全 文 ：收稿日期:2013-03-05; 修订日期:2013-07-29
基金项目:广西中医药管理局中医药民族医药自筹经费科研资助项目
( 桂卫中［2011］11 号)
作者简介:吴俊林( 1984-) ，女( 汉族) ，湖北松滋人，广西医科大学在读硕
士研究生，学士学位，主要从事内分泌肿瘤研究工作．
* 通讯作者简介:卢德成( 1971-) ，男( 汉族) ，广西南宁人，广西医科大学
教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事内分泌肿瘤研究工作．
中药山慈姑对甲状腺癌细胞的促凋亡作用
吴俊林1，卢德成1* ，罗佐杰1，蒙雯雯2，黄雪梅3
(1．广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021;
2．广西桂林市中国人民解放军 181 医院，广西 桂林 541000;
3．南宁市第一人民医院，广西 南宁 530022)
摘要:目的 研究中药山慈姑对甲状腺癌细胞的促凋亡作用。方法 不同浓度的山慈姑作用于甲状腺癌 SW579 细胞，
MTT检测细胞的存活率，倒置相差显微镜观察细胞形态学改变。ＲT － PCＲ检测中药山慈姑作用于 SW579 细胞前后 BCL
－ 2 基因的表达水平。结果 在 1 ～ 100mg /ml范围内时山慈姑能不同程度的抑制 SW579 细胞的生长，山慈姑对 SW579 的
半数抑制浓度( IC50 ) 为 18． 81 mg /ml，最佳作用时间为药物处理后 48 h。山慈姑能降低 SW579 细胞中 BCL － 2 基因的表
达水平。结论 山慈姑能促进甲状腺癌细胞的凋亡，为山慈姑辅助治疗甲状腺癌提供理论依据。
关键词:山慈姑; 甲状腺癌; 细胞凋亡; BCL － 2
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 01． 029
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 01-0071-03
甲状腺癌是头颈部常见的恶性肿瘤，也是常见的内分泌系统
恶性肿瘤;有研究表明甲状腺癌的发病率在世界范围内呈上升趋
势，近十年来发病人数急剧增加［1］。甲状腺癌的治疗主要是以
外科手术为主，但甲状腺癌术式纷杂，且术后并发症较多，复发率
较高;放射性碘治疗(ＲAIT)是目前甲状腺癌非手术治疗的主要
方法，但其疗效受到组织摄碘率的影响。寻求疗效好、毒副作用
小的治疗方法和药物已成为迫切需要。中药以其药源广泛、价格
低廉、应用历史悠久等优点正成为抗肿瘤药物研究的热点。山慈
姑始载于唐代《本草拾遗》，具有清热解毒、消肿散结的功效。目
前临床上常用于内、外、妇、儿、皮肤等疾病的治疗，尤其是以复方
的形式用于抗肿瘤治疗［2］。现代药理学研究表明，山慈姑有抗
肿瘤、抗血管生成、阻断毒覃碱 M3 受体、降压、抗菌、激活酪氨酸
酶及影响造血系统等作用［3］。本研究以甲状腺癌细胞系 SW579
为研究对象，观察山慈姑对甲状腺癌细胞凋亡的影响。
1 材料
1． 1 材料 甲状腺癌细胞株 SW579 购自中科院上海细胞库。山
慈姑购于广西老百姓大药房双拥路店(批号:2010117000)。
1． 2 主要试剂 L － 15 培养基(武汉博士德生物有限公司)、胎牛
血清(FBS杭州四季青生物有限公司)、四甲基噻唑蓝(MTT 美国
Ameserco公司)、二甲基亚砜(DMSO 美国 Ameserco 公司)、
ＲNAise Plus (宝生物工程有限公司)、Premix Taq Version(宝生物
工程有限公司)、Goldviewna I 核酸染色剂 Solarbio(宝生物工程
有限公司)、DL500 DNA marker(宝生物工程有限公司)、TIAN-
script cDNA第一链合成试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司)、
引物 ①引物设计与合成 BCL － 2 mＲNA 与 β － actin mＲNA 均由
