全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(2): 192−197 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A112)
作者简介: 王心宇(1965– ), 男, 博士, 副教授, 主要从事植物分子生物学教学及科研工作。E-mail: xywang@njau.edu.cn
* 通讯作者(Corresponding author): 戚存扣, 研究员。E-mail: qck@jaas.ac.cn
Received(收稿日期): 2007-06-11; Accepted(接受日期): 2007-09-20.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00192
油菜 cDNA表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定
王心宇 1,2 杨恩东 2 戚存扣 1,* 陈 松 1 张洁夫 1 杨 清 2
(1江苏省农业科学院, 江苏南京 210014; 2南京农业大学生命科学学院, 江苏南京 210095)
摘 要: 核盘菌 [Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary] 是引起油菜菌核病的病原真菌。核盘菌侵染植物细胞早期,
可分泌一些细胞壁降解酶, 如不同类型的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)。这些酶对病菌在植物组织上的
定植起关键作用, 同时酶活性的高低也决定病原菌的毒性或致病性。PG 可以激活细胞的防卫反应而与其酶活性无
关。为了解 PG的信号转导途径, 利用 RT-PCR方法克隆了核盘菌的 PG基因, 将 PG的编码区与酵母 GAL4的 DNA
结合功能区融合, 构建到酵母诱饵蛋白表达载体 PGBKT7 中; 然后在酵母中构建了油菜 cDNA 表达文库。通过酵母
双杂交方法在油菜 cDNA表达文库中对与 PG互作的蛋白进行了筛选, 分离到一个与 PG互作的蛋白, 测序及 BLAST
分析表明该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域, 称为 C2 结构域(C2-domain), 推测该蛋白是一种钙依赖的膜结合
蛋白。该蛋白与拟南芥中一个含 C2结构域功能未知蛋白的氨基酸同源性高达 80.24%。利用半定量 PCR分析了核盘
菌诱导后该基因在油菜花、茎、叶中的表达, 结果表明该基因在叶片中表达量最高。克隆到的 C2蛋白与其他物种中
的 C2蛋白比较发现, 与钙离子结合的天冬氨酸残基很保守。
关键词: 核盘菌; 多聚半乳糖醛酸酶; C2结构域
Construction of cDNA Expression Library of Oilseed Rape and Screen-
ing and Identification of Interaction Partner of PG, A Virulence Factor
from Sclerotinia sclerotiorum
WANG Xin-Yu1,2, YANG En-Dong2, QI Cun-Kou1,*, CHEN Song1, ZHANG Jie-Fu1, and YANG Qing2
(1 Academy of Jiangsu Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu; 2 College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,
Jiangsu, China)
Abstract: Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary is the fungus that causes stem rot disease in oilseed rape. To overcome plant
cell wall, during early pathogenesis, the fungus secretes several types of cell wall-degrading enzymes such as polygalacturonases
(PGs). The activity of these enzymes is crucial for the colonization of plant tissues, and these enzymes can be determinants of
pathogenicity or virulence. PG can activate defense reactions in plants, having no relation to the enzyme activity. In order to un-
derstand PG signaling pathway, PG gene was cloned from Sclerotinia sclerotiorum by RT-PCR, the encoding region of PG was
fused to the yeast GAL4 DNA-binding domain in yeast expression vector PGBKT7 and an oilseed rape cDNA expression library
was constructed in yeast. PG-interacting proteins were screened in the library with PG as bait by yeast two-hybrid assay. An in-
teracting protein was isolated, sequencing and BLAST analysis revealed that the protein contains a C2-domain and was predicted
to be a Ca2+ binding domain. The protein shares 80.24% identity in amino acids with a C2-domain protein in Arabidopsis with
unknown function. The expression levels of the C2-domain protein in floral, leaf and stem organs of oilseed rape were investi-
gated by semi-quantitative RT-PCR, the results showed that the C2-domain protein was highly expressed in leaves after induced
by Sclerotinia sclerotiorum. Comparison in C2-domain proteins between oilseed rape and other species suggested that aspartatic
acid residues involving in Ca2+ binding were conserved.
Keywords: Sclerotinia sclerotiorum; Polygalacturonase (PG); C2-domain
第 2期 王心宇等: 油菜 cDNA表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定 193


