全 文 ：北方园艺 2011(09):197 ～ 201 ·食用菌 ·
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Effect ofOxalic Acid on the Vase Life of Gerbera jamesonii Bolus Cut Flower
ZHANG Lin-qing
(Huaiyin Institute of Technology , Huaian , Jiang su 223003)
Abstract:Taking stalk of Gerbera jamesonii Bolus cut flow er as test materials , the effect of different concentrations of
oxalic acid preservatives on the vase life and flowering quality of Gerbera jamesoni i Bolus cut flow ers were studied.The
results showed that adding the concentrations of oxalic acid with 50 mg/ L improved the flower diameter of Gerbera
jamesonii Bolus cut f lowers effectively , and delays the flower diameter tobe max , maintains the w ater balance of cut
flower.Meanwhile ,it delays the decreasing of soluble carbohydrate content and soluble protein concentrations , inhibits
the increasing of MDA content , and thus increased the vase life and postharvest quality of Gerbera jamesonii Bolus cut
flowers.
Keywords:oxalic acid;Gerbera jamesonii Bolus;vase life;preservation
第一作者简介:李仲芳(1963-),女 ,教授 ,硕士生导师 ,现主要从事
园艺方面的研究工作。 E-mail:fangming9039@126.com
基金项目:乐山市科技重点研究计划资助项目(09N2D007)
收稿日期:2011-03-14
棘托竹荪深层发酵胞外酶活性的研究
李 仲芳 , 李冬琳
(乐山师范学院 ,峨眉山生物多样性保护与利用研究所,四川乐山 614000)
　　摘　要:以棘托竹荪菌株为试材 ,采用液体培养的方法研究棘托竹荪深层发酵过程中 6种胞
外酶的酶活性变化 ,并对菌丝生物量进行了测定。结果表明:酶活性与菌丝生物量增长有密切关
系。菌丝生物量增加呈“S”曲线 ,第 4 ～ 6天增长最快。棘托竹荪菌丝生物量达到最大值之前 ,羧
甲基纤维素酶和淀粉酶活性出现峰值。过氧化物酶 、漆酶 、多酚氧化酶和蛋白酶的活性与菌丝生
物量同步增加。说明发酵过程中棘托竹荪菌丝首先分解利用淀粉和纤维素 ,然后利用木质素和
蛋白质作为碳源和氮源。要提高棘托竹荪深层发酵效率 ,缩短培养周期 ,就必须在其菌丝达到最
大生物量之前保证碳源和氮源的均衡供给。可根据不同酶的分泌高峰期 ,确定菌丝的营养利用
情况和发酵周期 ,以收获最大菌丝生物量。
关键词:棘托竹荪;菌丝;胞外酶
中图分类号:S 646.8 　文献标识码:A 　文章编号:1001-0009(2011)09-0197-05
　　棘托竹荪(Dictyophora echinovolvata)属担子菌亚 门腹菌纲鬼笔科竹荪属 ,是一种名贵的食药用真菌 ,不
仅香气浓郁 ,脆嫩爽口 ,还有降血脂、降胆固醇 ,延缓食
品腐败等功效 ,主要分布于四川 、湖南 、贵州等南方地
区[ 1] 。在自然条件下其生长发育所利用的主要原料是
腐竹 、腐木等不溶于水或难溶于水的纤维素、半纤维素、
木质素等高分子物质 ,这些物质必须被竹荪产生的胞外
酶降解才能吸收利用。所以 ,在竹荪人工培养过程中可
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·食用菌· 北方园艺 2011(09):197～ 201
