全 文 ：现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.8
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海枣曲霉产内切菊糖酶的发酵条件及
菊糖酶解条件的研究

张建平 1，张泽生 2
（1.天津科技大学海洋科学与工程学院，天津 300457）
(2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）
摘要：利用海枣曲霉发酵获得菊糖酶粗酶液，对粗酶液的发酵条件和酶解条件进行了研究。结果表明，菊糖酶的最适发酵条件为：
菊糖 2%，磷酸二氢铵 0.5%，磷酸二氢钾 0.25%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 6.0~7.0，接种量 8%，温度 28 ℃，时间 60 h，按最优条件得
到的菊糖酶粗酶液，酶活为 18.39 U/mL，I/S 值为 45.71。菊糖酶的最适酶解条件：温度 60 ℃，加酶量 11.0 U/g 菊糖，水解 12 h，底物
浓度 10%，pH 6.0~7.0。菊糖酶解率最高达 59.3%。运用超滤法纯化菊糖酶解产物得到低聚果糖，利用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测
定其相对分子质量为 509，聚合度为 2~3。
关键词：海枣曲霉；菊糖酶；菊糖；低聚果糖
文章篇号：1673-9078(2011)8-956-959
Incision Inulinase Production via Fermentation by Aspergillus phoenicis and
its Application in Enzymolysis of Inulin
ZHANG Jian-ping1, ZHANG Ze-sheng2
(1.college of marine Science and Engineering, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin, 300457, China)
(2. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin, 300457, China)
Abstract: Inulinase was produced by Aspergillus phoenicis-mediated fermentation. The conditions of fermentation and enzymolysis were
studied. The results showed that the optimal fermentation conditions were: inulin 2%, NH4H2PO4 0.5%, KH2PO4 0.25%, MgSO4·7H2O 0.05%, pH
6.0-7.0, inoculum size 8%, temperature 28 ℃ and fermentation time 60 h. Under these conditions, the enzyme activity and I/S of inulase were
18.39 U/mL and 45.71, respectively. The optimal enzymolysis conditions were: temperature 60 ℃, additive amount of enzyme 11.0 U/g inulin,
enzymolysis time 12 h, concertration of substrate 10%, pH 6.0~7.0. The rate of inulin enzymolysis was 59.3% under the optimal conditions.
High-purity fructooligosaccharide was obtained by ultrafilter device and its molecular weight and polymerization degree were determined by
HPGPC as 509 and 2-3, respectively.
Key words: Aspergillus phoenicis; inulase; inulin; fructooligosaccharide