菌核病是由核盘菌 [Sclerotinia sclerotiorum
(Lib.) de Bary] 引起的一种严重的真菌性病害, 该
病流行范围广, 遍及整个亚热带及温带地区。该病
原菌寄主范围也很广泛, 能感染 400 多种不同的物
种, 在农作物中主要浸染双子叶作物如豆类和油料
作物[1]。大量研究证明, 油菜中核盘菌的抗源十分稀
少, 不同品系间只是对菌核病的耐受性有差异, 而
未发现高抗品种 [2-3]。核盘菌属于腐生性病菌
(necrotrophic pathogen), 感染寄主产生过敏性坏死
反应(hypersensitive response, HR)或细胞程序性死亡
(programmed cell death, PCD)不仅不利于寄主抵抗
这种病菌, 反而有利于病菌的进一步侵染[4-5]。这种
特性给菌核病的防治带来很大困难。
一些研究表明真菌分泌的草酸是核盘菌主要的
致病因子。草酸可以酸化病菌感染部位, 与钙离子
结合形成草酸钙沉淀[6]。近年来研究表明核盘菌分
泌的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturonase, PG)
在病菌感染植物过程中起非常重要作用。草酸可以
降低环境 pH, 为提高 PG 的酶活性及降解植物细胞
壁创造有利条件。同时 PG 还具有致病因子的特性,
如 PG 可诱导大豆细胞发生程序性死亡, 该过程是
一个依赖于 Ca2+的信号传递过程[7]。核盘菌可分泌不
同类型的 PG, 包括内切 PG(endo-PGs)和外切
PG(exo-PGs); 同一个 PG 基因的表达产物还能形成
不同 PG 异构体, 这种现象可能是由于翻译后的修
饰(posttranslational, glycosylation)和(或)分泌后的修
饰(post–secretional, proteolytic)过程所致; 不同 PG
基因的的表达量差异很大, 核盘菌在感染寄主过程
中表达量最高的一个 PG 基因称为 sspg1d, 它与核
盘菌的初始侵染以及致病性关系最为密切[8-9]。本研
究克隆了 sspg1d 基因, 并将该基因克隆到酵母表达
载体 PGBKT7 中, 构建成诱饵蛋白(Bait)表达载体,
通过酵母双杂交方法, 在核盘菌诱导油菜后构建的
cDNA 文库中, 筛选到一个含有钙离子结合功能区
(即 C2 结构域)的基因, 暂命名为 IPG-1。利用半定
量 PCR对该基因在不同器官中的表达水平做了初步
研究。
1 材料与方法
1.1 材料
构建油菜 cDNA 文库所用的材料为对菌核病具
有一定抗耐性的油菜品系宁 RS-1, 由江苏省农科院
经济作物研究所国家油菜工程分中心选育及提供。
1.2 方法
1.2.1 核盘菌培养及 RNA 提取 核盘菌菌株
是从南京市油菜田中采集、培养和保存, 由江苏省
农科院植保所提供。菌丝先接种于 PSA(potato su-
crose agar, 含 potato extract 200 g L−1, sucrose 20 g
L−1, agar 20 g L−1)固体培养基于 20℃暗培养一周, 然
后用手术刀将菌丝生长形成的平面切成 0.5 cm的小
方块, 接种于 PS(potato sucrose, 含 200 g L−1 potato
extract, 20 g L−1, sucrose)液体培养基振荡培养 5 d。
用纱布收集菌丝后置−70℃保存备用。菌丝加液氮
研磨 , 用 Trizol(购自 Invitrogen 公司 )方法提取
RNA。
1.2.2 核盘菌中 PG 基因克隆及诱饵蛋白表达载
体构建 对 NCBI 数据库中收集的 PG 基因
L29040、L29041、L12023、AF501307、AF501308、
AY312510 进行序列对比分析, 根据 ORF 两端非常
保守的区段, 设计一对引物: PG-F: 5-ccatactgtctggtac
attcac-3和 PG-R: 5-tccagtgcttgaaagtagccga-3, 通过
RT-PCR 将 PG 基因克隆到 T-easy vector(购自
Promega公司)。根据 PG基因 ORF两端序列设计一
对 引 物 5-ctctCATATGgttcacattctttcctcggcc-3 和
5-ctctCTGCAGttaacacttgacaccagatgg-3, 分 别 引 入
Nde I和 Pst I酶切位点, 以含 PG基因的 T-easy载体
作模板, PCR扩增后用 Nde I和 Pst I酶切, 即可将
PG 基因的 ORF 克隆到酵母表达载体 PGBKT7 的
Nde I 和 Pst I 位点之间, 构建成诱饵蛋白表达载体
pBD/PG。测序由上海 Invitrogen公司完成。
1.2.3 cDNA 表达文库构建和双杂交筛选 将
旺盛生长的菌丝切成 5 mm 方块接种油菜茎叶, 用
封口模保湿。 茎叶发病后取病斑周围健康组织用于
RNA提取。用 Trizol reagent (Invitrogen, USA)提取
RNA。油菜 cDNA 文库构建和双杂交筛选采用
Clontech 公司的试剂盒 MatchmakerTM Library Con-
struction and Screening Kit的方法进行。
1.2.4 半定量 RT-PCR 内标为真核生物翻译延
伸因子(elongation factor 1-alpha, EF-1α), 引物序列
为 5-agaccaccaagtactactgcac-3 (forward)和 5-ccacca
atcttgtacacatcc-3 (reverse)。
2 结果与分析
2.1 PG基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建
加拿大学者 Li等[8]从核盘菌 cDNA文库中分离
到 6个 PG基因, 其中 4个为 endo-PGs, 均为含 ORF
194 作 物 学 报 第 34卷

