
扩增及测序方面不如ITS2，但是其鉴定成功率为100%，有明显的种内及种间差异。结论：ITS2与psbA-trnH序列能
够准确鉴定广西莪术植物，ITS2可以作为广西莪术药用植物的候选DNA条形码序列，而psbA-trnH可作为ITS2的补
充序列。
关键词：DNA条形码；广西莪术；ITS；ITS2；matK；psbA-trnH
基金资助：广西科学研究与技术开发计划项目（No.桂科攻11107010-3-2），桂林市科学研究与技术开发计
划项目（No.20120105-7），广西医药产业人才小高地项目（No.1305）
Screening the universal sequence of DNA barcodes in curcuma kwangsiensis
WANG Juan1, HOU Yan-fang1, BAI Zhun1, FU Ming-lei1, ZENG Jian-hong1,
HUANG Feng-xiang1, DIAO Ke2, CHEN Xu1
( 1Guilin Medical College, Guilin 541004, China; 2Mudanjiang Tumor Hospital, Mudanjiang 157000, China )
Abstract: Objective: To evaluate the identification ability of some current DNA universal sequences in curcuma
kwangsiensis with DNA barcoding technology to solve the problem which is difficult to identify curcuma kwangsiensis because
of its wide varieties and similar characters. Methods: The PCR of curcuma kwangsiensis was amplified and sequenced by the
universal primers of ITS, ITS2, rpoB, rpoC1, matK and psbA-trnB sequence. The successful rate of amplification and sequence
and the variation between intraspecific, interspecific crossing and barcoding gap were compared. The identification ability of
different sequences were evaluated by the BLAST 1 method. Results: The PCR amplification and sequence rate of curcuma
kwangsiensis achieved 100% by the primer of ITS2. There were obvious advantages on the variation between intraspecific
and interspecific crossing and barcoding gap compared to other universal sequences of DNA barcodes. The successful rate of
identification achieved 100%. The successful rate of sequence and identification achieved over 90% by the primer of matK, rpoC1
and rpoB, but the variations between intraspecific and interspecific crossing were not obvious. The barcoding gap of ITS was
obvious, but the overlapping ratio of the variations between intraspecific and interspecific crossing was large and the successful
rates of identification and sequence were low. The successful rates of amplification and sequence by the primer of psbA-trnH
were lower than those by the primer of ITS2, but the successful rate of identification achieved 100% and the variations between
intraspecific and interspecific crossing was obvious. Conclusion: ITS2 and psbA-trnH sequences can precisely identify the
curcuma kwangsiensis. ITS2 may be a potential sequence of DNA barcode for identifying curcuma kwangsiensis, while psbA-
trnH as a complement senquence.
Key words: DNA barcode; Curcuma kwangsiensis; ITS; ITS2; matK; psbA-trnH
Fund assistance: Guangxi Scientific Research and Technology Development Project (No.11107010--3--2), Scientific
Research and Technology Development Project of Guilin (No.20120105--7), Pharmaceutical Industry Talented ‘Small Highland’
Project (No.1305)
·论著·
通讯作者：陈旭，广西桂林环城北二路109号桂林医学院药学院，邮编：541004，电话（传真）：0773-5898018，E-mail：junxuxu@163.com
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广西莪术Curcuma kwangsiensis S. G..Lee et C.
F. Liang是姜科中的一种多年生草本植物，广泛分布
于广西、广东、云南和四川等地，与蓬莪术Curcuma
phaeocaulis Val.和温郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen
et C. Ling是《中华人民共和国药典》收载的3种基原莪
术[1]。《中华人民共和国药典》（2010版）规定上述3种
植物的根状茎为常用中药“莪术”，有行气破血、消积
止痛的功效；其块根为中药的“郁金”，具有活血止痛、
行气解郁、清心凉血、利胆退黄之效。加之莪术类药材
往往在采集后就地加工，加工后药材外形相似，形态
辨别困难，致使该类药材在流通市场上品种混乱现象
普遍存在，药材质量极不稳定，因此，对广西莪术类药
材基原植物的鉴定和限制非常重要，对其物种和资源
进行鉴定研究，促进该科植物的开发和利用具有重要
意义。
DNA条形码技术（DNA barcoding）是2003年由