菊糖(Inulin)是一种果聚糖，其分子由D-呋喃果糖通
过β-1,2糖苷键相连，菊糖酶(Inulase)是菊糖的水解酶，
系统名称为β-D果糖水解酶[1]。菊糖酶根据酶切果聚糖链
方式分为内切酶和外切酶，内切菊糖酶水解菊糖可以得
到高纯度低聚果糖，外切菊糖酶水解菊糖可以得到高纯
度果糖[2]。
利用菊糖内切酶酶解菊糖来生产菊糖低聚糖，产物
纯度高、原料便宜、前景好。自然界中许多微生物能够
产生菊糖水解酶。但研究结果表明[3]，许多微生物所产
菊糖酶为混合酶，且多表现为外切活性，其水解菊糖产
收稿日期：2011-04-19
基金项目：天津科技大学科学研究基金资助项目（20090214）
作者简介：张建平（1982-），女，硕士，助理实验师
物以果糖为主。因此，找到一种仅产内切酶的微生物或
找到使微生物仅产内切酶的发酵条件将是利用菊糖生产
低聚果糖的关键。实验研究了海枣曲霉产菊糖内切酶的
发酵条件及酶解菊糖条件，为菊糖酶的进一步研究提供
了一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
菌种：海枣曲霉 Aspergillus phoenicis，购于中国农
业微生物菌种保藏中心。
培养基：活化培养基（PDA 土豆固体培养基）；种
子培养基（PDA 土豆液体培养基）。
主要仪器：回转式恒温调速摇瓶柜 HYG-IIa（上海
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2011.08.017
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欣蕊自动化控制设备有限公司）；UltralabTM 超滤系统装
置（美国 PALL 公司）；高效液相色谱系统（日本岛津公
司）；GPC OHpak SB-804 色谱柱(7.9 mm×300 mm)（日
本 Shodex 公司）。
1.2 方法
1.2.1 接种及培养
将海枣曲霉接种到活化培养基上，28 ℃培养 3 d，
待菌丝长满斜面时再转接一次，之后选取生长浓密的试
管，接种到种子培养基中，130 r/min，28 ℃培养 48 h 后
作为海枣曲霉种子。
1.2.2 海枣曲霉发酵培养基的确定
根据表 1 所列营养成分，按碳源 2%、有机氮源 1%、
无机氮源 0.5%、无机盐 0.5%、痕量金属 0.05%、pH 6.0
配置发酵培养基，每瓶100 mL分装到250 mL锥形瓶中，
121 ℃灭菌 15 min，冷却，接种海枣曲霉种子，接种量
5%，28 ℃ 130 r/min 发酵 48 h 后测定粗酶液的内、外
切酶活力来选择营养物质，利用正交实验确定营养物质
的添加量。
表1 海枣曲霉发酵培养基营养成分
Table 1 Nutrition constituent of fermentation medium
碳源 有机氮源 无机氮源 无机盐 痕量金属
菊糖 酵母粉 氯化铵 KH2PO4 MgSO4·7H2O
蔗糖 蛋白胨 柠檬酸铵 K2HPO4 FeSO4·7H2O
葡萄糖 牛肉膏 磷酸氢二铵 KNO3 CuSO4·5H2O
果糖 尿素 磷酸二氢铵 KCl MnSO4·H2O
乳糖 玉米浆 硝酸铵 Ca3(PO4) blank
1.2.3 海枣曲霉其他发酵条件的确定
按 1.2.2 的实验结果配制发酵培养基，接种海枣曲
霉种子，应用单因素实验，以发酵产生的粗酶液的酶活
为标准，确定海枣曲霉发酵时间、温度、培养基初始 pH
值和接种量。
1.2.4 菊糖酶粗酶液的制备
液体发酵培养基经 4 层纱布过滤，滤液 5000 r/min
离心 15 min，取上清液为粗酶液。
1.2.5 粗酶液酶解菊糖条件的优化
称取菊糖于三角瓶中，用 100 mL 蒸馏水溶解，加
入粗酶液，在恒温水浴摇床上振荡酶解，以菊糖酶解率
为指标，研究温度、加酶量、底物浓度和 pH 值对菊糖
酶解的影响。
1.2.6 菊糖酶解物的分离纯化及其相对分子质量测定
将菊糖酶水解产物配成 2 g/L 的水溶液，采用间歇
法进行膜超滤，滤液薄膜蒸发，冷冻干燥后用高效凝胶
渗透色谱法[4]检测其相对分子质量。
1.2.7 检测
菊糖酶活力：对于同时具有内切及外切活性的菊糖
酶粗酶液，通常测定其对 2%菊糖溶液的酶活力单位 I
和对 2%蔗糖溶液的酶活力单位 S，一般认为当 I/S>10
时，粗酶液的外切活性被抑制，而表现为内切活性[2]。
每分钟转化生成 1 mol 还原糖所需的酶量为一个酶活力
单位，还原糖含量用 3.5-二硝基水杨酸法[5,6]测定。
菊糖酶解率：被酶解成还原糖的菊糖占原菊糖含量
的百分比定义为菊糖酶解率，还原糖含量用 3.5-二硝基
水杨酸法测定，菊糖含量用苯酚硫酸法[5,6]测定。
2 结果与讨论
2.1 海枣曲霉发酵条件确定
2.1.1 发酵培养基营养物质的选择
表2 培养基营养成分对酶活力的影响
Table 2 Effect of medium nutrients on enzyme activity
分类 营养成分 I/S
碳源
菊糖 1.38
蔗糖 0.72
葡萄糖 1.02
果糖 0.96
乳糖 1.49
氮源
酵母粉 0.36
蛋白胨 1.30
牛肉膏 0.71
尿素 0.52
玉米浆 0.52
氯化铵 4.54
柠檬酸铵 1.51
磷酸氢二铵 3.43
磷酸二氢铵 19.05
硝酸铵 2.17
无机盐
KH2PO4 17.65
K2HPO4 2.23
KNO3 8.88
KCl 4.83
Ca3(PO4)2 3.23
痕量金属
MgSO4·7H2O 12.54
FeSO4·7H2O 6.22
CuSO4·5H2O 6.17
MnSO4·H2O 7.15
blank 5.02
海枣曲霉发酵培养基使用不同的营养物质后，产菊
糖酶活性如表 2 所示。碳源选择菊糖能比其它糖类产生
更高活性的菊糖酶；简单无机氮源比复杂的有机氮源更
有利于内切菊糖酶的产生，其中磷酸二氢铵效果最好；
无机盐选择 KH2PO4 最有利于内切菊糖酶的产生；培养
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基中添加一定浓度的金属离子，可能对酶的产生和活性
有抑制或者激活作用，MgSO4·7H2O 对内切菊糖酶的产
生具有较明显的激活作用，其它则无明显影响。
2.1.2 发酵培养基营养物质添加量的优化
通过正交实验来确定 2.1.1 选择的营养物质的添加
量，以海枣曲霉培养基营养成分习惯添加量为依据，选
择正交试验的水平，表 3 和表 4 为正交试验的水平结果。
通过对菊糖酶 I/S 值的分析，确定海枣曲霉培养基营养
物质的添加量为：菊糖 2%，磷酸二氢铵 0.5%，磷酸二
氢钾 0.25%。
表3 营养成分添加量因素与水平表
Table 3 Factors and level of nutrients content
水平
因素
A(菊糖/%) B(磷酸二氢铵/%) C(磷酸二氢钾/%) D(误差)
1 3 0.75 0.5 1
2 1 0.25 0.25 3
3 2 0.5 0.75 2
表4 正交实验方案及结果
Table 4 Results of the orthogonal experiments
实验号 A B C D I/S
1 3 0.75 0.5 1 10.55
2 3 0.25 0.25 3 14.54
3 3 0.5 0.75 2 14.38
4 1 0.75 0.25 2 23.03
5 1 0.25 0.75 1 31.69
6 1 0.5 0.5 3 15.64
7 2 0.75 0.75 3 33.36
8 2 0.25 0.5 2 35.55
9 2 0.5 0.25 1 52.24
k1 13.16 22.42 20.58 31.50
k2 23.45 27.26 29.94 21.18
k3 40.38 27.42 26.48 24.32
R 27.22 5.10 9.36 10.32
2.1.3 其它发酵条件对海枣曲霉产菊糖酶的影响