向培养基中分泌多种胞外酶[ 2] ,胞外酶活性大小与食用
菌种类 、生长发育状态和培养基质等因素密切相关。
目前 ,对于竹荪的研究大多集中在竹荪液体发酵所
需的 C 、N源 、无机盐等营养条件和理化条件的探索及多
糖提取方面[ 3-5] ,其中对培养产物的抑菌作用也有研究
报道[ 6] 。与香菇 、侧耳等相比 ,竹荪的液体发酵培养相
对较难 ,对竹荪液体发酵过程生理生化方面的基础研究
较少 ,尚未见到对竹荪液体培养胞外酶活性变化规律的
研究。
现采用摇瓶对棘托竹荪进行深层发酵培养 ,研究培
养过程中羧甲基纤维素酶 、淀粉酶 、蛋白酶 、漆酶 、多酚
氧化酶 、过氧化物酶的活性大小和动态变化规律 ,及其
与竹荪菌丝体生物量的关系 ,为提高竹荪深层液体发酵
效率 ,缩短培养周期提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　供试菌株　棘托竹荪菌株从四川绵阳食用菌研
究所引进。
1.1.2 　培养基　活化培养基:牛肉膏蛋白胨培养基;种
子培养基:竹屑(过 40目筛)97%、白糖 1.2%、K2HPO4
0.2%、MgSO4 0.1%、石膏粉 1.5%,含水量55%～ 60%,
pH自然;深层发酵培养基:葡萄糖 20 g 、玉米粉(过100
目筛)30 g 、KH2PO4 2 g、MgSO4 1 g 、VB1 10mg 、水 1 000
mL。pH 自然。
1.2　试验方法
1.2.1　母种活化培养　将棘托竹荪菌接种于活化培养
基试管斜面上 ,28℃恒温黑暗培养 8 d ,菌丝长满培养基
表面后待用。
1.2.2　种子培养基制作　将种子培养基按配方配制 ,装
入250 mL三角瓶至 2/3处 ,高压灭菌后接种已活化的
竹荪母种 ,长满三角瓶待用。
1.2.3　深层发酵培养　按发酵培养基配方配制液体培
养基 ,注入250 mL的三角烧瓶 ,每瓶装 100 mL ,高压灭
菌后 ,将长满菌丝的种子培养基挖块 ,充分压细碎 ,每个
培养瓶接种 1小勺(约 10 mg),接种后摇匀 ,在28℃恒温
黑暗静置培养 24 h后 ,置摇床 28℃恒温黑暗培养 ,振荡
频率为140 r/min。深层培养过程中 ,每天测定菌丝体干
重和菌球直径 、发酵液 pH 值 ,每 12 h做相关酶活性测
定。菌丝体干重的测定 ,即每天随机抽取 1瓶将菌丝体
过滤 ,清水洗涤数次 ,80℃烘干至恒重 ,称量;菌球直径测
定[ 8] ,培养第 1～ 2天每天从摇瓶中吸取发酵液 ,用测微
尺随机测定1个视野的菌球大小 ,求平均值。从第 3天
开始随机抽取发酵液中 10个菌球 ,在培养皿中排成一
列 ,测总长度 ,求平均值。
1.3　酶活性的测定
每 12 h ,取发酵液 10 mL ,4℃,4 000 r/min条件下
离心 10 min ,取上清液 ,即为粗酶液。
1.3.1　淀粉酶活性测定[ 7] 　向试管中加入 0.5%的可
溶性淀粉溶液 0.5 mL ,样品管加粗酶液 0.5 mL ,混匀 ,
38℃恒温水浴保温 30 min ,取出立即加入 DNS 试剂
0.75 mL(对照管加入 DNS后再加入 0.5 mL 酶液),沸
水浴5 min ,取出立即冷却 ,加蒸馏水10 mL ,摇匀 ,于520
nm 测 OD值 ,依据葡萄糖标准曲线(Y =406.47X +
13.58 , R2 =0.95)求得还原糖量。每组 3次重复 ,求平
均值。定义每30 min内底物被水解生成 1μg 葡萄糖所
需的酶量为1个酶活力单位(U)。
1.3.2　羧甲基纤维素酶(CMC 酶)活力测定[ 8-9] 　向试
管中加入 0.5%的 CMC-Na溶液 0.8 mL ,样品管加粗酶
液 0.2 mL ,50℃恒温水浴保温 30 min ,取出立即加入
DNS试剂 0.75 mL(对照管加入 DNS后再加入0.2 mL
酶液),沸水浴 5 min ,取出立即冷却 ,加蒸馏水10 mL ,摇
匀 ,于 520 nm 测 OD 值 ,依据葡萄糖标准曲线(Y =
406.47X+13.587 , R2 =0.95),求得还原糖量。每组 3
次重复 ,求平均值。定义每 30 min内CMC酶水解生成
1 μg 葡萄糖的所需的酶量为 1个酶活力单位(U ,1U=
葡萄糖 1μg ·(30 min)-1 ·mL-1发酵液)。
1.3.3　过氧化物酶活性的测定[ 10] 　向样品管中加入粗