加拿大动物学家Hebert PDN等[2]首次提出，即利用一
段DNA片段对物种进行鉴定，该技术自问世以来，因
其快速、客观和操作程序化等特点，引起了科学界的
广泛关注，是近年来发展最迅速的学科之一[3]。线粒
体细胞色素C氧化亚基（cytochrome C oxidase，CO I）
基因是被公认为动物界中标准的DNA条形码，对于
植物的DNA barcoding鉴定研究来说，由于植物进化
历程中容易发生杂交及网状进化事件，且同一基因
在不同种群中进化速率也不一样，致使植物条形码
的研究比动物要复杂得多[3]，至今没有找到一条通用
的DNA barcoding序列[4-5]，推荐较多的序列有ITS[4]、
psbA-trnH[5]、ITS2[6]、matK[7]等序列，但这些序列是
否适合每一个具体的植物科或属，尚需进行针对性
的探索研究。在此背景下，本研究选取上述的几个
热点研究序列，比较其对广西莪术的鉴别能力，考察
各候选序列作为该属植物DNA条形码通用序列的适
用性，以期为DNA条形码在广西莪术植物中的应用
提供依据。
材料
实验材料为广西莪术14个莪术品系包含了30份
标本，分别采自桂林医学院植物园及广西玉林、横
县、上司、宾阳、宁山、贵港等地。新鲜叶片经硅胶干
燥保存，原植物经桂林医学院生药学教研室陈旭教
授及曾建红教授鉴定。试验材料信息见表1。
方法
1. DNA提取及PCR扩增 取硅胶干燥的叶子
0.05g，研磨成粉末，采用植物基因组DNA提取试剂
盒（Tiangen Biotech Co., China）提取DNA。实验中
使用的物品均需高压消毒。候选序列ITS、ITS2、
rpoB、matK和psbA-trnH的通用引物，PCR反应条
件、扩增程序参考Chen S L等[6]的研究。扩增产物经
DNA纯化试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）纯化
后，使用ABI 3500测序仪（Applied Biosystems Co.，
USA）测序。
2 . 数 据处 理 及分析方 法 采用CodonCode
Aligner V 2.06（CodonCode Co.，USA）对测序所得的
峰图校对拼接，利用ClustalX V2.0（Higgins D.G.）
进行多序列比对并查错，再使用MEGA 5.0软件计算
K-2-P距离值，并采用Meyer C P等[8]的方法计算种间
和种内平均遗传距离，用SPSS 17.0进行Wilcoxon秩
和检验，用Taxon DNA软件评估“barcoding gap”，采
用相似性搜索法（Blast）方法计算鉴定成功率。
结果
1. PCR的扩增效率及测序成功率 参照李妮等[9]
对实验样本的PCR扩增成功率、测序成功率及序列
有效使用率的判断标准进行统计，见表2。发现30个
样本的除ITS外，其余序列有效使用率都超过了80%。
各序列长度从173-911bp不等，其中ITS2序列最短，为
168-171bp，matK基因最长，为906-911bp，各序列的
GC含量也有不同，ITS2的GC含量最高，达到60.05%，
psbA-trnH和matK则最低，GC含量分别为31.05%和
30.60%。
2. 不同DNA条形码候选序列种内种间差异分
析 对实验获得的广西莪术不同DNA条形码候选序
表1 样品采集信息
样品名称编号 采集地
广西莪术1 桂林
广西莪术2 桂林
广西莪术3 玉林
广西莪术4 玉林
广西莪术5 玉林
广西莪术6 灵山
广西莪术7 宁山
广西莪术8 上司
广西莪术9 上司
广西莪术10 贵港
广西莪术11 宾阳
广西莪术12 横县
广西莪术13 横县南乡镇
广西莪术14 横县陶圩镇
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列的种间变异进行Wilcoxon检验分析。结果表明，序
列变异大小依次是ITS（0.1891±0.0111）、psbA-trnH
（0.0844±0.0068）、ITS2（0.0648±0.0108）、rpoB
（0.0097±0.0018）、matK（0.0022±0.0007）、rpoC1
（0.0095±0.0017)，Wilcoxon秩和检验结果见表3，其
余两两序列的种间差异比较无统计学意义。
4. 广西莪术DNA条形码候选序列鉴定效率评
价 比较不同序列对物种的鉴定能力是评价不同
条形码序列优劣的标准之一。朱英杰等[10]在分析重
楼属DNA条形码时发现BLAST1算法在鉴定的准确
度和计算速度方面优于Nearest Distance算法，认为
BLAST1鉴定更具实用性。因此，选用BLAST1算法来
分析DNA条形码候选序列的鉴定效率，由表1可以看
出，ITS2、matK和psbA-trnH序列的鉴定能力最高，达
表3 6 个候选条形码序列秩和检验
W+ W- 种间变异相关性 n P值 结果
ITS ITS2 W+=552 W-=114 36 0.001 ITS>ITS2
ITS psbA-trnH W+=666 W-=0 36 0.000 ITS> psbA-trnH
ITS matK W+=666 W-=0 36 0.000 ITS> matK
ITS rpoB W+=625 W-=41 36 0.000 ITS> rpoB
ITS rpoC1 W+=666 W-=0 36 0.000 ITS> rpoC1
ITS2 sbA-trnH W+=600 W-=346 45 0.125 ITS2= psbA-trnH
ITS2 matK W+=958 W-=32 45 0.000 ITS2> matK
ITS2 rpoB W+=885 W-=196 55 0.000 ITS2> rpoB
ITS2 rpoC1 W+=607 W-=134 45 0.001 ITS2> rpoC1
matK PSbA-trnH W+=379 W-=524 45 0.365 matK=psbA-trnH
matK rpoB W+=351 W-=279 45 0.555 matK= rpoB
matK rpoC1 W+=351 W-=279 45 0.555 matK = rpoC1
表2 不同 DNA 序列扩增获得的有效序列比例及鉴定效率
序列 扩增效率(%) 测序成功率(%) 序列有效使用率（%） GC含量（%）
鉴定效率（%）
种水平 属水平
matK 93.0 100.0 93.0 30.60 100.00 100.00
ITS 86.0 70.0 60.2 52.30 100.00 0
ITS2 100.0 95.0 95.0 60.05 100.00 100.00
rpoB 90.0 96.3 86.7 37.89 93.33 93.33
rpoC1 90.0 100.0 90.0 39.47 0 0
psbA-trnH 90.0 90.0 81.0 31.05 100.00 100.00
3. 广西莪术不同DNA条形码候选序列barcoding
gap检验 Meyer C P等[8]认为理想的条形码检测到
的种间遗传变异应明显大于种内遗传变异，并在两
者之间存在显著差异，形成一个明显的间隔区，即
barcoding gap。利用Taxon DNA对所选序列进行分
析，并计算 barcoding gap，见图1。ITS种间变异幅度
较大，种内与种间变异有往两边分开的趋势，更有利
于区分物种。matK、rpoB和rpoC1序列种内和种间遗
传变异重叠比例大，无明显的barcoding gap，相比来
说，psbA-trnH和ITS2序列虽然barcoding gap不明显，
但种内和种间遗传变异重叠比例较小，有利于区分
物种。
ITS
 ! LQWUDLQWHU
K-2-P distance
K-2-P distance
ITS2
 !
