全 文 ：收稿日期:2011-10-09; 修订日期:2011-12-25
基金项目:江苏省自然科学基金(No． BK2002201)
作者简介:刘 旭(1975-) ，男(汉族) ，重庆人，现为南京中医药大学在读
博士研究生，主要从事中医药抗癌的基础与应用研究工作．
* 通讯作者简介:章永红(1951-) ，男(汉族) ，江苏如东人，现任江苏省中
医院主任医师、教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事中医药抗癌的
基础与应用研究工作．
虎眼万年青总皂苷对人乳腺癌
MDA － MB － 231 细胞凋亡的影响及其机制
刘 旭，章永红*
(南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029)
摘要:目的 探讨虎眼万年青总皂苷(Ornithogalum caudatum AIT saponins)诱导人乳腺癌 MDA － MB － 231 细胞的凋亡的
机制，为开发应用于治疗乳腺癌的药物提供实验依据。方法 用 MTT 比色法检测虎眼万年青总皂苷对人乳腺癌 MDA －
MB － 231 细胞增殖的抑制作用;流式细胞术分析细胞凋亡;Western Blotting法检测细胞凋亡相关蛋白 Bcl － 2、Bax与 Bad
表达的变化。结果 虎眼万年青总皂苷对人乳腺癌 MDA － MB － 231 细胞生长有明显抑制作用，并呈剂量、时间依赖性;能
诱导人乳腺癌 MDA － MB － 231 细胞发生凋亡，且凋亡率呈浓度依赖性;能下调 Bcl － 2 蛋白的表达，升高 Bax /Bcl － 2 的比
值，其高剂量组具有显著统计学差异(P ＜ 0． 01) ，能上调 Bad 蛋白的表达，其低、中、高剂量组具有显著统计学差异(P ＜
0． 01)。结论 虎眼万年青总皂苷可抑制乳腺癌 MDA － MB － 231 细胞增殖，并可诱导细胞凋亡，其机制可能与升高 Bax /
Bcl － 2 的比值，上调 Bad蛋白的表达相关。
关键词:虎眼万年青; 乳腺癌; 凋亡; MDA － MB － 231 细胞
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 06． 030
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)06-1388-03
Effect of Ornithogalum Caudatum AIT Saponins on Apoptosis of MDA －MB －231 Breast
Cancer Cells and Its Mechanism
LIU Xu，ZHANG Yong-hong*
(First Clinic Hospital，Nanjing University of TCM，Nanjing 210029，China)
Abstract:Objective To investigate the mechanism of Ornithogalum caudatum AIT saponins on apoptosis of MDA － MB － 231
breast cancer cells and to provide the experimental basis for research and development of breast cancer drugs．Methods MTT as-
say was used to measure the anti － proliferative effect of Ornithogalum caudatum AIT saponins． The cell apoptosis rates were ana-
lyzed by flow cytometry． The protein expression of Bcl － 2 and Bax and Bad were examined by western blotting． Results Ornithoga-
lum caudatum AIT saponins inhibited the proliferation of MDA － MB － 231 breast cells in dose and time dependent manners，and
