免费文献传递   相关文献

玉蜀黍平脐蠕孢拮抗细菌YB01的鉴定及拮抗作用



全 文 : 2011,37(5):151-154  Plant Protection
收稿日期: 2010-09-03   修订日期: 2010-09-28
基金项目: 辽宁省设施蔬菜产业项目;辽宁绿丰农业技术开发中心合作项目(4130206-1103-01064508002)
* 通信作者 E-mail:yiyanli@163.com
玉蜀黍平脐蠕孢拮抗细菌YB01的鉴定及拮抗作用
韩 梅, 彭 帅, 依艳丽*
(沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳 110866)
摘要 通过形态特征、生理生化及16SrDNA同源性序列分析对玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)拮抗细菌
YB01进行鉴定,结果表明,该菌为苍白杆菌属的一种(Ochrobactrumsp.),序列号为 HQ141339。YB01对玉蜀黍平
脐蠕孢的拮抗作用研究表明:YB01培养液可以有效抑制玉蜀黍平脐蠕孢的生长、孢子的形成与萌发。显微镜观察
结果表明,用YB01培养液处理的玉蜀黍平脐蠕孢菌丝体膨大变形,细胞质发生浓缩,表明 YB01的拮抗作用主要
是通过其代谢产物影响玉蜀黍平脐蠕孢细胞壁而实现的。
关键词 玉蜀黍平脐蠕孢; 鉴定; 拮抗作用; 代谢产物
中图分类号: S 482.292  文献标识码: A  DOI: 10.3969/j.issn.0529-1542.2011.05.029
Identification of the antagonistic bacterium YB01
against Bipolaris maydis and its antagonism
Han Mei, Peng Shuai, Yi Yanli
(Colege of Land and Environment Sciences,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)
Abstract The antagonistic bacterium YB01 was identified by the characteristics of morphology,physiology,bio-
chemical tests and sequence analysis of 16S rDNA,which was identified as Ochrobactrumsp.The antifungal mech-
anism of the YB01 was investigated in this study.The results indicated that mycelial growth,spore formation and
germination of Bipolaris maydis could be inhibited by the metabolites.The mycelia affected by the metabolites al-
so showed surface nodulation and protoplasmic condensation.It is speculated that the metabolites may target at the
fungal cel wals.
Key words Bipolaris maydis; identification; antagonism; metabolite
  植物病害是制约农作物产量、降低农作物品质
的一个重要因素。化学农药是当前防治植物病虫害
的重要手段,但化学农药的使用不仅会造成环境污
染,还会使植物病原菌产生抗药性。因此,要减少化
学农药的用量,开发和研制高效安全的生物防治技
术,将是植物病害防治的趋势。植物病害生物防治
是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害
进行有效的防治技术与方法[1]。其主要作用机制是
通过拮抗微生物分泌的各种代谢产物,如蛋白酶[2]、
几丁质酶[3]、嗜铁素[4]和多种抗生素[5]等物质,对植
物病原菌产生强烈的抑制作用。