生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。②引物序列 人
BCL － 2 mＲNA
上游 5＇－ GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG － 3＇;
下游 5＇－ CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG －3＇;
产物大小:459bp。
β － actin mＲNA
上游 5＇－ CCTGTACGCCAACACAGTGC － 3;
下游 5＇－ ATACTCCTGCTTGCTGATCC － 3＇;
产物大小:211 bp。
1． 3 主要仪器 电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂)、
倒置相差显微镜(Axiovert 200 德国 Zeiss公司)、高速低温离心机
(5810Ｒ 德国 Eppenndorf Centrifuge 公司)、AB204 － E 分析天平
(瑞士梅特勒 －托利多公司)、多通道 PCＲ 扩增仪(PTC － 220 美
国MJ公司)、BIO － ＲAD电泳仪(美国 Bio － Ｒad公司)、凝胶成像
分析系统(Gel doc 2000 美国 Bio － Ｒad公司)、全自动酶标仪(美
国 Bio － Ｒad公司)。
2 方法
2． 1 不同浓度的山慈姑溶液的配制 取粉粹后的山慈姑 50 g，加
入 500ml双蒸水浸泡、煮沸后过滤，药渣再煎煮 2 次，合并 3 次滤
液。药液冷却后，边搅拌边缓慢加入 95%乙醇至药液含醇量为
50% ～60%，密封 4℃冷藏 24 ～ 48 h 后滤过，并用 95%乙醇洗涤
沉淀，收集滤液。滤液经真空减压回收得深棕色浸膏 6． 0 g。用
培养基溶解成 1 mg /ml的溶液，0． 22 μm的滤器过滤除菌后分装
备用。
2． 2 细胞培养 将 SW579 细胞置于含有 L － 15 完全培养液(含
有 10%胎牛血清、100 U /ml 青霉素和链霉素)的培养瓶中，于
37℃、5%CO2 饱和湿度的细胞培养箱中培养。
2． 3 MTT 法测定细胞存活率 将浓度为 0． 8 × 105 /ml 的 SW579
细胞悬液接种于 96孔板中，培养 24 h使细胞同步化后分别加入培
养基配制的不同浓度的山慈姑提取液，同时设置阴性对照组，各组
设 5个平行孔。分别于加药 24，48，72，96 h后，于倒置相差显微镜
下观察细胞状态。吸弃各孔中的液体，加入 MTT 孵育 4h 后小心
吸弃各孔内培养基，加入 DMSO，使结晶充分溶解并混匀后应用全
自动酶标仪于 490 nm处测吸光度值 A490。计算增殖抑制率，抑制
率(%)=(对照组 A490 －实验组 A490)/对照组 A490 × 100%，以时间
为横轴、抑制率为纵轴绘制各组细胞的生长曲线。
2． 4 ＲT － PCＲ 检测 BCL － 2 mＲNA 的表达水平 将不同浓度山
慈姑提取液孵育的 SW579 细胞用 ＲNAiso Plus(Totol ＲNA 提取
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 1 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 1 期
试剂)提取总 ＲNA，核酸蛋白分析仪检测含量后以 TIANscript
cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录成 cDNA。取 cDNA1． 2μl、
Premix Taq Version 10 μl、上游引物 0． 6 μl、下游引物 0． 6 μl、
ddH2O 6μl进行扩增。扩增条件为:94℃预变性 5 min，94 ℃变性
