全 文 ：尖尾芋凝集素的纯化及性质研究
侯学文1　吴伯良2　曾仲奎3　郭　勇1
(1 华南理工大学生物工程系 , 广州 , 510641;2 暨南大学生物工程系;3 四川联合大学生物系)
摘要　报道了从天南星科植物尖尾芋(Alocasia eucullatta(Dour)Scho tt)中分离出了一种凝集素
(简称 AEL).AEL对兔血有较强的凝集效果 , 而对各型人血没有凝集作用;在 3 种糖蛋白中 , 粘液
素胃粘蛋白对 AEL的凝血活力抑制较强;AEL 对培养人外周血白细胞的转化率高达 88%, 超过
对照 PHA 的转化率;用 Sephadex G-200 柱(94 cm ×1.6 cm)测得 AEL 的相对分子质量为 36
600;用癌细胞体外培养的方法证明了 AEL 对肺腺癌细胞株 P18没有直接杀伤能力.此外 , 还探讨
了各种 pH 、温度 、变性剂等理化因子对 AEL 凝血活力的影响.
关键词　尖尾芋;凝集素;抗癌试验
中图分类号　Q 513.2
　　凝集素是多价的 、非免疫来源的糖结合蛋白(Goldstein et al , 1980).它能选择性地结合
细胞表面的糖链 ,从而导致细胞的凝聚.虽然凝集素的生理功能尚待阐明 ,但由于凝集素所
具有的糖结合专一性 、促有丝分裂活性 、凝集恶变细胞能力 、细胞毒特性等 ,已使其在生物化
学 、免疫学 、组织化学 、临床诊断与治疗等方面发挥了广泛的作用(Allison ,1986).
尖尾芋(Alocasia eucullata(Dour)Schot t)是生长在我国南方的多年生常绿草本植物.中
草药中常作狼毒使用 ,用于消肿散结(江苏新医学院 ,1977).本文从该植物中分离得到了一
种凝集素 AEL ,并对它的部份物化性质及其对癌细胞的细胞毒展开了研究.
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
　　尖尾芋采自野外并经暨南大学生物工程系吴伯良教授鉴定;Sephadex G-100 ,Sephadex
G-200为 Pharmacia产品;分子量标准蛋白为上海东风生化试剂厂产品;RPM I1640为 Sig-
ma 产品;肺腺癌细胞株 P18得自暨南大学医学院 ,其余试剂均为分析纯.
1.2　尖尾芋凝集素的提取
　　将尖尾芋根剪碎后 ,再经高速组织捣碎机打碎 ,加入生理盐水浸提过夜 ,共 3次.合并浸
提液 ,按 0%～ 30%, 30%～ 60%, 60%～ 90%(NH4)2SO4 分段盐析 ,在 4℃, 5 000 r/min离
心 20 min获得盐析沉淀 ,将各段盐析沉淀分别溶于蒸馏水 ,并装入透析袋对蒸馏水透析以
除尽(NH4)2SO4 ,经冷冻干燥得分段盐析粗品.将 30%～ 60%盐析物 200 mg 溶于 10 mL 生
理盐水 ,经 Sephadex G-100柱层析(100 cm ×2.6 cm),以生理盐水洗脱 ,流速为 0.5 mL/
min ,分部收集 3 mL/管并检测 A 280 ,共出现 4个蛋白峰 ,其中第 3 峰为活性峰 ,收集 105 ～
130管 ,共 90 mL ,将收集峰透析去盐 ,冷冻干燥后得尖尾芋凝集素(AEL)部分纯化样品.
　 1997-07-18 收稿　　侯学文 ,男 , 28 岁 ,博士
华南农业大学学报　　19(2)　1998:106～ 111
J.South China Ag ric.Univ. 　 　
1.3　凝集素AEL 的活力测定
　　按孙册等(1986)的方法 ,活力单位定义为发生凝血作用的最低滴度的倒数为每毫克蛋
白所含有的活力单位.
1.4　血型专一型检验
　　采用 2倍系列稀释法(曾仲奎等 ,1991).
1.5　寡糖的抑制作用
　　将 N-乙酰葡萄糖胺等 17种寡糖分别配成 80 mmol/L ,然后按孙册等(1986)的方法进
行糖抑制试验.
1.6　糖蛋白的抑制试验
　　分别把猪甲状腺球蛋白 ,鸡卵类粘蛋白 ,粘液素胃粘蛋白配成质量浓度为 10 g/L ,按孙
册等的方法进行.
1.7　凝胶过滤法测定相对分子质量
　　采用 Sephadex G-200(94 cm×1.6 cm)层析柱 ,按林卓坤等(1982)的方法进行.
