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棘托竹荪菌盖多糖的提取
及体外抗氧化活性的研究
范巧宁，张伟刚，赵 珮，李清宇，张颖娜，田 甜，段玉峰*
(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710062)
摘 要:本研究采用热水浸提法提取棘托竹荪菌盖多糖。在单因素实验的基础上，利用响应曲面法优化提取条件，并
采用还原能力、超氧阴离子自由基的清除能力、DPPH自由基的清除能力、羟自由基的清除能力作为棘托竹荪菌盖多糖
的体外抗氧化作用评价的四个指标，并同 VC 进行了比较。结果表明，棘托竹荪菌盖多糖的最佳提取工艺条件:提取温
度为 95℃，料液比为 1∶39g /mL，提取次数为 3 次，提取时间为 3.5h，在此条件下多糖得率为 12.13%。抗氧化实验表明，
棘托竹荪菌盖多糖具有良好的还原能力和自由基清除能力，是一种抗氧化活性高的物质。
关键词:棘托竹荪，多糖，响应面，抗氧化活性
Extraction and antioxidant activity in vitro of polysaccharides
from Pileus of Dictyophora echinovolvata
FAN Qiao－ning，ZHANG Wei－gang，ZHAO Pei，LI Qing－yu，ZHANG Ying－na，TIAN Tian，DUAN Yu－feng*
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)
Abstract:Hot water extraction was applied in the experiment to extract polysaccharides from pileus of Dictyophora
echinovolvata. The optimal extraction conditions were obtained through single factor test and response surface
methodology(ＲSM). Besides，antioxidant activity of the polysaccharides in vitro was investigated by using
reducing power，superoxide radical assay，DPPH·scavenge，activity and hydroxyl radical assay，using Vitamin C
as a positive control. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows:extraction
temperature 95℃，ratio of material to solvent 1 ∶ 39g /mL，extraction times 3，extraction time 3.5h. Under these
conditions，the yield of polysaccharides was 12.13% . The antioxidation experiments indicated that the
polysaccharide had a good reducing power and free radical scavenging activity，Dictyophora echinovolvata was a
substance with high antioxidant activity.
Key words:Dictyophora echinovolvata;polysaccharide;response surface;antioxidant activity
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2013)23－0112－06
收稿日期:2013－04－22 * 通讯联系人
作者简介:范巧宁(1989－) ，女，在读硕士研究生，研究方向:天然活性
成分及食品功能成分的研究。
基金项目:陕西省科学自然基金项目(2012JM3014)。
棘托竹荪(Dictyophora echinovolvata)隶属于真菌
门、担子菌亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、竹荪属，是
我国科学工作者 1986 年在湖南省会同县首次发现，
于 1988 年定名的新种［1］。以后陆续在我国南方的贵
州、福建、浙江、广西、广东及海南等省份发现。棘托
竹荪是一种极为名贵的食药两用菌，被称为“疱厨之
珍”、“药房之宝”，其食味鲜美、香气浓郁、营养丰富，
历代宫廷用作御膳［2］。目前，对棘托竹荪的研究主要