30 s，57． 6℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，35 个循环后 72℃延伸 5
min。最后将扩增产物于 2%琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系
统进行扫描并用 Image J软件分析图像。
2． 5 统计学处理 数据用 珋x ± s表示，用 SPSS16． 0 统计学软件进
行分析，多组间的比较采用方差分析，LSD 法对各组数据进行两
两比较，检验水准 α = 0． 05，P ＜ 0． 05 有统计学意义。
3 结果
3． 1 山慈姑对 SW579 细胞的增殖抑制作用 山慈姑提取物在
1 ～ 100 mg /ml范围内对 SW579 细胞有不同程度的促凋亡作用。
在浓度为 1 ～ 30 mg /ml范围内对细胞增殖的抑制作用呈浓度依
赖性;山慈姑对 SW579 细胞的抑制作用随着药物作用时间的延
长而增强，呈时间依赖性(见图 1)。在 48h后对细胞的抑制作用
减缓，且随着作用时间的延长细胞的状态较差，因此选择作用时
间为 48 h为药物作用观察时间(见表 1);经 SPSS16． 0 统计软件
计算得出山慈姑的 IC50为 18． 81mg /ml。
图 1 山慈姑提取液对 SW579 细胞增殖的抑制率
表 1 不同浓度山慈姑提取液对 SW579 细胞 48 h的抑制率(珋x ± s)
组别 A490nm(OD值) 抑制率(%)
对照组 0． 8047 ± 0． 0564 －
1 mg /ml 0． 608 7 ± 0． 042 3 0． 243 2 ± 0． 027 0
10 mg /ml 0． 423 3 ± 0． 063 3 0． 519 1 ± 0． 081 8
20 mg /ml 0． 262 7 ± 0． 058 0 0． 675 5 ± 0． 055 1
30 mg /ml 0． 225 7 ± 0． 024 7 0． 719 9 ± 0． 015 2
40 mg /ml 0． 243 0 ± 0． 023 6 0． 696 3 ± 0． 045 7
100 mg /ml 0． 723 3 ± 0． 038 1 0． 108 2 ± 0． 020 1
3． 2 倒置相差显微镜下观察细胞形态 与阴性对照组相比山慈
姑实验组中作用 48 h后细胞随着药物浓度的增加，细胞逐渐变
圆、皱缩、部分细胞贴壁不稳，漂浮在培养基中、数量逐渐减少，呈
现凋亡征象(见图 2 ～ 6)。
3． 3 ＲT － PCＲ检测 BCL － 2 mＲNA 表达水平 不同浓度的山慈
姑提取液处理 48h后 SW579 细胞 BCL － 2 mＲNA 的表达水平情
况见图 7 及表 2。与对照相比，各浓度组 BCL － 2 mＲNA 的表达
水平均下降(P ＜ 0． 05);30mg /ml 组 BCL － 2 mＲNA 的表达水平
低于 20mg /ml组(P ＜ 0． 001);20mg /ml组 BCL － 2 mＲNA的表达
水平低于 10mg /ml组(P ＜ 0． 05);10mg /ml 组与 1mg /ml 组相比
差异没统计学意义(P ＞ 0． 05)。
IC50的山慈姑提取液干预 SW579 细胞不同时间后 BCL － 2
mＲNA的表达水平情况，见图 8 及表 3。72 h组与 96 h组中 BCL
－ 2 mＲNA的表达水平均低于 24 h组与 48 h组(P ＜ 0． 05);24 h
组与 48 h组相比，差异无统计学意义(P ＞ 0． 05);72 h 组与 96 h
组相比，差异无统计学意义(P ＞ 0． 05)。
图 2 阴性对照组(100 ×) 图 3 1 mg /ml组(100 ×)
图 4 10mg /ml组(100 ×) 图 5 20mg /ml组(100 ×)
图 6 30mg /ml组(100 ×)
图 7 山慈姑提取液作用 48h后细胞 BCL － 2 的表达水平
图 8 IC50的山慈姑提取液处理后 BCL － 2 的表达水平
