全 文 ：不同培养基对山慈姑种子无菌萌发的影响
尤 超，宋晓婕，石彩娟，王万军* (西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都 610031)
摘要 ［目的］寻找山慈菇(Pleione bulbocodioides(Franch．)Rolfe)种子萌发的最佳培养条件，为山慈菇试管苗的获得提供技术支撑。
［方法］人工授粉获得山慈姑种子，利用其未成熟胚进行种子萌发试验，探讨了不同蔗糖浓度、不同活性炭浓度、不同类型的基本培养基、
4种单激素(6 － BA、KT、NAA、IAA)及各自不同浓度、2种双激素组合及不同浓度等对山慈姑种子萌发率的影响。［结果］诱导山慈姑种
子萌发的最适培养基为 1 /2MS + 1． 5 mg /L IAA + 0． 05%干酪素 + 2%蔗糖 + 0． 75%活性炭 + 0． 55%琼脂(pH 5． 8)，且添加了 IAA
的处理萌发率普遍较高，不仅诱导出原始球茎数量多，而且体积大，平均直径达 1 ～ 1． 5 mm。［结论］该试验建立优质、高效的山慈菇种
子萌发体系，可为大量试管苗的获得奠定基础。
关键词 山慈姑(Pleione bulbocodioides(Franch．)Rolfe);组织培养;种子萌发
中图分类号 S132 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)26 －16006 －02
Effects of Different Culture Media on Seed Germination of Pleione bulbocodioides (Franch．)Rolfe
YOU Chao et al (School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu，Sichuan 610031)
Abstract ［Objective］To discover the optimum culture condition for seed germination of Pleione bulbocodioides (Franch．)Rolfe and provide
technical support for the acquisition of test － tube plantlets．［Method］Effects of sucrose concentrations，active carbon concentrations，basal medi-
um types，4 hormones(6 － BA，KT，NAA and IAA)concentration and 2 combinations of double － hormones on the germination of Pleione bulboco-
dioides (Franch．)Rolfe seeds that were obtained through artificial pollination were investigated in immature embryos．［Result］The optimal cul-
ture condition for seed germination was a combination of 1 /2MS，2% sucrose，0． 05% casein，0． 75% active carbon，0． 55% agar and 1． 5 mg /L
IAA (pH 5． 8)． The addictive IAA could cause a higher germination frequency，which induced more and larger protocorms whose average diame-
ter reacheed 1 －1． 5 mm．［Conclusion］A good and effective seed germination system was established in this study，which would provide basis for
acquisition of abundant test － tube plantlets of Pleione bulbocodioides(Franch．)Rolfe．
Key words Pleione bulbocodioides (Franch．)Rolfe;Tissue culture;Seed germination
作者简介 尤超(1986 － ) ，男，山东枣庄人，在读硕士，研究方向:药用