酶液 1.0 mL ,对照管中加入煮沸的粗酶液 1.0 mL ,再分
别加入过氧化物反应混合液 3.0 mL ,倒入比色皿 ,立即
开启秒表计时 ,测定 470 nm的OD值。以煮沸的酶液作
对照 ,每组3次重复 ,求平均值。
1.3.4　多酚氧化酶活力测定[ 11] 　取 0.5 mL ,10 mM邻
苯二酚作为底物 ,加人 pH 6.0的0.05 M 磷酸缓冲溶液
3.4 mL ,加人 0.1 mL粗酶液 ,28℃水浴准确保温 30 min
后 ,410 nm处测OD值 ,以煮沸的酶液作对照 ,每组 3次
重复 ,求平均值。
1.3.5　漆酶活性测定[ 12] 　向试管中加入 3.36 mM 邻
联甲苯胺0.5mL ,pH 4.6的 0.1M 乙酸缓冲液3.0 mL ,
样品管中加入粗酶液0.5 mL ,对照管中加入煮沸的粗酶
液 0.5 mL ,28℃恒温水浴保温30 min ,取出后立即于600
nm 测OD值。每组 3次重复 ,求平均值。过氧化物酶、
多酚氧化酶和漆酶活力以每分钟引起0.001个 OD值改
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变所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
1.3.6　蛋白酶活性的测定　蛋白酶活性的测定参照文
献[ 10] 的方法 ,Tyr 标准曲线回归方程为:Y =122.42X-
2.1105 , R2 =0.99。取 4支试管 ,分别加入 1 mL稀释酶
液 ,其中1支为空白管 ,3支为平行试验管。置入40℃水
浴中预热 3 ～ 5 min ,在 3支平行试管中分别加入1 mL
2%酪蛋白溶液 ,准确计时保温 10 min。立即加入2 mL
0.4M三氯乙酸溶液 ,摇匀并静置过滤。分别吸取1 mL
上清液 ,加5 mL 0.4M 碳酸钠溶液 ,最后加入1 mL Fo-
lin-酚试剂 ,摇匀 ,于 40℃水浴中显色 20 min ,于660 nm
测OD值。对照试管测定方法同上 ,在加酪蛋白之前先
加0.4 M三氯乙酸2 mL ,使酶失活 ,再加入酪蛋白。定
义每 10 min催化蛋白酶水解生成1μg酪氨酸的酶量为
1个酶活力单位(1 U=酪氨酸1μg ·(10 min)-1 ·mL-1
发酵液)。
2　结果与分析
2.1　棘托竹荪深层发酵过程生物量的变化
为了解棘托竹荪菌丝体在深层发酵过程中的生长
变化情况 ,连续测定7 d内菌球直径 、菌丝体干重及发酵
液的 pH 值 ,结果见表 1和图 1。由表1和图 1可看出 ,
在深层发酵过程中 ,棘托竹荪的菌球直径和干重随培养
天数的增加而增加 ,发酵液的 pH 则随着培养天数的增
加而下降。菌丝体的干重增加呈S 曲线 ,表现出典型的
适应期 、对数增长期和稳定期。在初始培养的 1 ～ 3 d增
长缓慢 ,4 ～ 6 d快速增长 ,7 d趋于平缓 ,但尚未开始衰
亡。培养初期菌球表面致密光滑 ,后期菌球表面呈星芒
状(图 5)。培养后期 ,发酵液 pH 值的不断下降对菌丝
生物量的增加有抑制作用 ,这可能是由于较低的 pH影
响棘托竹荪所分泌各种酶的活性 ,加之培养基营养物质
消耗而影响了棘托竹荪自身物质的合成 ,使得菌丝干重
达一定值时不再快速增加。
　　表 1 深层发酵过程生物量及 pH的变化
培养天数/d 1 2 3 4 5 6 7
菌球直径/mm 0.35 0.87 2.27 3.46 4.59 5.60 6.12
菌丝体干重/ g 0.0282 0.0439 0.1252 0.2641 0.3971 0.4748 0.5145
发酵液pH 5.6 5.4 5.1 4.7 4.6 4.4 4.3
2.2　CMC酶和淀粉酶活性变化
纤维素和淀粉都是作为棘托竹荪的碳源的大分子
物质。CMC酶属于纤维素酶系中的一种 ,可以将纤维
素分解为葡萄糖供菌体利用。同样 ,淀粉在淀粉酶等一
系列酶的作用下可水解为葡萄糖等小分子物质供菌体
利用。在液体发酵过程中CMC酶和淀粉酶活性变化与
图1　深层培养过程菌丝生物量的变化
棘托竹荪菌丝生物量的增加密切相关(图2)。从总体酶
活性趋势来看 , CMC酶和淀粉酶活性变化基本一致 ,
CMC酶活性相对于淀粉酶变化幅度小 ,淀粉酶总体活
性略高于 CMC 酶。棘托竹荪菌丝生物量的增加随
CMC酶 、淀粉酶的活性增强而增加 ,即在生物量达到最
大值之前 ,CMC 酶和淀粉酶的活性出现峰值。培养的
3 d起活性明显增强 ,4 d时酶活性达到最大 ,之后逐渐下