玉米是我国主要的大田作物之一。玉米小斑病
是一种由玉蜀黍平脐蠕孢引起的较严重的玉米叶部
病害。20世纪70年代,美国因大面积种植带有 T
型雄性不育细胞质的玉米杂交种,造成玉米小斑病
大流行,产量损失达165亿kg[6]。本研究对自主分
离的一株玉蜀黍平脐蠕孢的拮抗细菌YB01进行了
常规和16SrDNA鉴定,并研究其培养液对玉蜀黍
平脐蠕孢菌丝生长、菌丝形态、孢子产生和孢子萌发
的影响,为玉米小斑病的生物防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株
玉米小斑病病原菌,由沈阳农业大学微生物研
究室保藏。
2011
细菌YB01:对玉蜀黍平脐蠕孢具有较好的拮抗
作用,由沈阳农业大学微生物研究室分离和保藏。
1.1.2 培养基
PDA固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 拮抗细菌YB01的鉴定
(1)16SrDNA序列分析:采用细菌16SrDNA
扩增的通用引物fD1和rP,正向引物fD1:5′-AGA-
GTTTGATCCTGGCTCAG-3′;反 向 引 物 rP:5′-
ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。模板 DNA
运用EZ-10柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提
取。PCR扩增在50μL反应体系中进行。扩增条
件:94℃变性5min后进行35个循环(94℃1min,
55℃ 1min,72 ℃ 1min),然后72 ℃充分延伸
10min,最后4℃保存。取5μL的PCR产物在1%
琼脂糖凝胶上进行电泳检查。确定有1 500bp左右
产物之后,将PCR产物纯化后送交上海生工生物技
术服务有限公司测序。最后将测序结果在NCBI上
使用Blast程序进行同源性比对分析,向 GenBank
提交序列,并用 Mega4.1软件构建系统发育树。
(2)生理生化鉴定:参考文献[7]和[8]的方法对
YB01进行碳源利用试验。
1.2.2 YB01对病原真菌菌丝的抑制作用测定
采用菌落生长法[9]略作改动。挑取菌株 YB01
接种到装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的
250mL三角瓶中,28℃、150r/min培养48h后,离
心,用0.22μm滤膜过滤,制成无菌培养液,然后再
将无菌培养液用无菌水稀释成浓度为75%、50%和
25%的无菌培养液。分别取浓度为100%、75%、
50%和25%的无菌培养液10mL与融化的50℃的
90mL PDA 培养基混匀,立即倒平板,制成含有
10%、7.5%、5%和2.5%无菌培养液的固体培养基
平板,取直径为5mm的病原菌菌块放于培养基平
板中央,以相同体积的无菌水PDA培养基为对照,
重复处理3次,置于28℃下培养7d,每24h用十
字交叉法测量菌落直径。采用以下公式计算培养
7d时的抑菌率:
抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/
对照菌落直径×100%。
1.2.3 YB01对病原真菌孢子形成的影响
将上述培养7d的病原菌菌落用打孔器在菌落
生长边缘2~3mm 打取5mm 的菌块,放入装有
5mL灭菌水的试管中,将孢子洗脱后,用血球计数
板计数,每个平板取3块,计数3次,最后得到的平
均数为孢子数。采用以下公式计算产孢抑制率:
产孢抑制率=(对照病原菌孢子数-
处理病原菌孢子数)/对照病原菌孢子数×100%。
1.2.4 YB01对病原菌孢子萌发的抑制作用
用打孔器在病原菌菌落上打取直径5mm的菌
块,放入装有灭菌水的试管中,将孢子洗脱后,制成
孢子悬浮液并调节浓度至3×108 个/mL。采用悬
滴法[8],取孢子悬浮液50μL与等量的无菌培养液
置凹玻片中混匀,以无菌水配制的孢子悬浮液作对
照,28℃保湿培养6h,每隔1h观察孢子萌发情况
并计算孢子萌发率。
1.2.5 YB01对病原菌菌丝形态的影响
对病原菌菌丝形态的影响采用悬滴法,将在
PDA培养基中培养5d的病原菌菌丝置于加有
100μL无菌培养液中的凹玻片中28℃保湿培养。
以浸于无菌水的病原菌菌丝作为对照。在显微镜下