表 2 不同浓度山慈姑提取液对 SW579 细胞 BCL － 2 mＲNA的影响(珋x ± s)
组别 BCL － 2 mＲNA相对表达量
对照组 1． 0059 ± 0． 0000
1 mg /ml 1． 0014 ± 0． 0005 ＊
10 mg /ml 1． 0007 ± 0． 000 6＊＊
20 mg /ml 1． 0004 ± 0． 0001＊＊※
30 mg /ml 0． 9994 ± 0． 0003＊＊#※※＆
与对照组比较，＊ P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 001;与 1 mg /ml 组比较，# P ＜
0． 001;与 10 mg /ml组比较，※P ＜ 0． 05，※P ＜ 0． 001;与 20 mg /ml比较，＆P
＜ 0． 001
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 1
表 3 山慈姑提取液浓度为 IC50时对
SW579 细胞 BCL － 2mＲNA的影响(珋x ± s)
组别 BCL － 2 mＲNA相对表达量
24 h组 1． 0016 ± 0． 0023
48 h组 1． 0023 ± 0． 0011
72 h组 1． 0007 ± 0． 0011＊
96 h组 0． 9991 ± 0． 0009＊＊#
与 24 h组比较，＊P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;与 48 h组比较，#P ＜ 0． 05
4 讨论
甲状腺癌的发病率在恶性肿瘤中约占 1%，是内分泌系统中
常见的肿瘤之一，也是内分泌系统肿瘤引起死亡的主要原因之
一［4］。有研究表明甲状腺癌的发病率呈逐年增加趋势［1，5］，是增
加速度较快的恶性肿瘤之一［4］。甲状腺癌的治疗主要有手术、
放疗、化疗、基因治疗等治疗方法。放、化疗对机体毒副作用较
大，基因治疗上存在许多尚未解决的问题，从天然植物中寻找有
效的抗肿瘤药物近年成为研究热点。
一些中药具有抗肿瘤的作用已得到公认［6，7］。中药可作用
于肿瘤发生、发展的多个环节，具有多靶点、多环节、多效应的特
点［8］。中药抗肿瘤的机制主要有:抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤
细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤血管生长、抗氧化作用、
逆转多药耐药、提高免疫功能等［8，9］。近年来如何合理利用中药
抗肿瘤的优势开发出特色有效的抗肿瘤药物已成为研究的重点。
山慈姑是常用的抗肿瘤中药之一。山慈姑在临床上以复方
的形式广泛应用于口腔癌、食管癌、胃癌、甲状腺癌、乳腺癌等恶
性肿瘤及胃炎、血管瘤、甲状腺瘤、乳腺增生、前列腺增生和一些
皮肤病的治疗［3］。夏文斌等［10］对杜鹃兰的化学成分及肿瘤细胞
毒活性进行研究，发现从杜鹃兰乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部分
中分离得到化合物 cirrhopetalanthrin对结肠癌(HCT － 8)、肝癌(
Bel7402)、胃癌(BGC － 823)、肺癌(A549)、乳腺癌(MCF － 7)
和卵巢癌(A2780)细胞表现出非选择性中等强度细胞毒活性。
刘新桥［11］对独蒜兰的化学成分及体外抗肿瘤作用进行分析，发
现独蒜兰的各个萃取部位中，乙酸乙酯萃取和油醚层萃取物对小
鼠肺腺癌 LA795 细胞均有一定的抑制作用。阮小丽等［12］的研究
得出杜鹃兰及老鸦瓣对小鼠 Lewis 肺癌、小鼠 S180 实体瘤及小
鼠肝癌均由显著抑制作用。林如辉等［13］研究也得出山慈姑提取
液能诱导胃癌细胞的凋亡，具有抗肿瘤作用。本研究以人甲状腺
癌细胞系 SW579 为研究对象，观察山慈姑对甲状腺细胞增殖的
影响。结果表明山慈姑能促进 SW579 细胞凋亡，且有剂量、时间
依赖性。不同浓度的山慈姑对 SW579 细胞的影响不同:在 ＜