㌫ࡇLQWUDLQWHU
K-2-P distance
psbA-trnH
 !
LQWUDLQWHU
K-2-P distance
rpoB
 ! LQWUDLQWHU
K-2-P distance
rpoC1
! LQWUDLQWHU
K-2-P distance
matK
图1 广西莪术6个序列种内变异及种间变异的分布图
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到100%。
讨论
1. 广西莪术DNA条形码候选序列的筛选 理
想的DNA条形码序列应具有明显的种间变异和较
小的种内变异，并且应该能够使用单引物对其进行
扩增, 通过双向测序得到高质量的序列[11]。对广西
莪术不同序列分析发现，综合PCR扩增和测序成功
率、barcoding gap和鉴定成功率等指标，ITS2与psbA-
trnH较其他条形码序列具有明显的优势。自行设计
的各候选序列的引物在广西莪术中获得了较好的
PCR扩增效率及测序成功率，ITS2与psbA-trnH测序
成功率均在90%及以上，且鉴定结果达到100%的理
想值。rpoB和matK虽然具有较高的序列获得率和物
种鉴定效率，但是其barcoding gap不明显，rpoC1的物
种鉴定效率很低，ITS虽然具有较大的种间变异，但
其种内变异也大，不利于分类和鉴定，且受到扩增和
测序的限制。
本实验通过对广西莪术叶绿体及核基因组部分
片段进行研究，结果发现，ITS2在广西莪术植物鉴
定方面具有以下特点：ITS2序列长度较短，约200bp
左右，无论在新鲜或降解组织中都较容易扩增和测
序，降低了提取、扩增和测序的难度，这对于DNA条
形码的应用具有非常重要的现实意义。ITS2可去除
两端的5.8S和26S区段，获得完整间隔区序列，使后
续数据处理更准确可靠，这是目前其它条形码不具
备的优势；且ITS2序列具有进化速率快的特点，较高
的变异程度使其具备较强的区分物种能力。Müller T
等[12]认为ITS2序列有足够区分物种的能力。本研究
结果表明，ITS2序列具有较好的PCR扩增效率和测
序成功率，在所考察的候选序列中具有较大的种间
变异和较小的种内变异，同时在样本量较大的情况
下，其物种鉴定成功率达到100%，故在候选序列中
推荐ITS2序列为广西莪术植物首选的DNA条形码。
psbA-trnH片段是进化速率最快的叶绿体间隔区之
一，其两端存在约75bp的保守序列，Kress W J等[4]研
究发现其具备较好的通用性且扩增成功率较高，因
而成为了条形码序列研究中的重点推荐序列。本研
究中发现，非编码区的psbA-trnH序列在广西莪术中
的扩增效率达90%，psbA-trnH序列物种的水平鉴定
成功率达到100%，并且种间、内变异存在也较明显，
虽然其种间、种内变异的差异较ITS2序列小，但可视
为广西莪术潜在的或补充的植物条形码序。
2. DNA条形码技术应用于广西莪术的展望 本
研究从当前植物学界推荐的条5个热点候选序列中，
通过研究发现ITS2与psbA-trnH序列是最适合广西
莪术的DNA条形码序列，为广西莪术类药用植物质
量研究奠定了基础。本研究为DNA条形码技术在广
西莪术药用植物中的应用进行了新的探索，也为该
属植物亲缘关系及质量鉴定的研究提供了新的方法
和思路。由于样条件和采集样品数量的限制，本研究
中所涉及的物种仅分布在10个采集点，有些物种缺
乏重复个体，纳入分析的属尚不足，数据偏少，研究
还有待在具体的属进行进一步深入。
参 考 文 献
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Coding trnH-psbA Spacer Region.PLOS ONE,2007,6(508):1-10
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