观察培养12h和24h时病原菌菌丝形态的变化。
2 结果与分析
2.1 拮抗细菌YB01的鉴定
表1为拮抗细菌菌株YB01的生理生化鉴定结
果。菌株的测序由上海生工生物技术服务有限公司
完成,所获得的片段大小为1 441bp,通过NCBI数
据库BLAST软件进行对比,结合生理生化特征确
定为苍白杆菌属的一种(Ochrobactrumsp.),将序
列提交到 GenBank,获得的序列号为 HQ141339。
图1为YB01的系统发育树。
表1 菌株YB01的生理生化特征1)
特征 结果 特征 结果
菌落颜色 无色 山梨醇 +
菌体形态 杆状 β-丙氨酸 +
革兰氏染色 - 蔗糖 +
接触酶 + D-纤维二糖 +
氧化酶 + D-麦芽糖 +
吲哚试验 - 纤维醇 +
明胶液化 - L-天冬氨酸 +
柠檬酸盐 + L-组氨酸 +
D-果糖 + L-亮氨酸 +
 1)+:阳性;-:阴性。
·251·
37卷第5期 韩梅等:玉蜀黍平脐蠕孢拮抗细菌YB01的鉴定及拮抗作用
图1 基于16SrDNA序列的系统发育树
2.2 YB01对病原真菌菌丝的抑制作用
运用菌落生长法测定不同浓度无菌培养液对玉
蜀黍平脐蠕孢的菌丝抑制作用,结果见图2。从结果
可以看出不同浓度的培养液对玉蜀黍平脐蠕孢的菌
丝生长均有一定的抑制作用,所含培养液的浓度越
高,抑制效果越明显。其中在含培养液浓度为10%的
PDA平板上病原真菌的生长扩张最缓慢,培养7d后
菌落直径为21mm,抑菌率达到76.4%(表2)。以上
结果说明YB01对玉蜀黍平脐蠕孢的抑制作用很可能
与其产生的代谢产物有关。
图2 不同浓度YB01培养液对玉蜀黍平脐蠕孢菌丝生长的影响
2.3 YB01对病原真菌孢子形成的影响
不同浓度的YB01培养液对玉蜀黍平脐蠕孢孢
子的形成均有影响(表2)。由结果可知,10%的培
养液对玉蜀黍平脐蠕孢的产孢抑制率达到了
55.2%,这说明 YB01产生的代谢产物不仅可以抑
制玉蜀黍平脐蠕孢菌丝的生长还对其孢子产生有很
好的抑制效果。
表2 YB01对玉蜀黍平脐蠕孢菌丝生长和孢子形成的影响1)
培养液浓度/%
7d抑菌率
/%
孢子数/
×106孢子·mL-1
产孢
抑制率/%
0 - 1.16a -
2.5  46.1d 0.99b 16.2d
5.0  53.9c 0.76c 34.5c
7.5  73.0b 0.65d 44.0b
10.0  76.4a 0.47e 55.2a
 1)采用新复极差法,每列数据标有不同的小写字母表示在0.05
水平上差异显著。
·351·
2011
2.4 YB01对病原菌孢子萌发的抑制作用
YB01对病原菌孢子萌发的抑制作用结果见图
2。由结果可知对照组孢子在培养3h时萌发率达到
了100%,而用YB01培养液处理的孢子在培养3h时
萌发率仅为22%,6h为57%,说明YB01培养液对玉
蜀黍平脐蠕孢孢子萌发具有明显的抑制作用。
图3 YB01对玉蜀黍平脐蠕孢孢子萌发的影响
2.5 YB01对病原菌菌丝形态的影响
用YB01培养液处理玉蜀黍平脐蠕孢后用光学
显微镜观察菌丝形态发现,培养12h时,玉蜀黍平脐
蠕孢部分菌丝出现膨大,局部呈瘤形,泡囊状,细胞质
浓缩(图4b)。培养24h时,大部分菌丝出现膨大,形
态出现瘤形畸形(图4d)。由以上结果可以得出,玉蜀
黍平脐蠕孢菌丝形态的变化与培养液中的YB01某些
代谢物有关,这种代谢产物能够破坏玉蜀黍平脐蠕孢
细胞壁结构,或者影响细胞壁合成,从而改变了细胞
正常的渗透压,进而发生膨大变成泡囊状。
图4 YB01培养液对玉蜀黍平脐蠕孢菌丝形态的影响
3 结论与讨论
生物防治是一种有效的植物病害防治措施,目
前国内外的研究主要集中在生物源的发掘和拮抗物
质的探索等方面。本研究鉴定了对玉米小斑病病原
菌玉蜀黍平脐蠕孢具有拮抗作用的细菌 YB01,并
详细研究了 YB01对玉蜀黍平脐蠕孢的拮抗作用,
发现YB01的代谢产物对玉蜀黍平脐蠕孢菌丝生
长、孢子形成和萌发具有抑制作用。
在观察YB01代谢产物对玉蜀黍平脐蠕孢菌丝
形态的影响时发现,经过培养液处理的菌丝发生膨
大和泡囊状变化,由此可以推断出 YB01的某些代
谢产物破坏玉蜀黍平脐蠕孢细胞壁结构,或者影响
了细胞壁合成,从而改变了细胞的通透性。邢介帅
等[2]在研究产蛋白酶生防细菌对病原真菌的拮抗作
用时发现,枯草芽胞杆菌产生的胞外蛋白酶可以使