1.8　促有丝分裂活性
　　采用健康人外周血白细胞 ,按 Brown等(1976)的方法进行 ,以 PHA为对照.
1.9　对培养癌细胞的直接杀伤活力(Avichezer et al ,1991)
　　采用肺腺癌细胞株 P18 ,癌细胞经传代培养 1 d后 ,挑选细胞长势良好的培养瓶 ,分别加
入AOL 至 4 、2 g/ L ,对照仅加入相应量的生理盐水.
2　结果与讨论
2.1　尖尾芋凝集素 AEL的纯化
　　以100 g 尖尾芋的根投料计 ,经 3步纯化
后 ,纯化倍数为 8倍 ,活力回收为 51.2%,见
表 1.凝血活力主要存在于 30% ～ 60%
(NH4)2SO4 盐析段中 ,从尖尾芋粗蛋白的凝
胶过滤图谱(图 1)来看 ,尖尾芋根中富集了大
量的 AEL. 阴影部分为活性峰(AEL)
图 1　尖尾芋粗提物的凝胶过滤图谱
表 1　从尖尾芋根中纯化 AEL的结果
步骤 蛋白干粉/g 比活力/(U·g -1) 总活力/ U 纯化倍数 产率(%)
生理盐水浸提 2.564 64 000 164 094 1 100
30%～ 60%(NH4)2SO4 盐析 0.428 256 000 109 568 4 66.8
凝胶过滤 0.082 1 024 000 83 968 8 51.2
2.2　血型专一性试验
　　结果表明 AEL对兔血具有相当高的凝血活力 ,即在 AEL 为 0.9 mg·L-1时就发生明显凝
集。而在高达1 g/L 的浓度下 ,AEL对人 A ,B ,O 3种血型均无凝集作用 ,这表明兔血球与人血
球上的糖链有相当大的差异.在凝血活力测定时 ,以发生凝血作用的凝集素的最低浓度表示 ,
107第 2期 侯学文等:尖尾芋凝集素的纯化及性质研究 　　
数值越小 ,表示凝集素的活力越高 ,以下的表示方法与此相同.所用的凝集素均为经凝胶过滤
后的样品 ,活力单位为每蛋白含 1 024 000 U.鉴于此 ,以下各项试验均以兔血为供试血球.
2.3　糖抑制试验
　　在所供试的 17种单 、双糖中 ,除了蜜二糖抑制作用稍强外 ,其余均为较弱或没有抑制作
用(表 2),表明AEL 可能属于仅对寡聚糖类作用的凝集素类.
表 2　寡糖对 AEL凝血活力的抑制作用
寡糖 ρAEL/(mg·L-1) 寡糖 ρAEL/(mg·L-1)
N-乙酰葡萄糖胺 3.7 L-山梨糖 3.7
6-脱氧半乳糖 3.7 乳糖 0.9
D-甘露糖 1.8 麦芽糖 0.9
葡萄糖 0.9 D-半乳糖 0.9
棉子糖 7.5 鼠李糖 1.8
D-树胶酯糖 1.8 纤维二糖 0.9
N-乙酰半乳糖胺 1.8 蕈糖 3.7
蜜二糖 15.5 蔗糖 1.8
D-果糖 0.9 对照 0.9
2.4　糖蛋白的抑制作用
　　在所采用的 3种糖蛋白中 ,猪甲状腺球蛋白(PTG)与猪胃粘蛋白对 AEL 的凝血活力抑
制作用较强 ,而鸡卵粘蛋白的抑制作用较弱(见表 3).表明猪甲状腺球蛋白和猪胃粘蛋白上
有可被AEL 识别的糖链结构 ,故可将二者作为亲和层析的配基来纯化 AEL.
表 3　糖蛋白对 AEL凝血活力的抑制作用
糖蛋白 猪甲状腺球蛋白 鸡卵粘蛋白 猪胃粘蛋白 对照
ρAEL/(g·L-1) 250 7.8 500 0.9
2.5　AEL的热稳定性
　　将 1 g/L 的 AEL 的分别在 20 、40 、60 、80 、
100℃水浴保温 10 min ,然后用 2%的兔血检查
AEL 的活力(Dat ta et al ,1991).结果表明 ,随着
表 4　AEL的温度稳定性
t/ ℃ 20 40 60 80 100
ρAEL/(g·L-1) 0.9 0.9 125 250 —
温度的升高 ,AEL的活力逐渐降低 ,特别在60℃保温10 min后 ,AEL的活力出现较大损失 ,表明其
热稳定性较差 ,仅在40℃的范围内稳定(见表 4).