图1 发酵时间对产酶的影响
Fig.1 Effect of ferment time on enzyme yield

图2 发酵温度对产酶的影响
Fig.2 Effect of ferment temperature on enzyme yield

图3 pH对产酶的影响
Fig.3 Effect of pH on enzyme yield

图4 接种量对产酶的影响
Fig.4 Effect of inoculum size on enzyme yield
不同的发酵时间、温度、pH 和接种量对海枣曲霉产
生菊糖酶活性的影响如图 1~图 4 所示。通过综合分析菊
糖酶内外切活性和 I/S 值，可以得到，海枣曲霉发酵时
间 60 h，发酵温度 28 ℃，初始 pH 值在 6.0~7.0 范围内，
接种量为 8%为发酵最理想条件。按确定的最优条件培
养海枣曲霉，得到菊糖酶粗酶液，酶活为 18.39 U/mL，
I/S 值为 45.71。
2.2 菊糖酶酶解菊糖条件优化
2.2.1 酶解温度的影响
酶解温度对菊糖水解效果的影响如图 5 所示，在较
低温度范围内，酶活力随温度升高而增大，60 ℃和
70 ℃时菊糖酶解效果达到最好，16 h 酶解率为 50.49%，
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但 80 ℃时酶活明显降低，推断是由于酶蛋白热变性导
致了催化活性的降低。