植物资源与分子生物学，E-mail:youchaoswjtu@ qq． com。*
通讯作者，教授，硕士生导师，从事药用植物资源与分子生
物学研究，E-mail:wanjunwang@ home． swjtu． edu． cn。
收稿日期 2011-04-29
地生兰科(Orchidaceae)植物独蒜兰［Pleione bulboco-
dioides (Franch．)Rolfe］是生药山慈姑(PSEUDOBULBUS
CREMASTRAE SEU PLEIONES)的基原植物，是常用中药，其
假鳞茎具有清热化痰、解毒、消痈散结等功效，常用于治疗痈
肿疗毒、瘰疠、淋巴结结核、恶疮、蛇虫咬伤等症［1 －2］。由于
资源有限，加之近年来的过度开采，野生资源已临枯竭，从而
成濒危物种。山慈姑种子数目虽然众多，其种子是一团未分
化的胚细胞，而且种子难于透水、透气，胚乳发育不全，因而
在自然条件下几乎不萌发。若能利用植物组织培养技术诱
导其高频率萌发，获得大量试管苗，这将为其可持续利用奠
定基础。笔者以山慈姑种子为研究对象，通过设计不同培养
基组合来诱导种子萌发以寻找山慈菇种子萌发的最适培
养基。
1 材料与方法
1． 1 材料 山慈姑［Pleione bulboeodioides (Franch．)Rolfe］
为四川省都江堰市赵公山地区的多年生野生植物，在 4 月下
旬开花后，选取性状优良的植株进行授粉，8月中下旬采集成
熟蒴果作试验材料。
1． 2 方法
1． 2． 1 诱导山慈姑种子萌发。选择成熟未开裂蒴果，先用
5%洗洁精清洗 5 min，并不断摇动，用自来水冲净洗洁精，晾
干后在超净工作台上用75%乙醇浸泡3 min;再转入0． 1%升
汞(附加 0． 1% Tween20作为浸润剂)中浸泡 10 ～ 15 min;最
后用无菌水将蒴果冲洗 4 ～ 5 遍，并用无菌滤纸吸干多余水
分后晾干备用。将经以上消毒处理的蒴果在无菌状态下切
开，将种子撒播于基本成分为“1 /2MS + 2． 0 mg /L 6 － BA +
0． 2 mg /L NAA + 0． 05%干酪素 + 2%蔗糖 + 0． 75%活性
炭 + 0． 55%琼脂(pH 5． 8，1 /2MS是指 MS基本培养基中的
大量元素减半)”的萌发培养基中，再向每瓶培养基中加入 1
ml 0． 1%琼脂，振荡使种子充分混匀并平铺于培养基上，将培
养瓶置于 25 ±1 ℃培养室中进行培养。在诱导种子萌发阶
段采用暗培养，以种胚突破种皮、体积明显增大、形成白色原
球茎为萌发标志(种子突破种皮后变黄、坏死的不计) ，诱导
培养 150 d开始有种子萌发，210 d统计萌发种子并计算萌发
率(萌发率 =萌发的种子数 /统计的种子总数 × 100%) ;再将
萌发出的原球茎转入光照培养，光照时间为 12 h /d，光照强
度为 1 800 lx。
1． 2． 2 蔗糖对山慈姑种子萌发的影响。改变萌发培养基中
的蔗糖浓度(0 ～7%) ，其余成分不变。
1． 2． 3 培养基中大量元素的含量对山慈姑种子萌发的影
响。改变萌发培养基中 MS大量元素的含量，其余成分不变。
1． 2． 4 激素对山慈姑种子萌发的影响。
1． 2． 4． 1 不同激素的影响。将萌发培养基中的 2 种激素改
变为不同浓度的单激素，其余成分不变，具体的试验方案见
表 1。
表 1 不同单激素浓度梯度
Table 1 Single-hormone concentration gradient mg /L
编号
No．
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
6-BA 0 0． 50 1． 0 1． 25 1． 5 1． 75 2． 0 2． 25 2． 5 2． 75 3． 0 4． 0
KT 0 0． 5 0． 75 1． 0 1． 25 1． 50 1． 75 2． 00 2． 25 2． 50 3． 0 4． 0
IAA 0 0． 5 0． 75 1． 0 1． 25 1． 50 1． 75 2． 00 2． 25 2． 50 3． 0 4． 0
NAA 0 0． 05 0． 10 0． 15 0． 2 0． 30 0． 40 0． 50 0． 75 1． 00 2． 0 4． 0
责任编辑 侯美灵 责任校对 傅真治安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(26):16006 － 16007，16012
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.26.195
1． 2． 4． 2 激素组合的影响。以 IAA 为基础，分别与 6 － BA