的全长基因。另外 2个 exo-PGs为非全长基因序列。
这 6个基因均在 NCBI中注册。本研究比对了其中 4
个全长 endo-PG基因(编号为 AF501307, AY496277,
AF501308, AY312510)以及其他 2个 PG基因的DNA
序列 (编号为 L29040, L29041), 发现这些基因的
ORF两侧序列非常保守, 所以根据这一特征设计了

图 1 本研究克隆到的 PG基因与Li等克隆的 PG基因(sspg1d) N
端氨基酸序列比对
Fig. 1 Comparison of deduced N-terminal amino acid sequences
of PG cloned in the present study with sspg1d cloned by Li et al.

图 2 通过同源重组构建 cDNA与酵母 GAL4转录激活功能域(AD)融合的表达文库
Fig. 2 Constructing AD fusion libraries by recombination-mediated cloning in yeast
用 PCR方法在 cDNA两端分别引入 BD SMART III和 CDS III接头, 将含有接头的 cDNA及 Sma I线性化的酵母表达载体 pGADT7-Rec
或 pGADT7-Rec2共转化酵母细胞后, 在酵母细胞修复酶的作用下, cDNA即可与表达载体发生同源重组形成环状质粒。pGADT7-Rec
用于构建双杂交文库, pGADT7-Rec2用于构建单杂交文库, 这两个载体上均含酵母 GAL4转录激活功能域(AD)。
To clone cDNA into pGADT7-Rec or pGADT7-Rec2, cotransform yeast with ds cDNA (generated with our modified BD SMART procedure)
and either pGADT7-Rec (two-hybrid screen) or pGADT7-Rec[2] (one-hybrid screen). Yeast repair enzymes will restore the Sma I-linearized
plasmid to its circular form by recombining sequences at the ends of the cDNA with homologous sequences at the ends of pGADT7-Rec[2].
The outcome is a fully functional GAL4 AD/cDNA expression vector.