1mg /ml时具有促进细胞生长的作用，细胞生存率 ＞ 100%;在≥
40mg /ml时，对细胞的生长作用随着浓度的增加而下降。这可能
与药物毒性兴奋效应有关［14］。
BCL － 2 基因即 B 细胞淋巴瘤 /白血病基因 2(B － celllym-
phoma / leukemia － 2)，是 1984 年由 Tsujimoto等［15］在滤泡型 B 淋
巴瘤中发现，由染色体［t(14:18)(q32:q21) ］易位而激活。有研
究证明 BCL － 2 基因有阻滞细胞凋亡发生的作用，是一种细胞凋
亡抑制基因［16，17］。BCL － 2 基因是细胞凋亡相关基因中研究得
较多的一类基因，BCL － 2 抗凋亡机制主要是［18］:①作为抗氧化
剂，调节细胞氧化还原状态，阻断氧化作用对细胞组成成分的破
坏;②影响细胞跨膜转运，改变钙离子分布，钙离子激活内源性内
切酶和谷氨酰胺转移酶;③抑制有促凋亡作用的细胞色素 C 从
线粒体释放到细胞浆;④保护细胞免受核酸酶损害，抑制 DNA断
裂。BCL － 2 基因通过调节细胞的凋亡参与肿瘤的发生与发展，
在乳腺癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、胃癌
和结肠癌等许多肿瘤中能检测到 BCL － 2 基因的表达增强［18］。
国内外的学者对 BCL － 2 基因在甲状腺癌中的表达以及与甲状
腺癌的组织类型和分化的关系也进行了大量的研究。Hinze
等［19］研究显示，在髓样甲状腺癌及 C －细胞增生中，BCL － 2 表
达加强，在未分化的甲状腺癌中表达丧失。赖非云等［20］对不同
甲状腺组织中 Bcl － 2 的表达情况进行观察，发现 Bcl － 2 阳性反
应见于甲状腺癌、甲状腺腺瘤及癌旁甲状腺组织，且甲状腺未分
化癌、髓样癌组织中及存在淋巴结转移和临床Ⅲ、Ⅳ期病例中 Bcl
－ 2 的阳性率明显增高。熊少伟等［21］的研究也得到相似的结
果。有研究表明，下调 BCL － 2 水平能使肿瘤细胞的凋亡率增
加，促进肿瘤细胞的凋亡［22，23］。本研究检测不同浓度的山慈姑
作用于 SW579 细胞前后 BCL － 2 基因的表达水平，发现山慈姑在
1 ～ 30 mg /ml范围内时，基因的表达随着浓度的增加而下降;当
山慈姑≥40 mg /ml时，基因的表达水平随着浓度的增加而增强。
其结果与 MTT的结果相一致。由此推测，山慈姑通过下调 BCL
－ 2 基因的表达水平，减弱对细胞凋亡的抑制作用，从而促进
SW579 细胞的凋亡。
本实验就山慈姑诱导甲状腺癌细胞凋亡的角度进行探讨，结
果说明山慈姑能促进甲状腺癌细胞的凋亡，且这一作用可能是通
过下调抗凋亡基因 BCL － 2 的途径来实现，为临床使用山慈姑抗
甲状腺癌提供了理论依据。山慈姑的药理作用及抗癌机制目前
研究得还不够充分，还有待进一步深入的研究。
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收稿日期:2013-03-15; 修订日期:2013-09-03
基金项目:甘肃省中医管理局资助项目( No． GZK － 2010 － 47)
作者简介:殷银霞( 1968-) ，女( 汉族) ，江苏镇江人，甘肃中医学院附属医
院主任医师，学士学位，主要从事中医老年病的防治研究工作．
* 通讯作者简介:吴玉泓( 1967-) ，男( 汉族) ，甘肃靖远人，甘肃中医学院
教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事脾胃病研究工作．
蜜环菌多糖含药血清对过氧化氢
诱导 PC12 细胞损伤的保护机制
殷银霞1，邱家权2，吴玉泓2* ，谢守嫔3，李海龙2，程小丽2，杨植媛2，邓健男2
(1．甘肃中医学院附属医院，甘肃 兰州 730000; 2．甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000;
3．兰州市第一人民医院，甘肃 兰州 730050)