降。这说明CMC酶和淀粉酶的大量分泌 ,将纤维素和
淀粉分解为葡萄糖 ,为菌丝快速生长提供足够的碳水化
合物。
图 2　淀粉酶和 CMC酶活性与培养天数的关系
2.3　过氧化物酶 、漆酶和多酚氧化酶活性变化
过氧化物酶 、漆酶 、多酚氧化酶是木质素分解酶系
的主要成员 ,其活性大小可以用来衡量菌株对木质素的
降解能力。在棘托竹荪深层发酵过程中 ,3种木质素分
解酶的活性变化(图 3)。这3种酶的活性变化趋势较为
一致 ,在培养2 d起活性增加明显 ,4 ～ 6 d活性很强 ,比
CMC酶和淀粉酶的峰值出现稍晚 ,这说明棘托竹荪菌
丝首先利用的是淀粉和纤维素作为碳源 ,然后才利用木
质素。当培养 5 ～ 6 d ,淀粉和纤维素已被大量利用 ,淀
粉酶和 CMC酶活性下降时 ,漆酶等大量形成 ,棘托竹荪
开始利用液体培养基中的木质素作为碳源。
2.4　蛋白酶活性变化
蛋白酶的作用是分解蛋白质的肽键 ,使其分解为小
分子的蛋白胨 、小肽或氨基酸。当培养基中氮源减少的
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图 3　漆酶 、过氧化物酶和多酚氧化酶的活性
情况下 ,食用菌为获得蛋白质中的氮素而分泌蛋白酶。
随着氮源不断减少 ,蛋白酶会被大量诱导出来 ,故在菌
丝生长阶段蛋白酶活性会呈现逐步升高的趋势[ 13] 。由
图4可知 ,棘托竹荪在深层发酵培养 2 d时就显示出较
强活性 ,随着菌丝生物量的增加逐步增强 ,5 d时达到最
大值 ,7 d时仍然保持相对较高的水平 ,这就为菌丝的快
速生长提供充足的氮源。
图 4　蛋白酶活性与培养天数的关系
图 5　棘托竹茜 、深层培养过程
注:①突破菌蕾的棘托竹荪;②已撒裙的棘托竹荪;③棘托竹荪的菌蕾;④
深层发酵过程中的棘托竹荪菌丝球
3 　结论
棘托竹荪深层发酵过程中 ,6种胞外酶即羧甲基纤
维素酶 、淀粉酶 、蛋白酶 、漆酶 、多酚氧化酶 、过氧化物酶
活性变化与菌丝生物量增长有密切关系。生物量增加
呈 S曲线 ,4 ～ 6 d时增长最快。棘托竹荪菌丝生物量的
增加随 CMC酶 、淀粉酶的活性增强而增加 ,在菌丝生物
量达到最大值之前 ,羧甲基纤维素酶和淀粉酶活性出现
峰值。过氧化物酶、漆酶 、多酚氧化酶和蛋白酶的活性
与菌丝生物量同步增加。这说明发酵过程中棘托竹荪
菌丝首先分解利用淀粉和纤维素 , CMC 酶和淀粉酶的
大量分泌 ,将纤维素和淀粉分解为葡萄糖 ,为菌丝快速
生长提供足够的碳源。当培养 5 ～ 6 d ,淀粉酶和 CMC
酶活性下降时 ,漆酶 、过氧化物酶 、多酚氧化酶和蛋白酶
大量形成 ,棘托竹荪开始利用液体培养基中的木质素和
蛋白质作为碳源和氮源。因此 ,在棘托竹荪深层发酵过
程中 ,要提高棘托竹荪菌丝生物量 ,就必须在液体培养
的 4 ～ 6 d时菌丝达到最大生物量之前保证碳源和氮源
的均衡供给。这样才能提高深层液体发酵效率 ,缩短培
养周期。还可以根据不同酶的分泌高峰期 ,确定菌丝的
营养利用情况和发酵周期 ,以收获最大菌丝生物量。
4 　讨论
试验在棘托竹荪深层培养过程中虽未在液体培养
基中加入纤维素 、木质素和蛋白质 ,但均能测出胞外羧
甲基纤维素酶 、蛋白酶、漆酶 、多酚氧化酶 、过氧化物酶
的活性 ,这可能是由于液体培养基中添加玉米粉的
缘故。
在试验中 ,培养到7 d时生物量仍持续增加 ,这可能
是由于深层发酵用培养基接种的竹屑菌种分散性好 ,可
以多点萌发 ,形成的菌球体积小 、数量多 ,众多的菌丝球
能增加外围生长区域体积 ,充分利用培养液中的营养物
质 ,获得更大的菌丝生长量 ,且菌丝球内部不易积累过
多的代谢产物或氧浓度过低而自溶。棘托竹荪深层发
酵的最大效率期与发酵终点有待进一步研究。
发酵液的pH值随培养天数的增加而降低 ,菌丝干
重增加减缓 ,这与竹荪菌丝体在培养过程中酸性代谢产
物积累 ,发酵液中营养物质减少 ,pH 值下降 ,胞外酶活
性下降 ,培养环境恶化使菌丝体自身异化作用增强
有关。
胞外酶是菌丝体在发酵过程分泌到液体培养基中
的活性物质 ,它的变化一定程度上可以表明菌丝体分解
利用营养物质的能力大小及其生长状况。羧甲基纤维
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素酶 、淀粉酶 、漆酶 、多酚氧化酶、过氧化物酶的活性变
化反应棘托竹荪菌丝体对碳源的利用状况。蛋白酶活
性的变化可以反应菌丝体对氮源的利用状况。这些酶