一对引物, 经过 RT-PCR及克隆、测序和序列对比证
明克隆到了其中一个 PG全长基因, 共编码 380个氨
基酸。经序列比对发现, 该基因与 Li 等克隆的 PG
基因 sspg1d(NCBI 编号为 AF501307)的氨基酸序列
几乎相同, 仅在 N端第 3位氨基酸存在差异(图 1)。
这种变化可能是中国南京收集的核盘菌与加拿大收
集的核盘菌发生变异所致。极高的序列相似性证明
我们克隆到了 sspg1d基因。Li等证明 sspg1d在核盘
菌侵染寄主时表达量最高, 与病菌致病性关系最密
切。本研究用克隆到的这个基因作为诱饵蛋白筛选
寄主中的互作因子来研究核盘菌−油菜互作过程中
的有关协作蛋白。用 1.2.4方法构建成诱饵蛋白表达
载体 pBD/PG。
2.2 cDNA表达文库构建
用核盘菌接种油菜茎、叶部位, 发病后取病斑
周围健康组织, 提取 RNA并逆转录为第一链 cDNA,
通过 RT-PCR 扩增产生双链 cDNA(ds cDNA), 同时
在其两端引入可与线性载体 pGADT7-Rec 发生同源
重组的序列 BD SMART III和 CDS III(如图 2所示),
用 ds cDNA及线性载体 pGADT7-Rec共转化酵母菌
株 AH109后, ds cDNA即可在酵母细胞内与线性载
体 pGADT7-Rec 发生同源重组, 进而形成环状包含
cDNA 的 pGADT7 质粒 , 这样便在酵母中构建好
cDNA表达文库。经统计, 文库容量为 1.3×106, 符合
试剂盒对库容量的要求, 足以满足筛选文库的需要。















图 3 以 PG为诱饵在文库中筛选到的阳性克隆
Fig. 3 Interaction between PG and C2-domain protein re-
vealed by yeast two-hybrid assay
该阳性克隆与 PG的互作在 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp并涂有
X-α-Gal的四缺培养基上得到进一步证实。测序及 BLAST分析
表明该阳性克隆为含 C2结构域蛋白。箭头所示两个区域为两次
重复试验, 含 pBD/PG及 pAD/C2基因质粒的酵母细胞可以在涂
有 X-α-Gal的 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基上生长并变蓝。
Two repeat experiments were performed as arrow showed. The
yeast diploid cells produced by mating Y187 (containing pBD/PG
plasmid) and AH109 (containing C2-domain protein) can grown on
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp medium and turn blue when spreading
X-α-Gal on plates.
第 2期 王心宇等: 油菜 cDNA表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定 195


2.3 文库筛选和阳性克隆的鉴定
将 PGBKT7-PG转化酵母菌株Y187, cDNA文库
已转化到酵母 AH109 菌株中。利用酵母菌株 Y187
与 AH109交配(Mating)方法筛选油菜 cDNA文库。
第一轮筛选在三缺培养基 SD/-His/-Leu/-Trp中进行,
筛选到的阳性克隆在四缺培养基 SD/-Ade/-His/-Leu/
-Trp 并涂有 X-α-Gal 上划线进一步确认是否为真正
的阳性克隆。经过上述严格筛选, 最后仅筛选到一
个阳性克隆, 如图 3 所示。从该阳性克隆中提取质
粒, 然后转化大肠杆菌 DH10B, 经筛选、测序获得
了一个基因片段, 经 BLAST分析, 该片段包含一个
保守的结构域, 被称为“C2结构域”(C2 domain)。
通过 RACE 方法, 我们成功克隆了该基因的全长,
共编码 168 个氨基酸 , 将该基因定名为 IPG-1。
BLAST 分析表明该蛋白 N 端 1~89 氨基酸为 C2 结
构域, C端 90~168氨基酸可能主要与蛋白-蛋白互作
有关。IPG-1与拟南芥中一个含 C2结构域功能未知
蛋白的氨基酸同源性高达 80.24%(图 4)。

图 4 推导的 IPG-1氨基酸序列与一个功能未知的拟南芥 C2蛋白(NP198590)同源性比较
Fig. 4 Alignment of deduced amino acid sequences of IPG-1 and an Arabidopsis C2-domain gene (NP198590) with unknown function