2.6　AEL的酸碱稳定性
　　将 1 g/L 的 AEL 分别在 0.1 mol/L 的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液(pH 3 ～ 7)、0.1 mol/
L 的磷酸氢二钠 —磷酸二氢钾(pH 7 ～ 8)、0.1 mol/L 的碳酸钠—碳酸氢钠(pH 10)的 pH 梯
度处理过夜 ,次日调 pH 至 7 ,然后用体积分数为 2%的兔血检查 AEL 的活力(Datta et al ,
1991).结果表明(见表 5)AEL较耐碱而不耐酸 ,特别是在 pH 5 ～ 6之间活力出现剧烈变化.
表 5　AEL的酸碱稳定性
pH 3 4 5 6 7 8 9 10
ρAEL/(g·L-1) 125 125 62.5 0.9 0.9 0.9 0.9 3.9
108　　 华　南　农　业　大　学　学　报 第 19 卷
2.7　AEL对变性剂的稳定性
　　将盐酸胍和脲配制成以下各种浓度 ,把 1 g/ L 的 AEL 在此浓度下处理过夜 ,然后用体
积分数为 2%的兔血检查AEL 的活力.实验结果表明(见表 6),随着温变性剂浓度的提高 ,
AEL 的活力损失不大 ,表明AEL 对变性剂有良好的耐受性 ,提示在亲和层析中 ,如果没有很
好的洗脱配体 ,可以考虑采用变性剂洗脱.
表 6　 AEL对变性剂的稳定性
试剂 盐酸胍 脲
C变性剂/(mol·L-1) 0.25 0.50 1.0 2.0 0.50 1.0 2.0 3.0 6.0
ρAEL/(g·L-1) 3.9 3.9 7.8 15.6 0.9 0.9 3.9 3.9 62.5
2.8　凝胶过滤法测定相对分子质量
　　在Sephadex G-200(94 cm×1.6 cm)上
利用 5种标准蛋白求出 lgM r与有效分配系
数(K av)的关系式:K av =3.522 7 -0.627
8lgM r , r=0.989 8.在同样的层析条件下 ,经
实验得出 AEL 的 K av =0.657 ,代入上式得
相对分子质量为 36 600(见表 7).
2.9　AEL的促有丝分裂活性
　　结果表明(见表 7)AEL 是一个比 PHA
还强的促有丝分裂原 ,提示 AEL 可能在免疫
学研究中有较好的应用前景.
2.10　AEL对肺腺癌细胞株P18的直接杀伤活力
　　AEL 在所试验的两种浓度梯度 ,均未表
现出对肺腺癌细胞株 P18的直接杀伤能力 ,但
　标准蛋白:1.乳酸脱氢酶(14 000)2.牛血清白蛋
白(67 000)3.卵白蛋白(45 000)4.碳酸酐酶
(30 000)5.核糖核酸酶(13 700)
图 2　凝胶过滤法测定相对分子质量
这也不能排除 AEL 可能具有间接抗癌活性 ,特别是当我们注意到 AEL 对人外周血白细胞
的极高的转化率时 ,更应考虑到这种可能性的存在 ,因为 AEL 可能通过强化机体的免疫功
能而间接地起到抗癌作用.这一点可以通过在加入 AEL 时 ,用癌细胞和脾细胞的共同培养
来予以阐明(Avichezer et al ,1991).
表 7　AEL的促有丝分裂活性
凝集素 转化细胞数 分裂细胞数 总细胞数 转化率(%) 分裂率(%)
PHA(CK) 1 948 15 2 572 75.74 0.583
AEL 1 530 13 1 739 87.98 0.747
3　讨论
　　从尖尾芋的根中分离出了一种对兔红细胞具有高度凝集活性的凝集素 AEL ,将 AEL 初
步纯化后 ,对AEL 的多种理化性质进行了研究.表明这是一种热稳定性较差 ,但对变性剂脲
及盐酸胍 、碱性环境比较稳定的一种活性蛋白质.猪胃粘蛋白对 AEL 的凝血活力抑制最强 ,
表明猪胃粘蛋白上有 AEL 的识别糖链 ,故可将猪胃粘蛋白与活化的 Sepharose-4B偶联 ,构
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成亲和层析柱 ,作为纯化 AEL的高效手段.从糖抑制试验中可以看出 ,AEL 的识别糖基位点
可能较大 ,或可将AEL 划入识别寡聚糖凝集素类.这样在亲和层析中就不具备廉价而有效
的竞争性洗脱剂 ,鉴于AEL 对脲稳定性较高 ,可以考虑采用 8 mol/L 脲进行变性洗脱 ,然后
再透析去除脲.