集中在其栽培技术［3］、生物学特性［4］、多糖［5］的提取、
化学成分的分析与分离［6－11］、生物活性［10－11］等方面。
对其抗氧化性的研究较少，本文采用热水浸提法提
取了棘托竹荪菌盖粗多糖，对其提取工艺条件进行
了优化，并对其体外抗氧化活性进行研究，为棘托竹
荪菌盖多糖的开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
棘托竹荪菌盖 购于福建三明，由中国科学院
昆明植物所鉴定。
1，1－二苯基－2－苦苯肼自由基(DPPH·) 分析
纯，美国 Sigma 公司产品;三羟基甲基氨基甲烷
(Tris)、邻苯三酚(焦性没食子酸)、三氯化铁
(FeCl3)、六氰合铁化钾( ［K3Fe(CN)6］)、三氯乙酸
(TCA)、苯酚、浓硫酸、乙醇(95%)、抗坏血酸(VC)、
磷酸二氢钠、磷酸氢二双氧水、硫酸亚铁、水杨酸、盐
酸 均为国产分析纯。
AL204 型电子天平 梅特勒－托利多仪器(上
海)有限公司;ＲE52－3 旋转蒸发器 上海沪西分析
仪器有限公司;SHA－e 型恒温振荡器 金坛市富华
仪器有限公司;722 型可见分光光度计 上海光谱仪
器有限公司;KQ－200KDE型超声波清洗器 昆山市
超声波仪器有限公司;T6 新世纪紫外－可见分光光
113
表 1 单因素水平
Table 1 Single factor
因素 水平
X1 提取温度(℃) 70 75 80 85 90 95 100
X2 料液比(g /mL) 1∶25 1∶28 1∶31 1∶34 1∶37 1∶40 1∶43
X3 提取次数 1 2 3 4 5 － －
X4 提取时间(h) 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
度计 北京普析通用仪器有限责任公司;HH－8B 型
数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;HHW－21CU
－600 型电热恒温水槽 上海福玛实验设备有限公
司;800B型离心机 上海安亭科学仪器厂;FD－1 冷
冻干燥机 北京博医康技术公司。
1.2 实验方法
1.2.1 棘托竹荪菌盖粗多糖提取工艺 棘托竹荪菌盖
→烘干(烘箱 60℃)→粉碎(过 40 目筛)→脱脂→热水浸提→
离心→取上清液→浓缩→95%乙醇沉淀→离心→沉淀物→
无水乙醇洗涤→冷冻干燥→粗多糖［12］
1.2.2 棘托竹荪多糖含量的测定 采用苯酚－硫酸
法测定，参照文献［13］。多糖得率计算公式为:
得率(%)= C × VM × 100 式(1)
式(1)中，C:提取液中粗多糖浓度;V:提取液总
体积;M:提取所用的棘托竹荪菌盖质量。
1.2.3 单因素实验 按 1.2.1 中方法进行多糖提取。
单因素实验设定提取温度:70℃、提取时间:3.5h、料
液比:1 ∶37g /mL、提取次数:3 次。固定其中三个因
素，测定不同因素对多糖得率的影响，各因素选取的
水平如表 1 所示。
1.2.4 棘托竹荪多糖提取响应面优化实验设计 根
据单因素实验结果，以影响棘托竹荪菌盖多糖得率
的主要因素为变量，以多糖得率为响应值，采用响应
面 Box－Behnken 的实验设计方法［14］，对热水浸提法
提取棘托竹荪菌盖多糖工艺实验结果进行参数优
化，实验方案如表 2。
表 2 实验设计的因素水平表
Table 2 Factors and levels of experimental design
水平
因素
X1 提取温度
(℃)
X2 料液比
(g /mL)
X3 提取次数
X4 提取时间
(h)
－ 1 90 1∶34 2 3
0 95 1∶37 3 3.5
+ 1 100 1∶40 4 4
1.2.5 棘托竹荪菌盖多糖体外抗氧化活性的测
定 在最佳的工艺条件下，按 1.2.1 中方法进行棘托
竹荪菌盖多糖的提取。棘托竹荪菌盖多糖待测液的
配制:准确地将棘托竹荪菌盖多糖配成浓度为
1.0mg /mL的溶液，然后根据每组实验用超纯水将该
溶液稀释成 7 种不同浓度。
1.2.5.1 棘托竹荪多糖总还原能力的测定 还原力
的测定是用来评价抗氧化剂活性的常用方法［15］，于
2.5mL不同浓度的棘托竹荪多糖溶液中加入 2.5mL、
0.2mol /L、pH6.6 的磷酸盐缓冲液和 2.5mL、1%的铁
氰化钾溶液，50℃水浴 20min，急速冷却至室温。加
入 2.5mL、10%的三氯乙酸(TCA)溶液，3000r /min 离
心 10min，取上清液 5mL，加入 4mL 蒸馏水，再加入
1mL FeCl3(0.1%) ，混匀，静置 10min，于 700nm 处测
定吸光值。以 VC 为对照，每组做 3 个重复，求其平
均值。
1.2.5.2 棘托竹荪对超氧阴离子自由基(O －2·)清除
能力的测定 采用邻苯三酚自氧化法［16］。取 Tris－
HCl缓冲溶液 4.5mL，在 25℃恒温水浴中保温 20min，
加入邻苯三酚(25℃预热) ，快速振荡混匀，在 325nm