2.4 IPG-1在不同器官中的表达分析
利用半定量 RT-PCR分析 IPG-1基因在油菜茎、
叶、花(蕾)中的表达如图 5 所示, 以翻译延伸因子
EF-1α 作为内标, 发现在核盘菌诱导油菜茎和叶后,
叶片中 IPG-1的表达量最高, 其次为茎, 花(蕾)中表
达量最低。

图 5 用半定量 PCR分析核盘菌诱导油菜后 IPG-1在茎、叶、
花中的表达
Fig. 5 Expression of IPG-1 in different organs analyzed by
semi-quantitative RT-PCR with eukaryotic elongation factor
1-alpha (EF-1α)gene as internal control
内对照为真核生物翻译延伸因子 EF-1α。
F: floral organ; L: leaf; S: stem.

2.5 IPG-1与其他含 C2结构域基因的序列比较
目前在高等动物及人类中发现的含 C2 结构域
的蛋白一般包含 1~3个 C2结构域, 而植物中发现的
这类蛋白只包含一个C2结构域, 而且这类基因除与
Ca2+结合的位点及其他少数几个位点比较保守外 ,
不同基因间序列差异很大。将克隆到的 IPG-1 与人
类、动物和植物中的 C2结构域分别做了氨基酸序列
比对, 如图 6和图 7所示。与动物及人类的 C2结构
域比较, IPG-1 与其他基因间氨基酸序列差异很大,
但有 3 个很保守的天冬氨酸残基(D); IPG-1 与来源
于植物的 C2结构域比较, 其序列相似性较高, 且有
5 个很保守的天冬氨酸残基(D)。已有研究表明这些
保守的天冬氨酸残基可能是 Ca2+结合位点[10]。
3 讨论
已有研究表明, 在一些真菌中, PG 与致病性关
系非常密切, 即具有致病因子的功能。Shieh 等 [11]
证明在黄曲霉不同类型中, 表达 PG 基因的类群具
有很高的毒性, 而不表达 PG 基因的类群则不具致
病性; Have 等[12]用遗传学方法证明在灰霉病菌中,
表达 PG基因的菌株有很高致病性, 而 PG突变体虽
196 作 物 学 报 第 34卷


图 6 IPG-1与来源于人、牛、鼠的 C2结构域的比对
Fig. 6 Comparison of deduced amino acid sequences of IPG-1 with C2-domains from human PKCα(amino acid residues 167–267,
P17252), human cPLA2 (residues 17–113, M72393), bovine PLCδ1 (residues 569–666, P10895), and rat Synl-A, synaptotagmin I C2A
(residues 152–251, P21707) proteins
PKCα为人蛋白激酶(NCBI编号, P17252), 截取其含 C2结构域 167~267氨基酸段; cPLA2为人磷脂酶(NCBI编号, M72393), 截取含
C2结构域 17~113氨基酸段; PLCδ1为牛磷脂酶(NCBI编号, P10895), 截取其含 C2结构域 569~666氨基酸段; Synl-A为鼠突触结合蛋
白(NCBI编号, P21707), 截取其含 C2结构域 152~251氨基酸段。保守的氨基酸残基以黑色背景表示, 其中包括 3个推测与 Ca2+结合
的天冬氨酸残基 D。
The most conserved amino acid residues are shown in black, including three putative Ca2+-binding aspartatic acid residues (D).