图5 温度对菊糖酶解效果的影响
Fig.5 Effect of temperature on inulin enzymolysis
2.2.2 加酶量对菊糖酶解反应的影响

图 6 加酶量对菊糖酶解效果的影响
Fig.6 Effect of additive amount of enzyme on inulin enzymolysis
不同加酶量的酶解情况随时间的变化如图 6 所示，
酶量为 2 U/g 时，30 h 后降解率达 46.3%，酶量为 14 U/g
时，酶解 8 h 降解率就可达 48.3%，尽管加酶量越大，
酶解速度越快，达到最高降解率的时间越短，但考虑到
经济因素，选用 11.0 U/g 菊糖的加酶量，水解 12 h 为宜。
2.2.3 底物浓度对菊糖酶解反应的影响

图 7 底物浓度对菊糖酶解效果的影响
Fig.7 Effect of concentration of substrate on inulin enzymolysis
不同浓度的菊糖溶液底物水解情况随时间的变化如
图 7 所示。从图中可以看出，底物浓度越大，酶解效率
越低，达到最高酶解率的时间越长。以酶解 12 h 为例，
菊糖浓度 5%降解率最高，为 49.8%，而浓度为 25%的
菊糖降解率是 20.2%。但从生产的角度来考虑，为了降
低产品浓缩的成本，底物浓度为 10%较好。
2.2.4 pH 对菊糖酶解反应的影响

图 8 pH对菊糖酶解效果的影响
Fig.8 Effect of pH on inulin enzymolysis
不同 pH 值下菊糖酶解效果如图 8 所示。从图中可
以看出，pH 在 6.0~7.0 之间菊糖酶解率较高，7.0 之后呈
下降趋势，所以最适 pH 为 6.0~7.0。
2.3 HPGPC 检测制得的低聚果糖的相对分子质量
由菊糖酶解得到的低聚果糖经 HPGPC 检测，相对
分子量如表 5 所示，图 9 为制得的低聚果糖的 HPGPC
图谱。可知，制得的低聚果糖分子量为 509，聚合度约
为 2~3。
表5 低聚果糖相对分子质量
Table 5 Formula weight of fructooligosaccharide
Rt./min Mw Mn Mp Mz D
12.371 509 442 580 682 1.15155
注：Mw 为重均分子量，Mn 为数均分子量，Mp 为峰值分子
量，Mz 为 Z 均分子量，D 为分散系数。

图9 低聚果糖HPGPC图谱
Fig.9 HPGPC analysis of fructooligosaccharide
3 结论
菊糖酶的最适发酵条件为：菊糖 2%，磷酸二氢铵
（下转第976页）
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始 pH 值 7.0、酵母粉 10 g/L、葡萄糖 20 g/L、温度
30 ℃,CALA 酶活从 20.40 U/mL 提高到了 25.62 U/mL，
提高了 25.59%，是徐同成等[6]克隆的 CALA 酶活的 1.97
倍，为以后 CALA 的工业化生产提供了参考。
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（上接第959页）
0.5%，磷酸二氢钾 0.25%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH
6.0~7.0，接种量 8%，温度 28 ℃，时间 60 h，按最优条
件得到的菊糖酶粗酶液，酶活为 18.39 U/mL，I/S 值为
45.71。菊糖酶的最适酶解条件：温度 60 ℃，加酶量 11.0
U/g 菊糖，水解 12 h，底物浓度 10%，pH 6.0~7.0。菊糖
酶解率最高达 59.3%。运用超滤法纯化菊糖酶解产物得
到低聚果糖，利用 HPGPC 测定其相对分子质量为 509，
聚合度为 2~3。
目前对于海枣曲霉发酵产菊糖酶研究较少，实验通
过查阅资料选取了几种常见的能产菊糖酶的菌种分别进
行发酵的比较研究，最后选择了产酶活力较高的海枣曲
霉进行发酵，所得粗酶液的内切酶活力和酶解能力均表
现优秀，证明海枣曲霉具有产酶活力高、方法简单、成
本低的特点，具有高度的研究价值。
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