波长下，每隔 0.5min记录一次值，连续记录 3min。样
品在同样条件下测定吸光值。以 VC 为对照，每组做
3 个重复，求其平均值。计算公式如下:
清除率(%)=
A0－A
A0
× 100 式(2)
式(2)中:A0－邻苯三酚的自氧化速率;A－加入多
糖样品后邻苯三酚的自氧化速率。
1.2.5.3 棘托竹荪对(DPPH·)有机自由基的清除能
力的测定 二苯代苦味酰基自由基(DPPH·) ，常用
来评估抗氧化物的供氢能力［17］。于 1mL不同浓度的
棘托竹荪菌盖多糖溶液加入 3mL 2 × 10 －4 mol /L
DPPH溶液(用 95%乙醇配制) ，充分摇匀，室温静置
35min。然后在 517nm 处测定吸光值，以 VC 作阳性
对照，以 95%乙醇调零，每个处理试样均做三个平行
实验，按下式计算各试样对 DPPH·的清除率:
清除率(%)= 1－
A1－A2
A( )0 × 100 式(3)
式(3)中，A1:加入样品后的吸光值;A2:样品本
底吸光值;A0:空白吸光值。
1.2.5.4 棘托竹荪对羟自由基(·OH)的清除能力的
测定［18］ 利用 Fenton 反应产生的羟基自由基可氧化
水杨酸，使水杨酸产生有色物质，在 510nm 处有强吸
收峰。于 2mL不同浓度的棘托竹荪菌盖多糖溶液中加
入 2mL FeSO4 溶液(6mmol /L)、2mL H2O2(6mmol /L)溶
液，充分摇匀，静置 10min。加入 6mmol /L 的水杨酸
溶液 2mL，充分摇匀，静置 30min，在 510nm处测定其
吸光度值。阴性对照不加样，以蒸馏水代替。以 VC
作阳性对照，每个处理试样均做三个平行实验。
计算公式:
清除率(%)= 1－
A1－A2
A( )0 × 100 式(4)
式(4)中，A1:加入样品后的吸光值;A2:样品本
底吸光值;A0:空白吸光值。
2 结果与讨论
2.1 多糖的测定
测定葡萄糖含量标准曲线如图 1，线性回归方程
114
为:Y =0.1677X－0.0171，相关系数 Ｒ2 = 0.9994。
图 1 葡萄糖含量标准曲线
Fig.1 Standard curve of polysaccharide
2.2 单因素实验
2.2.1 料液比对棘托竹荪菌盖多糖得率的影响 结
果表明，料液比在 1∶25g /mL 至 1∶37g /mL 范围内，棘
托竹荪多糖得率随着料液比的增加逐渐提高，当料
液比大于1∶37g /mL时，多糖得率有下降趋势。主要
是由于液固两相存在溶解平衡和吸附平衡，低温有
利于吸附，当料液比增大时，产生相同热量的条件
下，提取液的温度下降，吸附作用增强导致得率下
降。因此，料液比应选择 1∶34、1∶37、1 ∶40g /mL 三水
平作为优化的参数。
图 2 料液比对棘托竹荪菌盖多糖得率的影响
Fig.2 Effect of ratio of water to raw material
on the polysaccharide yield
2.2.2 浸提时间对棘托竹荪菌盖多糖得率的影
响 结果表明，随着提取时间的延长，棘托竹荪菌盖
多糖的得率不断提高，并且在 3.5h 时达到最大值;原
因可能是随着时间的增加，溶解出的蛋白质等其他
杂质等也会增加，进而增加多糖溶液的粘度，使分离
和纯化的难度增加，并且在较高的温度下浸提提取
时间过长会导致多糖的降解和变性，反而使多糖的
得率下降。因此选定 3、3.5、4h 三个浸提时间水平为
优化的参数。
2.2.3 浸提温度对棘托竹荪菌盖多糖得率的影
响 结果表明，提取温度在 70℃至 95℃范围内，棘托
竹荪菌盖多糖的得率随着浸提温度的增加不断提
高，温度高于 95℃时，得率有所下降。一般来说，提
取温度的提高，就会通过增加溶剂分子和溶质分子
的运动，促进扩散作用，从而有利于提高多糖得率，
但太高的温度易破坏多糖结构。因此，选定 90、95、
100℃三个提取温度水平作为优化的参数。
2.2.4 提取次数对棘托竹荪菌盖多糖得率的影响
图 3 浸提时间对棘托竹荪菌盖多糖得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the polysaccharide yield
图 4 浸提温度对棘托竹荪菌盖多糖得率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature
on the polysaccharide yield
结果表明，棘托竹荪菌盖多糖的得率随着提取次数
的增加明显上升，但提取次数高于 3 次时，上升趋势
较缓。随着提取次数的增多，棘托竹荪菌盖中多糖
含量下降。因此，选定 2、3、4 次三个提取次数水平
为优化的参数。
图 5 提取次数对棘托竹荪菌盖多糖得率的影响
Fig.5 Effect of extraction times on the polysaccharide yield
2.3 响应面分析法对棘托竹荪菌盖多糖提取工艺的
优化
2.3.1 响应面分析因素水平的选择 在单因素实验