棉花枯萎病菌菌丝发生串珠状膨大出现细胞破裂、
细胞质外渗等现象,这也与本研究所得结果相似。
此外,一些生防细菌还可以产生几丁质酶、1,3-葡聚
糖酶等水解酶,裂解病原真菌的细胞壁,从而抑制病
原真菌的生长[3,10-11]。
目前还未见苍白杆菌产生抗生素类物质的报
道,但研究发现一些植物的内生拮抗细菌中包括苍
白杆菌[12]。因此为了进一步研究YB01对病原真菌
的拮抗作用,在分离纯化抑菌代谢物的基础上,分析
其化学性质和结构,并利用高纯度的抗菌物质作用
于细胞结构,得出完整的抑菌机理,为YB01应用于
生物防治提供理论依据。
参考文献
[1] 邱德文.我国植物病害生物防治的现状及发展策略[J].植物保
护,2010,36(4):15-18.
[2] 邢介帅,李然,赵蕾,等.产蛋白酶生防细菌的筛选及其对病原
真菌的拮抗作用[J].西北农业学报,2008,17(1):106-109.
[3] Dirceu Macagnan,Reginaldo da S Romeiro,Alan W V Pomel-
la,et al.Production of lytic enzymes and siderophores,and in-
hibition of germination of basidiospores of Moniliophthora(ex
Crinipellis)perniciosa by phyloplane actinomycetes[J].Bio-
logical Control,2008,47:309-314.
[4] 田方,丁延芹,朱辉,等.烟草根际铁载体产生菌G-229-21T的
筛选、鉴定及拮抗机理[J].微生物学报,2008,48(5):631-637.
[5] 魏海雷,周洪友,张力群.抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚作为荧
光假单胞菌2P24菌株生防功能因子的实证分析[J].微生物学
报,2004,44(5):663-666.
[6] 王利智,康志钰,吴毅歆.云南省玉米小斑病菌生理小种的初
步鉴定[J].云南大学学报,2010,32(3):352-357.
(下转163页)
·451·
37卷第5期 张利斌等:药液表面张力和黏度对草甘膦药效的影响及其机理研究
度,其最佳活性区间为黏度超过14.5mPa·s,表面张
力低于31.5mN/m,液滴的铺展直径达到4.83mm,
干燥时间低于21.49min,龙葵的最大稳定持留量超
过23.18mg/cm2,稗草的最大稳定持留量超过
25.10mg/cm2,对龙葵和稗草的目测防效都可提高
42%,鲜重防效可提高42%和41%。
通过试验结果可以发现药液物理性状的改变与
药效间存在着某些相关性,与鲁梅研究结果相一
致[12]。降低药液表面张力,铺展直径增加,干燥时
间缩短,此结果与姜咏芳研究结果一致[13]。表面张
力对黏度、最大稳定持留量没有显著性影响。刘支
前曾报道展布性与药效似乎无直接关系[14],草甘膦
的叶面吸收与药液的展布性有负相关关系[15];而本
研究中铺展直径与草甘膦的生物活性成正相关,只
有在液滴的铺展直径极大的情况下,展布性才与生
物活性成负相关。增加草甘膦制剂的黏度,最大稳
定持留量增加,表面张力降低,对干燥时间和铺展直
径影响很小;草甘膦的生物活性也逐渐增加,达到最
大值后趋于平稳。
通过本研究可以说明适当地降低草甘膦制剂的
表面张力或增加黏度均可提高除草剂的生物活性。
除草剂活性能否充分发挥往往决定于雾滴在杂草叶
表面的黏着、展布、湿润、渗透与传导。不同杂草的
叶片结构及生理机制往往对药液理化性状和药液敏
感性不同[16],本研究中液滴的铺展直径、干燥时间
均采用石蜡模拟植物叶片蜡质层结构,仅能体现药
液理化性状的相对变化趋势,而不同类型的杂草对
药液物理性状和药液敏感性需进一步研究。
参考文献
[1] Tann R S,Berger P D,Berger C H.Applications of dynamic sur-
face tension to adjuvants and emulsion systems[J].Pesticide For-
mulations and Application Systems,2002,21(4):158-172.