促有丝分裂活性研究表明 ,AEL 是一个比 PHA还要强的促有丝分裂原 ,有助于增强免
疫功能低下的病人的免疫功能.实验中得到了较高的转率 ,而有丝分裂率却较低 ,这或许受
到了观察时间及培养条件等多种因素的制约 ,经条件优化是可以得到较高的有丝分裂率.因
为尖尾芋在医中临床上常作为抗癌药应用 ,也有报道部分凝集素对癌细胞有细胞毒作用 ,但
本实验结果表明 ,AEL 对肺腺癌细胞株 P18没有细胞毒作用 ,但不排除 AEL 对其它癌细胞
有毒杀作用 ,这可通过扩大筛选癌细胞株来进一步研究.
参 考 文 献
　　江苏新医学院.1977.中药大辞典.上海:上海人民出版社 , 18～ 19
孙　册.1986.凝集素.北京:科学出版社 , 20～ 51
林卓坤.1982.色谱法(一).北京:科学出版社 , 61
曾仲奎 ,杨成勇 , 洪　英 ,等.1991.Phaseolus lunatus linn vel aff 的种子中 A 型血专一性凝集素的研究.
四川大学学报(自然科学版), 28(2):207～ 213
A llison R T.1986.Lectins in diagnostic histopathlogy:a review.Med Lab Sci , 43:369～ 376
Avichezer D , Nechama G G.1991.Antitumoral effects of psedomonus aerugino sa lectins on lewis lung carci-
noma cells cultured in vitro without and w ith murine splenocy tes.Toxicon , 29:1 305 ～ 1 313
Brow n J M , Leon M A.1976.Isolation of a human lymphocyte mitogen from w heat germ wiyh N-actyl-D
-Glucosamine specificity.J Immunology , 117:1 976～ 1 980
Datta P K , Figueroa M O D C R , Lajolo F M , et al.1991.Purification and characerization of two major
lectins from Araucaria brasiliensis syn.Araucaria angusti folia seeds(Pinhão).Plant Physiolo gy , 97:856
～ 862
Goldstein I J , Hughes R C , Monsigny M , et al.1980.What should be called a lectin? Nature , 285:66
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A LECTIN FROM
Alocasia eucullata
Hou Xuewen
1　Wu Boliang 2　Zeng Zhongkui3　Guo Yong1
(1 Dept.of Bioengineering , South China Univ.of Technol , GuangZhou , 510641;
2 Dept.of Bioengineering , JiNan Univ.;3 Dept.of Biology , Sichuan United Univ.)
Abstract
The results reported that a lectin w as purificated f rom Alocasia eucullata(Dour)Scho tt.The
AEL had a very st rong agg lutination to rabbit blood , but had no agglutination to various human
blood , types at concentration of 1 g/L;Po rcine gast rin had the strongest inhibition ef fect to
AEL agglut ination activity among three glycoproteins used.The transformed ratio of AEL to
human lymphocy tes w as as high as 88%, but the PHA(CK)was only 75% .The relative
110　　 华　南　农　业　大　学　学　报 第 19 卷
moleculer weight of AEL w as 36 600 determined by gel filtration;In vi tro cell culture ,no direct
killing ef fect of AEL to lung adenoma strain P18 w as found.The effects of various physical-
chemical factors , such as pH 、temperature and denatural reagents , to the stabili ty of AEL w ere
also discussed.
Key words　Alocasia eucullata(Dour)Schot t;lectin;anticancer test
(上接第 85页)
STUDY ON THE RELATIONSHIP BETWEEN DROUGHT STRESS AND
ACTIVATED OXYGEN METABOLISM OF FLOWERING CHINESE
CABBAGE(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis)LEAVES
Yang Xian　Guan Peicong
(Dept.of Hortic., South China Ag ric.Univ., Guangzhou , 510642)
Abstract
Effects of drought st ress on plant g row th , activit ies of AP , SOD , CAT and POD , ASA con-
tent , MDA level and autoxidation rate in flowering Chinese cabbage leaves were studied.The
results showed that w ith the t ime and intensi ty of drought st ress , activities of AP and POD ,
MDA content and autox idat ion rate increased gradually , while activity of SOD and ASA con-
tent decreased g radually .Activity of CAT under lighter drought stress increased sharply , but
under higher drought stress above 4 day s it decreased rapidly .When the drought st ress w as re-
moved and restored to supply w ater 2 days , act ivit ies of AP , POD and CAT , ASA content ,
MDA level and autoxidation rate decreased g radually , but activity of SOD increased rapidly .
The data suggested that the equilibrium systems of activated oxygen eliminated were destroy ed
in f lowering Chinese cabbage leaves because of drought st ress , and membrane lipid peroxidation
w as enhanced and the g row th and development of plant w as inhibited markedly.
Key words　flowering Chinese cabbage;drought stress;activated oxygen metabolism;mem-
brane lipid peroxidation
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