induced the apoptosis of the tumor cells in a dose dependent manner． Induction of apoptosis of the tumor cells line by Ornithogalum
caudatum AIT saponins were involved in reduction of Bcl － 2 protein expression level and increasing of Bax /Bcl － 2 protein ratio．
The medium and high dose groups showed significant difference(P ＜ 0． 01)． And also involved in increasing of Bad protein expres-
sion level． The low or medium or high dose group showed significant difference(P ＜ 0． 01)． Conclusion Ornithogalum caudatum
AIT saponins can not only inhibit proliferation but also induce apoptosis of MDA － MB － 231 breast cells． The possible mechanism
is related with increasing of Bax /Bcl － 2 protein ratio and increasing of Bad protein expression level．
Key words:Ornithogalum caudatum; Breast cancer; Apoptosis; MDA － MB － 231
虎眼万年青为百合科虎眼万年青属常绿多年生草本植物的
干燥全草，又名胡连万年青、海葱等，原产于非洲南部，我国各地
也广泛栽培，具有清热解毒、消坚散结等功能，民间全草入药，常
用于抗炎、抗肿瘤等。虎眼万年青包括多种化学成分，如皂苷类、
生物碱类、黄酮类、三萜类等，人们近年来发现含甾体皂苷成分的
动植物药有相当的抗肿瘤疗效［1，2］。本实验旨在研究虎眼万年
青总皂苷对人乳腺癌 MDA － MB － 231 细胞增殖抑制与凋亡作
用，以探讨其抗癌机制，为虎眼万年青进一步抗癌研究、开发与利
用提供必要的实验依据。
1 材料与仪器
1． 1 药物与细胞系 虎眼万年青总皂苷由中国药科大学现代中
药教育部重点实验室提供，以少量二甲基亚砜(DMSO)溶解，配
成 5mg /ml母液(储备液)、置 － 20℃冰箱保存，临时稀释至所需
浓度(DMSO 终浓度 ＜ 0． 1 %)。注射用顺铂(冻干型) ，系齐鲁制
药有限公司生产(批号:0060322DC)。
人类乳腺癌细胞株 MDA － MB － 231，购于中国科学院上海
生命科学研究院细胞资源中心。
1． 2 试剂与仪器 胎牛血清、胰蛋白酶(trypsin)、Leibovitz＇s L －
15 培养基、四甲基偶氮唑盐(MTT) (GiBgo 公司) ;二甲基亚砜
(DMSO) (Sigma公司) ;Annexin V － FITC 细胞凋亡检测试剂盒
(南京凯基生物科技发展有限公司) ;彩色预染蛋白分子量标准:
Fermentas公司;小鼠抗 β － actin抗体、兔抗 Bax抗体、兔抗 Bcl －
2 抗体、兔抗 Bad克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗
(Bioworlde 公司) ;RIPA 细胞裂解液:碧云天生物技术研究所。
二氧化碳培养箱 3111 型(美国 Thermo公司) ;台式高速冷冻离心
机 5810R型(德国 Eppendorf公司) ;凝胶成像仪(Thermo 公司) ;
流式细胞仪(美国 FACS Calibur Becton － Dickinson公司)。
2 方法
2． 1 细胞培养 人乳腺癌 MDA － MB － 231 细胞株在含 10%胎牛
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血清、100 U /ml青霉素、100 μg /ml链霉素的 Leibovitz＇s L － 15 培
养基中 37℃、无二氧化碳环境下培养;倒置显微镜下每天观察培
养瓶中细胞生长的情况，1 ～ 2 d换一次培养液。
2． 2 实验分组 药物组为 12． 5，25，50，100，200，400 μg /ml 的虎