和 KT组合，代替萌发培养基中的两种激素，其余成分不变，
具体的试验方案见表 2。
表 2 IAA与 6 － BA、KT浓度组合
Table 2 Concentration combinations of IAA and 6 －BA，KT mg /L
试验号
No．
IAA KT 6-BA
1 0． 50 0． 25 0． 5
2 1． 00 0． 25 0． 50
3 2． 00 0． 25 0． 50
4 3． 00 0． 25 0． 50
5 0． 50 0． 50 1． 00
6 1． 00 0． 50 1． 00
7 2． 00 0． 50 1． 00
8 3． 00 0． 50 1． 00
9 0． 50 1． 00 2． 00
10 1． 00 1． 00 2． 00
11 2． 00 1． 00 2． 00
12 3． 00 1． 00 2． 00
13 0． 50 2． 00 3． 00
14 1． 00 2． 00 3． 00
15 2． 00 2． 00 3． 00
16 3． 00 2． 00 3． 00
2 结果与分析
2． 1 蔗糖对山慈姑种子萌发的影响 由图 1 可知，若不添
加蔗糖则萌发率为 0;当蔗糖浓度为 1． 0%时，萌发效果达最
大，萌发率为 4%;但当蔗糖浓度超过 1． 0%以后，随着蔗糖
浓度的增加，萌发率则呈下降趋势，在蔗糖浓度为 7． 0%时萌
发率仅为 0． 25%。
2． 2 培养基中大量元素的含量对山慈姑种子萌发的影
响 由图 2可知，当萌发培养基中 MS大量元素含量不变时
对山慈姑种子萌发的诱导效果最好，萌发率为 4． 25%;而随
着培养基中大量元素的减少，萌发率则呈下降趋势，当大量
元素的含量降至基本培养基中的 1 /6和 1 /8时萌发率为 0。
图 1 蔗糖对山慈姑种子萌发的影响
Fig． 1 Effects of sucrose on seed germination of Pleione bulboco-
dioides (Franch．)Rolfe
2． 3 激素对山慈姑种子萌发的影响
2． 3． 1 不同激素的影响。由图3可知，在4种不同单激素培
养基中的种子萌发率均有较明显的最大值，其中 6 － BA作用
效果最佳的浓度为 1． 0 和 1． 25 mg /L，萌发率 1． 75%;KT最
佳浓度为 1． 25 mg /L，萌发率 0． 25%;NAA 最佳浓度为 0． 1
mg /L，萌发率 2． 5%;IAA 最佳浓度为 1． 5 mg /L，萌发率
6． 5%，通过对比得出，添加生长素激素 (NAA和 IAA)的培
养基诱导山慈姑种子萌发的效果要优于添加细胞分裂素激
素(6 － BA和KT)的培养基，而添加 IAA的培养基诱导种子
萌发的效果又要明显好于添加 NAA 的培养基激素，萌发率
基本均在 4%以上。
2． 3． 2 激素组合的影响。由图 4 可知，IAA与 KT以及 IAA
与 6 － BA这 2种激素组合下的萌发率也都有较明显的最大
值，其中 2． 0 mg /L IAA和 0． 25 mg /L KT在 IAA与 KT组合
中效果较好，萌发率 1． 167%;1． 0 mg /L IAA和 2． 0 mg /L 6 －
BA在 IAA与 6 － BA的组合中对种子萌发的诱导效果最好，
萌发率3． 25%。综合来看，IAA与6 － BA的组合作用效果相
对较好，添加 IAA与 6 － BA 的萌发培养基普遍具有较高的
诱导山慈姑种子萌发的萌发率。
图 2 培养基中大量元素的含量对山慈姑种子萌发的影响
Fig． 2 Effects of macroelement in culture medium on seed ger-
mination of Pleione bulbocodioides (Franch．)Rolfe
图 3 激素对山慈姑种子萌发的影响
Fig． 3 Effects of hormones on seed germination of Pleione bul-
bocodioides(Franch．)Rolfe
图 4 IAA与 6-BA、KT组合对山慈姑种子萌发的影响
Fig． 4 Effects of 2 combinations of double － hormones on seed
germination of Pleione bulbocodioides (Franch．)Rolfe
3 结论与讨论
山慈姑种子的萌发受到蔗糖、活性炭以及培养基中大量
元素的影响。蔗糖作为植物培养基中的主要能源物质与渗
透调节剂，其浓度高低对种子的萌发影响较大，在不添加蔗
(下转第 16012 页)