的活性与棘托竹荪菌株深层发酵的高产性能有关。
该试验初步研究棘托竹荪深层培养胞外酶的活性 ,
对了解其胞外羧甲基纤维素酶 、淀粉酶 、蛋白酶 、漆酶 、
多酚氧化酶 、过氧化物酶分泌特点 、活性大小及动态变
化趋势 ,推测棘托竹荪在液体培养不同生长发育阶段对
培养基中天然木质素 、纤维素 、淀粉等大分子营养成分
的降解动态 ,提高深层培养效率有重要的意义。对于液
体培养基中的营养物质组成、温度 、pH 值等环境条件对
棘托竹荪的胞外酶活性的影响有待进一步研究。
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Study on Extracellular Enzyme Activity fromDictyophora
echino-volvata Zane during Submerged Fermentation
LI Zhong-fang , LI Dong-lin
(Institute of Biodiversity Conservation and Utilization in Mount Emei , Leshan Normal University , Leshan , Sichuan 614000)
Abstract :Bacterial strain of Dictyophora echino-volvata Zane was used as test material , the activity variation of six
extracellular enzymes from Dictyophora echino-volvata Zane during submerged fermentation was studied , by the
methods of liquid culture , and the biomass of mycelium were determined.The results showed that the enzyme activity
was closely related with the mycelium biomass.Increase in mycelum biomass w as of `S curve , and the fastest growth of
the mycelium occurred at earlier developmental stage , especially the first 4～ 6 days.The biomass of mycelium reaches its
maximum after the enzyme activity peak of carboxymethyl cellulose enzyme and amylase , whereas the activity of other
four enzymes increased simultaneously with that of the mycelial biomass of D.echino-volvata.Zana These findings
demonst rated that the mycelium deomposed starch and cellulose first during fermentation , then lignin and protein were
used as their C and N sources.To promote the fermentation efficiency and the reduction of culture period , sufficient C
and N sources will be provided before the maximum biomass of mycelium came out.To achieve the maximum mycelium
biomass , nutrition allocation and fermentation cycle of the mycelium should be considered based on the activity peak time
of different enzymes.
Keywords:Dictyophora echino-volvata Zane;mycelium;ex tracellular enzyme
201