眼万年青总皂苷，设不含细胞只加入全培(含 10%胎牛血清的
Leibovitz＇s L － 15 培养基)的调零对照组，含有细胞与全培的正常
对照组，DMSO组，阳性对照组(顺铂 50 μg /ml)。
2． 3 MTT 法测定虎眼万年青总皂苷对乳腺癌 MDA － MB － 231
细胞增殖的抑制效应 取 MDA － MB － 231 细胞株对数生长期细
胞 2 × 104 接种于 96 孔培养板，100 μl /孔，培养过夜待细胞贴壁
后，吸去培养基，按实验分组给药，每个浓度设 5 个复孔，每孔反
应体系体积为 100 μl，培养 24，48，72 h 后，常规 MTT 显色，于酶
联免疫检测仪 490 nm波长处，测定各孔吸光度 OD值，按以下公
式计算抑制率:肿瘤细胞生长抑制率(%)= (1 － OD 均值实验组 /
OD均值阴性对照组)× 100%，以改良寇氏法计算 IC50。
2． 4 AnnexinV － FITC染色流式细胞仪检测虎眼万年青总皂苷
对 MDA － MB － 231 细胞的诱导凋亡作用 于 48 h 后分别收集 4
个浓度及正常对照组细胞，用 0． 25%胰酶(不含 EDTA)消化贴壁
生长的 MDA － MB － 231 细胞;用 1 ml 完全培养基终止消化，吹
打均匀，吸入离心管，离心 2 000 r /min，5 min，弃上清液;加 5 ml
PBS 吹打均匀;再离心 2 000 r /min，5 min;弃上清液，加 1 ml PBS
吹打均匀，吸入 1． 5 ml EP管;离心，4℃，2 000 r /min，5 min;加入
500μl的 Binding Buffer 悬浮细胞;加入 5 μl AnnexinV － FITC 混
匀后，加入 5 μl PropidiumIodide，混匀;室温、避光、反应 5 ～ 15
min，上流式细胞仪检测。
2． 5 Western Blotting法检测各药物组作用人乳腺癌 MDA － MB
－ 231 细胞 48 h 后 Bcl － 2、Bax、Bad 蛋白的表达情况 常规收集
经各药物组(正常对照组、25，100，400 μg /ml)作用 48 h 后的
MDA － MB － 231 细胞，用 RIPA 细胞裂解液裂解细胞，离心收集
上清，提取细胞总蛋白;BCA试剂盒测定蛋白浓度。根据蛋白的
定量，上样量为每泳道 30 μg。常规质量分数 10%聚丙烯酰胺凝
胶电泳、转膜、封闭，加入一抗(1 ∶ 400) ，4℃孵育过夜。用 1 ×
TBST漂洗 3 次，加入二抗(1 ∶ 5 000) ，室温孵育 1 h。1 × TBST
漂洗 3 次;将 PVDF膜置于保鲜膜上，取适量 ECL 试剂盒中等体
积的 A液和 B液混合，混匀后加在膜的表面，反应 5 min后，吸去
多余液体，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。
2． 6 统计学分析 采用 SPSS13． 0 统计软件包对数据进行统计分
析，计量资料以 珋x ± s表示，多样本均数的比较采用单因素方差分
析;两两比较，方差齐性，采用两组独立样本的 t 检验，方差不齐，
采用秩和检验。
3 结果
3． 1 MTT法检测虎眼万年青总皂苷对 MDA － MB － 231 细胞增
殖的抑制结果 同一时间段随着用药浓度的逐渐增高，以及同一
浓度，随着用药时间的逐渐延长，虎眼万年青总皂苷组对人乳腺
癌 MDA － MB － 231 细胞增殖的抑制作用基本呈递增态势。在剂
量为 400 μg /ml，用药时间为 72 h 时抑制率则高达 92． 8%;各总
皂苷组与阴性对照组比较差异除剂量 50 μg /ml，时间 24 h 组具
有显著性统计学意义外(P ＜ 0． 05) ，其余大部分剂量组别较阴性
对照组差异均具有非常显著的统计学意义(P ＜ 0． 01)。虎眼万
年青总皂苷 24，48，72 h对乳腺癌 MDA － MB － 231 细胞的 IC50分
别为 180． 72，76． 74，56． 23 μg /ml。由此可见虎眼万年青总皂苷
组对乳腺 MDA － MB － 231 细胞增殖的抑制作用具有较明显剂量
与时间依赖关系。结果见表 1 。
表 1 各药物组对乳腺癌 MDA － MB －231 细胞增殖的抑制作用(珋x ± s)
组别 剂量 C /μg·ml －1
24h
OD值 抑制率(%)
48h
OD值 抑制率(%)
72h
OD值 抑制率(%)
阴性对照 － 0． 066 ± 0． 009 － 0． 118 ± 0． 014〗 － 0． 235 ± 0． 020 －