7006139 卷 26 期 尤 超等 不同培养基对山慈姑种子无菌萌发的影响
宜条件。试验还发现，分生孢子在 30 ℃下萌发较快且能正
常发育成菌丝，但在 35 ℃时萌发率低且难以发育成菌丝。
这表明腐烂病菌在 35 ℃以上高温时难于侵染。但这不能说
明腐烂病菌在夏季不能侵染，因为在我国北方苹果主产区，
夏季温度低于 30 ℃的天气并不鲜见。
臧睿等研究认为，分生孢子萌发需要 100%的相对湿
度［8］。该试验未对腐烂病菌分生孢子萌发的湿度条件展开
研究。依据气象数据和田间观察，在冬季的浓雾天气和树枝
有积雪覆盖条件下，达到 100%相对湿度是有可能的。笔者
在田间观察还发现，大部分腐烂病发生在剪锯口部位，而冬
季是进行苹果修剪的主要季节。修剪造成的伤口非常有利
于病菌侵入，加上修剪工具的传带，由此推断病原菌在冬季
的侵染可能在病害流行中发挥着重要作用。虽然冬季并不
总是有积雪或有浓雾天气，但是分生孢子角一旦形成后在背
阴条件下能够存活较长的时间，所以传带到伤口部位的病原
菌一旦遇到适宜的温湿度条件就可以进行侵染。因此，对剪
锯口及时用药保护是防治苹果树腐烂病的一项重要措施。
尤其对于冬季降雪和大雾天气较多的年份，剪锯口保护对于
预防腐烂病菌的侵染尤为重要。
系统调查发现，在腐烂病斑上一年四季均可产生分生孢
子角。这些分生孢子角在不同条件下的存活时间对于其侵
染能力有重要影响。而以笔者查阅文献所及，对于影响分生
孢子角活力的因素及相关条件的研究还很少。臧睿等研究
认为，光照对于分生孢子萌发的影响较小［8］。而该试验在室
内模拟了室外弱、中等和强光照下的紫外线强度对分生孢子
角存活的影响。结果发现，在中等紫外线强度处理 2 min，腐
烂病菌分生孢子萌发活力即显著下降，处理 4 min即基本丧
失萌发活力。而强紫外线对分生孢子萌发活力影响更大，处
理 4 min即导致分生孢子完全丧失萌发活力。这表明紫外
线对于腐烂病菌分生孢子的存活有显著的影响。进一步研
究分生孢子在不同生存环境下的存活情况。将孢子角在树
枝上和树皮上室内黑暗保存、在树皮上室外向阳和室外背阴
保存，分别模拟了分生孢子潜伏在落皮层及芽内、老翘皮上、
向阳面树皮外和枝干背面树皮外的存活状况。结果发现，在
室内树枝上保存的分生孢子角能够在室温下保持 9 周以上
的萌发活力，而在室外向阳条件下 1 周内分生孢子角即丧失
萌发活力。这些研究结果表明，光照强度和光照时间对于腐
烂病菌孢子的存活有重要的影响。至于室内背光条件下树
皮上分生孢子角存活时间远低于树枝上，其原因可能与湿度
有关系，树皮的快速失水有可能加速了分生孢子角的死亡，
这还有待于以后进一步研究明确。
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪131．
(上接第 16007 页)
糖的情况下种子不萌发，在浓度为 1． 0%时促进萌发效果最
好，而在浓度 ＞ 1%时，萌发效果反而随浓度增大而下降，这
说明蔗糖对山慈姑的种子萌发具有重要的促进作用。活性
炭作为培养基中吸附剂可以吸附植物生长过程中释放的酚
类等有害化合物，抑制褐变，在预实验中，培养基中适宜的活
性炭浓度比不添加或添加浓度不适宜的培养基对山慈姑种
子萌发效果具有极显著的推动作用，这与许多试验结果相一
致［3］。基本培养基中大量元素的含量对山慈姑子萌发的影
响也较大，人们很早发现低浓度的氮源有利于兰科植物种子
的萌发［4］，但该试验中以具高浓度氮源的 MS和 1 /2MS作为
基本培养基的萌发率均较高，且随着大量元素的减少，氮源
浓度的降低，萌发率反而随之降低，这可能是兰科植物不同
物种之间的差异或者培养基中添加的激素种类及浓度不同
造成的，还有待进一步研究。
植物激素不仅能够诱导兰科植物未成熟胚发育形成原
球茎，还可大大加快个体发生和形态建成的速度［5］;在原球
茎的诱导阶段，培养基中添加生长素和细胞分裂素对原球茎
的诱导有利，加细胞分裂素对原球茎的分化有促进作用［6］;
生根诱导时只需生长素即可［7］。在研究中，IAA相对于其它
激素，更能明显地促进山慈姑种子的无菌萌发，其中在培养
基中添加 1． 5 mg /L IAA 对种子萌发的促进效果最好，且经
IAA单激素处理的山慈姑种子的萌发率整体都较高，不仅诱
导出得原球茎数量多，而且体积大，平均直径可达 1 ～ 1． 5
mm，说明 IAA最适合诱导山慈姑种子的萌发。此外，NAA促
进山慈姑种子的萌发效果也较好，并且 NAA 和 IAA 在高浓
度时的萌发率依然较高，这可能与活性炭的添加有关，因为
活性炭具有吸附植物生长素的作用。
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