然能感染植物, 但丧失了扩展能力; Zuppini 等[7]用
核盘菌 PG 蛋白处理大豆悬浮细胞 , 引起细胞内
Ca2+浓度迅速提高, 并很快诱导大豆细胞发生程序
性死亡(PCD), 证明该过程是钙依赖的信号传递过
程, Ca2+在 PG信号传递中具有重要作用。本研究以
核盘菌PG为诱饵蛋白, 在油菜 cDNA文库中筛选到
一个含 C2 结构域的蛋白, 而已有研究表明 C2 结构
域可与 Ca2+结合[10,14-15], 暗示 Ca2+很可能以某种方
式参与了 PG 的信号传递过程。PG 与 C2 蛋白的结
合有何生物学意义还需做进一步研究。
越来越多的证据表明蛋白质模块(protein mod-
ules)或称为结构域(domain)或功能区广泛存在于自
然界的各种蛋白质分子中。目前已发现很多蛋白质
模块, 如 C2、SH2、PTB、PH、SH3、WW 及 PDZ
等。这些模块可以独立折叠, 由 80~160个氨基酸构
成, 具有各种各样的功能。已有研究表明大部分含
C2结构域的蛋白是钙依赖性的磷脂结合蛋白。含该
结构域的蛋白主要与信号转导以及细胞膜运动
(membrane traffic)有关[12]。含 C2结构域的蛋白首先
在高等动物蛋白激酶 C(protein kimase C)中发现[13]。
之后陆续在人类及高等动物中发现 100个左右含 C2
结构域的蛋白, 如突触结合蛋白(synaptotagmin), 磷
酯酶 A2(phospholipase A2), 磷脂酶 C(phospholipase
C), GTP酶激活蛋白(GTPase activating proteins)等,
这些蛋白的功能多种多样, 如参与磷脂第二信号产
生(generation of lipid-second messengers)、GTP酶的
激活、控制蛋白质磷酸化以及参与蛋白−蛋白互作
等。人类及动物中发现的含 C2结构域的蛋白一般包
含 1~3个 C2结构域[14]。在植物中已报道的含 C2结
构域的蛋白仅有少数几例, 且仅含一个 C2 结构域,
被称为小 C2 结构域蛋白(small C2-domain protein),
如在水稻中发现的 OsERG1a 和 OsEGG1b, 当水稻
细胞受真菌激发子诱导后, 这两个蛋白可从细胞质
运动到细胞膜[15]; 在大麦中发现的 HvC2d, 是一个
受重金属诱导表达或在衰老叶片中表达的 C2 结构
域基因[16]; 拟南芥中发现的 BAP1, 在其抗病反应中
起负调控作用[17]。本研究从油菜中分离到一个含 C2
结构域的基因。一方面阐明了 PG和含 C2结构域蛋
白存在互作关系, 同时也表明 PG 除有降解细胞壁
的功能外, 还具有参与蛋白互作的功能。另一方面
为 PG 作为致病因子的信号传递途径提供了一些线
索。我们已经构建了 IPG-1 过量表达和 RNAi 植物
第 2期 王心宇等: 油菜 cDNA表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定 197



图 7 IPG-1与几种植物中含 C2结构域蛋白的比对
Fig. 7 Comparison of the deduced amino acid sequences of
IPG-1 with some plant C2-domain proteins, AtC2-1 (AAG52148)
from Arabidopsis, ZmC2-1 (U64437) from maize, OsERG1
(U95135) from rice, and CmPP16-1 (AF079170) from umpkin

AtC2-1(AAG52148)来自拟南芥, ZmC2-1(U64437)来自玉米,
CmPP16-1(AF079170)来自南瓜, OsERG1 (U95135)来自水稻。黑
底位点为保守氨基酸, 其中包括 5个推测与 Ca2+结合的天冬氨酸
残基 D。
The most conserved amino acid residues are shown in black, in-
cluding five putative Ca2+-binding aspartatic acid residues (D).

表达载体, 将进一步分析该基因过量表达和沉默后
对接种核盘菌的表现。
结合已有研究及生物信息学分析, 本研究克隆
到的钙依赖含C2结构域的蛋白, 将促进核盘菌与油
菜细胞相互作用信号传递过程的研究。利用该基因
作为诱饵蛋白 , 还可以进一步钓取其他协作蛋白 ,
有助于进一步揭示核盘菌−油菜相互作用过程中的
分子机理。
4 结论
在酵母中构建了油菜 cDNA 表达文库, 文库容
量为 1.3×106。克隆了核盘菌的致病因子 PG。以 PG
为诱饵蛋白, 通过双杂交方法对油菜 cDNA 表达文
库做了初步筛选, 分离到一个与 PG互作的蛋白, 包含
一个保守的结构域, 称为 C2 结构域。C2 结构域通常
可与 Ca2+结合, PG信号转导涉及 Ca2+及其结合蛋白。

致谢: 感谢南京农业大学农学院张天真教授课题组
提供实验条件及部分实验材料。
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