溶媒 (0． 1% DMSO) 0． 065 ± 0． 007 1． 5 0． 122 ± 0． 012 ﹣ 3 0． 228 ± 0． 011 3
总皂苷 12． 5 0． 057 ± 0． 004 9． 1 0． 105 ± 0． 006 11． 1 0． 178 ± 0． 022 24． 3
25 0． 061 ± 0． 012 13． 6 0． 09 ± 0． 005△ 23． 7 0． 16 ± 0． 012△ 32
50 0． 052 ± 0． 006# 21． 2 0． 08 ± 0． 005△ 32． 2 0． 142 ± 0． 004△ 39． 6
100 0． 046 ± 0． 005△ 30． 4 0． 044 ± 0． 004△ 62． 8 0． 077 ± 0． 014△ 67． 3
200 0． 038 ± 0． 004△ 42． 4 0． 037 ± 0． 004△ 68． 7 0． 066 ± 0． 005△ 72
400 0． 029 ± 0． 004△ 56． 1 0． 013 ± 0． 002△ 89 0． 017 ± 0． 005△ 92． 8
DDP 50 0． 032 ± 0． 009△ 51． 5 0． 036 ± 0． 006△ 69． 5 0． 049 ± 0． 009△ 79． 1
与阴性对照组比较，#P ＜ 0． 05;与阴性对照组比较，△P ＜ 0． 01;n = 5
3． 2 AnnexinV － FITC 染色流式细胞仪检测细胞凋亡结果 人乳
腺 MDA － MB － 231 细胞经过不同剂量的虎眼万年青总皂苷作用
48 h后，与正常对照组比较，各总皂苷组均出现不同程度的凋亡，
细胞的总凋亡率随着剂量的增加而增加，与正常对照组差异有显
著的统计学意义(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ;各皂苷组两两比较除 25
μg /ml组与 50 μg /ml组无统计学意义外(P ＞ 0． 05) ，其余组间差
异均有显著的统计学意义(P ＜0． 05或 P ＜0． 01)。可见，细胞的凋
亡与作用剂量呈正相关，具有较明显的量效关系。结果见图 1。
与正常对照组比较，#P ＜ 0． 05;与正常对照组比较，△P ＜ 0． 01;
与 25μg /ml组比较，△P ＜ 0． 01;与 50 μg /ml组比较，▲P ＜ 0． 05;
与 50 μg /ml组比较，☆P ＜ 0． 01;与 100 μg /ml组比较，★P ＜ 0． 05
图 1 虎眼万年青总皂苷对人乳腺癌 MDA － MB －231 细胞凋亡的影响
3． 3 Western Blotting 法检测 Bax、Bcl － 2、Bad 蛋白的表达情况
与正常对照组比较，随着虎眼万年青总皂苷浓度的增加，25 μg /
ml 与 400 μg /ml组作用于人乳腺MDA － MB － 231 细胞 48 h后上
调 Bax蛋白的表达不明显，100 μg /ml 组对 Bax 蛋白的表达略有
上调，均无统计学意义(P ＞ 0． 05)。而 3 个总皂苷剂量组对 Bcl
－ 2 蛋白的表达均有下调趋势，其中 100 μg /ml 与 400 μg /ml 组
经统计学处理有明显显著性差异(P ＜ 0． 01)。Bax /Bcl － 2 的比
值随用药浓度的增加也逐渐升高，与正常对照组比较，100 μg /ml
与 400 μg /ml组有显著统计学差异(P ＜ 0． 01)。Bad蛋白的表达
随虎眼万年青总皂苷浓度的增加而增强，低、中、高 3 个剂量组的
bad蛋白表达水平与正常对照组比较具有明显统计学差异(P ＜
0． 01)。结果见表 2 及图 2 ～ 3。
4 讨论
虎眼万年青具有良好的抗肿瘤疗效，其中 OSW －1 作为一种
从虎眼万年青中分离到的皂苷类化合物，人们近年来在其结构和
活性方面的研究比较多［3 ～ 5］。但由于目前 OSW － 1 提取、合成工
艺复杂且较昂贵，给广泛的实验、应用研究工作带来了一定的困
难。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 6 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 6 期
表 2 各剂量药物组对 MDA － MB －231 细胞 Bax、
Bcl － 2 与 Bad蛋白表达的影响(珋x ± s)