摘要:目的 探讨蜜环菌多糖含药血清对过氧化氢( H2O2 ) 诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞( PC12 细胞) 损伤保护的作用
机制。方法 在 H2O2 诱导 PC12 细胞损伤模型的基础上加入蜜环菌多糖含药血清，采用 MTT 比色法检测含药血清对
H2O2 抑制 PC12 细胞增殖的影响;用比色法检测含药血清对 H2O2 诱导 PC12 细胞损伤培养液中乳酸脱氢酶的活力、丙二
醛含量及超氧化物歧化酶活力的影响。结果 不同浓度的含药血清对 H2O2 损伤的 PC12 细胞的存活率有提高作用，含药
血清浓度在 10%时达最大值( P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ; 10%浓度的含药血清可明显降低模型细胞培养液中 LDH活力、MDA
含量，提高 SOD活力。结论 蜜环菌多糖含药血清对 H2O2 损伤的 PC12 细胞有保护作用，机制可能与提高细胞抗氧化能
力有关。
关键词:阿尔茨海默病; 蜜环菌多糖; 过氧化氢; PC12
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 01． 030
中图分类号:Ｒ931． 71; Ｒ592 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 01-0074-02
阿尔茨海默病(Alzheimer＇s disease，AD)是导致痴呆的最常
见原因，该病最有特征性的病理改变就是在与记忆、认知有关的
大脑皮质海马等部位出现老年斑和神经纤维缠结［1］。近年研究
发现，自由基损伤所造成的神经元损伤是造成 AD的重要原因之
一［2］。蜜环菌是一种在夏、秋季生长，能兼性寄生于多种植物的
食(药)用菌，其被发现同共生的天麻具有增智、健脑、延缓衰老
的作用，对 AD有一定疗效［3］。研究表明，蜜环菌多糖具有多种
功效，包括抗衰老、降血糖、增强免疫以及对巨噬细胞、骨髓细胞
的保护作用以及抗晕眩等。目前，已有人观察到复方天麻蜜环菌
片对 AD有一定疗效，可显著的提高 AD患者的 MMSE和 HDS量
表成绩和智力量表成绩，明显改善临床症状，降低神经功能缺损
积分，改善日常生活能力［4］。但尚未阐明其保护神经细胞的机
制，本研究用 H2O2 处理大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12 细
胞)，制备氧化应激损伤模型，采用 MTT 法检测蜜环菌多糖含药
血清对 PC12 细胞增殖的影响，观察蜜环菌多糖是否具有抗氧化
应激的神经保护作用;采用 LDH、MDA、T － SOD比色法检测各组
细胞培养液中各指标含量变化，研究蜜环菌多糖是否具有抗氧化
损伤作用及其保护机制，以期为蜜环菌多糖用于治疗 AD提供实
验依据。
1 材料
1． 1 动物 SPF 级 wistar 大鼠，雌雄各半，体质量(200 ± 20)g，
(甘肃中医学院医学实验中心提供)。
1． 2 细胞 PC12 细胞株购自上海中科院生物细胞所。
1． 3 试剂 DMEM高糖培养基购自 Gibco 公司，四季青胎牛血清
购自杭州四季青公司，Aβ25 ～35购自上海强耀生物科技有限公司，蜜
环菌提取物购自上海康舟真菌多糖有限公司(批号:201001012)，
LDH测试盒(批号:20101025)、MDA测试盒(批号:20120921)、T －
SOD测试盒(批号:20120921)购自南京建成生物工程研究所，四甲
基偶氮唑蓝(MTT)(上海华舜生物工程有限公司)。
1． 4 仪器 酶标仪(美国 Bio － rad)，细胞培养箱(Sanyo MCO －
15AC)。
2 方法
2． 1 含药血清的制备 将 40 只 SPF 级 wistar 大鼠，随机分为空
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 1