[2] 卢向阳,徐筠,陈莉.几种除草剂药液表面张力、叶面接触角与
药效的相关性研究[J].农药学学报,2002,4(3):67-69.
[3] Frederick B R,Edward W D,James Jr S W.Surfactant blends
containing organosilicone surfactants and diphenyl oxide sulfon-
ate surfactants useful as agricultural adjuvants:Europe,
1064844[P].2001-01-03.
[4] 苏少泉,耿贺利.茎叶除草剂的吸收与助剂的使用[J].农药,
2002,41(4):9-14.
[5] Bateman R P,Douro-kpindou O P,Kooyman C,et al.Some
observation on the dose transfer of mycoinsecticide sprays to
desert locusts[J].Crop Protection,1998,17:151-158.
[6] Sharma S D,Singh M.Optimizing foliar activity of glyphosate
on Bidens frondosa and Panicum maximum with different ad-
juvants types[J].Weed Research,2000(6):523-53.
[7] 袁会珠.农药雾滴沉积流失规律以及降低容量喷雾技术研究
[D].北京:中国农业大学,2000.
[8] 华乃震.水基性农药制剂的开发和前景[J].农药,2006,45
(12):805-809.
[9] 李红军,何雄奎,曾爱军,等.用铺展系数和干燥时间来选择草
甘膦助剂[J].安徽农业科技,2007,35(12):3590-3592.
[10]牛永玲.用滴体积法测定泡沫液表面张力的试验研究[J].煤
矿安全,1996(12):13-15.
[11]袁会珠,齐淑华,杨代斌.药液在作物叶片的流失点和最大稳定
持留量研究[J].农药学学报,2000,2(4):66-71.
[12]鲁梅,王金信,王云鹏,等.除草剂助剂对药液物理性状及对磺
草酮药效的影响[J].农药学学报,2004,6(4):78-82.
[13]姜咏芳.有机硅助剂对烟嘧磺隆增效作用及其增效机理初步研
究[D].泰安:山东农业大学,2009.
[14]刘支前.农药桶混助剂的选择原理[J].农药,2002,43(9):1-3.
[15]Liu Z.Influence of surfactants on foliar uptake of herbicides
[C].Proc 18th Asian Pacific Weed Science Society Conference.
Beijing:2001:561-566.
[16]武菊英,Mathiassen S,Per Kudsk.杂草种类、叶龄及药后降
水时间对烟嘧磺隆药效的影响[J].农药学学报,2003,5(1):
櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍
77-80.
(上接154页)
[7] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版
社,2001.
[8] Peter Kampfer,Sandra Buczolits,Andreas Albrecht,et al.
Towards a standardized format for the description of a novel
species(of an established genus):Ochrobactrum gallinifaecis
sp.nov[J].International Journal of Systematic and Evolution-
ary Microbiology,2003,53:893-896.
[9] 王淑媛,王素英,涂敏勤.青霉TS67菌株活性产物的抗真菌作
用[J].微生物学通报,2008,35(9):1404-1408.
[10]Fridlender M,Inbar J,Chet I.Biological control of soilborne plant
pathogens by aβ-1,3glucanase-producing Pseudomonas cepacia
[J].Soil Biology and Biochemistry,1993,25:1211-1221.
[11]Yu T,Wang L,Yin Y,et al.Effect of chitin on the antagonis-
tic activity of Cryptococcus laurentii against Penicillium ex-
pansumin pear fruit[J].International Journal of Food Microbi-
ology,2008,122:44-48.
[12]王娜娜.拮抗性大蒜内生细菌的多样性及其促植物生长特性研
究[D].杨凌:西北农林科技大学,2010.
·361·