组别 Bad Bax Bcl － 2 Bax /Bcl － 2
正常对照 0． 09 ± 0． 01 0． 39 ± 0． 05 0． 42 ± 0． 01 0． 93 ± 0． 10
DDP 0． 30 ± 0． 02# 0． 48 ± 0． 06 0． 12 ± 0． 02# 3． 97 ± 0． 35#
25μg /ml 0． 24 ± 0． 02# 0． 4 ± 0． 01 0． 34 ± 0． 06 1． 19 ± 0． 19
100μg /ml组 0． 44 ± 0． 09#△ 0． 44 ± 0． 06 0． 25 ± 0． 02# 1． 73 ± 0． 19#△
400μg /ml组 0． 52 ± 0． 12#△ 0． 38 ± 0． 06 0． 14 ± 0． 01#▲●2． 27 ± 0． 07#▲●
与正常对照组比较，# P ＜ 0． 01;与 25 μg /ml 组比较，▲P ＜ 0． 01;与 100 μg /ml
组比较，●P ＜0． 01;与 25 μg /ml组比较，△P ＜0． 05
图 2 各剂量药物组 图 3 各剂量药物组
对 MDA － MB －231 细胞 Bax 对 MDA － MB －231 细胞
与 Bcl － 2 蛋白表达的影响 Bad蛋白表达的影响
本实验拟用虎眼万年青提取的总皂苷为样本，并选用具有高
运动、高侵袭性且对多种化疗药物耐药的人乳腺癌 MDA － MB －
231 细胞，来观察虎眼万年青总皂苷的体外抗癌作用效果。本研
究发现:浓度≥25μg /ml的虎眼万年青总皂苷能较显著抑制人乳
腺癌 MDA － MB － 231 细胞的增殖，并且随着浓度的增加和作用
时间的延长，抑制增殖的作用逐渐增强，表明虎眼万年青总皂苷
对乳腺癌 MDA － MB － 231 细胞具有较强的杀伤作用。流式结果
显示:与正常对照组比较，随着虎眼万年青总皂苷浓度的增加，细
胞凋亡率逐渐增加，呈现较明显的剂量依赖性。细胞凋亡是受多
基因调控的一种程序性死亡。Bcl － 2 基因及其家族成员构成的
复杂作用网络共同参与细胞凋亡的调控，成为肿瘤治疗的靶标之
一［6］。Bcl － 2 家族分为促凋亡(如 Bax、Bad、Bak、Bcl － s)和抑凋
亡(如 Bcl － 2、Bcl － xl、Bcl － w)两种基因群，Bax 和 Bcl － 2 基因
具有 40%的同源性［7，8］。二者在细胞凋亡过程中起着重要作用，
现在普遍认为细胞对凋亡刺激因素的敏感性，关键取决于细胞内
Bcl － 2 /Bax的比例［9，10］。当 Bax /Bcl － 2 比例较高时，细胞趋向
凋亡，反之则细胞凋亡下降。新近发现的 Bcl － 2 家族基因 Bad
是与 Bcl － xl和 Bcl － 2 相关的细胞死亡促进因子，是调控细胞凋
亡的重要成员，主要通过线粒体途径参与细胞凋亡，在肿瘤发生
和发展等方面发挥调控细胞凋亡的作用［11］。研究发现 Bad 和
Bcl － 2 这对正负调节基因也可形成异源二聚体，Bad 能减弱 Bcl
－ 2 抑制细胞凋亡的功能从而发挥对细胞的促凋亡作用［12］。而
在细胞凋亡的过程中 Bcl － 2 基因家族表达的多种蛋白都发挥着
不同的作用，其促凋亡与抑凋亡作用可以相互制约，而从 Bcl － 2
基因家族中 Bcl － 2、Bax、Bad等基因的综合表达情况来评价肿瘤
的发生、发展及预后将会更有意义［13］。本研究显示，与阴性对照
组比较，虎眼万年青总皂苷低中高三个剂量组 Bax蛋白的表达上
调不明显，但 Bcl － 2 蛋白表达下调较明显，其中、高剂量组具有
显著统计学差异;低、中、高剂量组的 Bax /Bcl － 2 比值均有不同
程度升高，其中高剂量组具有显著统计学差异。Bad蛋白的表达
是随着总皂苷浓度的增加而增强，低、中、高剂量组均具有显著统
计学差异。本实验研究表明虎眼万年青总皂苷具有诱导人乳腺
癌 MDA － MB － 231 细胞凋亡的趋势，其凋亡机制可能与虎眼万
年青总皂苷下调 Bcl － 2 蛋白的表达，升高 Bax /Bcl － 2 的比值以
及上调 Bad蛋白的表达有关。上述研究为虎眼万年青临床抗肿
瘤研究提供了一定的实验依据，表明虎眼万年青在乳腺癌的治疗
中具有较为广阔的前景。但在未来研究上仍需进一步明确虎眼
万年青抑制乳腺癌细胞生长并诱导凋亡的确切作用机制。同时，
虎眼万年青对正常乳腺细胞及人体其他正常细胞作用效果的毒
性实验、动物实验及体内临床实验还有待验证。
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