的基础上，采取 Box－Behnken 的中心组合实验设计
原理，设计四因素三水平实验，以确定提取多糖的最
佳工艺条件，实验结果如表 3 所示。
利用软件对响应值与各个因素进行回归拟合，
得到回归方程为:
Y = 11.72 + 0.235X1 + 1.939167X2 + 0.945X3 +
0.614167X4 － 0.60375X1
2 － 0.35X1X2 － 0.23X1X3 +
0.17X1X4 － 1.3025X2
2 － 0.605X2X3 － 0.1575X2X4 －
0.53125X3
2－0.23X3X4－0.615X4
2
115
表 4 回归分析结果
Table 4 Statistical results of regression analysis
项 平方和 自由度 均方 F值 p 值 显著性
模型项 75.76 10 7.58 77.62 ＜ 0.0001 ＊＊＊
X1(提取温度) 0.66 1 0.66 6.79 0.0179 *
X2(料液比) 45.12 1 45.12 462.34 ＜ 0.0001 ＊＊＊
X3(提取次数) 10.72 1 10.72 109.80 ＜ 0.0001 ＊＊＊
X4(提取时间) 4.53 1 4.53 46.38 ＜ 0.0001 ＊＊＊
X1
2 2.36 1 2.36 24.23 0.0001 ＊＊＊
X1X2 0.49 1 0.49 5.02 0.0379 *
X1X3 0.21 1 0.21 3.31 0.1578 －
X1X4 0.11 1 0.11 1.21 0.2873 －
X2
2 11.00 1 11.00 112.75 ＜ 0.0001 ＊＊＊
X2X3 1.46 1 1.46 15.00 0.0011 ＊＊
X2X4 0.09 1 0.09 0.97 0.3226 －
X3
3 1.83 1 1.83 18.76 0.0004 ＊＊＊
X3X4 0.21 1 0.21 3.31 0.1578 －
X4
4 2.45 1 2.45 25.41 ＜ 0.0001 ＊＊＊
残差 1.76 18 0.10
失拟项 1.76 14 0.13 0.0901
净误差 0.00 4 0.00
总离差 77.52 28
Ｒ2 = 0.9849 Ｒ2Adj = 0.9673
注:* 为显著(0.01 ＜ p≤0.05) ;＊＊为极显著(0.001 ＜ p≤0.01) ;＊＊＊为极高显著(p≤0.001)。
表 3 响应面优化实验的方案及结果
Table 3 Experimental designs and results
of response surface analysis optimization
实验号 X1 X2 X3 X4
Y多糖得率
(%)
1 － 1 － 1 0 0 7.44
2 － 1 1 0 0 11.82
3 1 － 1 0 0 8.24
4 1 1 0 0 11.22
5 0 0 － 1 － 1 8.62
6 0 0 － 1 1 10.32
7 0 0 1 － 1 11.02
8 0 0 1 1 11.80
9 0 0 0 0 11.72
10 － 1 0 0 － 1 9.42
11 － 1 0 0 1 10.65
12 1 0 0 － 1 9.87
13 1 0 0 1 11.78
14 0 － 1 － 1 0 6.18
15 0 － 1 1 0 9.40
16 0 1 － 1 0 11.44
17 0 1 1 0 12.24
18 0 0 0 0 11.2
19 － 1 0 － 1 0 9.44
20 － 1 0 1 0 11.62
21 1 0 － 1 0 10.42
22 1 0 1 0 11.68
23 0 － 1 0 － 1 7.46
24 0 － 1 0 1 8.65
25 0 1 0 － 1 11.68
26 0 1 0 1 12.24
27 0 0 0 0 11.72
回归分析结果见表 4，失拟项 p ＞ 0.05，差异不显
著，未知因素对实验结果干扰小，说明残差均由随机
误差引起。回归模型的 Ｒ2 为 0.9849，Ｒ2Adj为 0.9673，
说明模型的拟合度很好，采用 F 检验方法对模型的
显著性进行分析，F 值为 77.62，p ＜ 0.0001，表明模型
是高度显著的，可以采用回归模型对响应值(棘托竹
荪菌盖多糖得率)进行预测。采用 F 检验的方法对
回归模型的各项系数进行检测，以评价各项对响应
值影响的显著性，由表 4 的分析结果可以看出，所考
察因素的显著性排序为 X2 ＞ X3 ＞ X4 ＞ X1，同时可以
看出 X1X2，X2X3 对棘托竹荪菌盖多糖得率的交互影
响显著。
2.3.2 各因素交互作用对棘托竹荪菌盖多糖得率的
响应面分析 由图 6 可知，料液比(X2)对多糖得率
的影响比较显著，表现为曲线较陡;提取次数(X3)、
提取时间(X4)、提取温度(X1)对多糖得率的影响次
之，表现为曲线稍为平滑，多糖得率随其数值的增加
或减少，响应值变化较小。X2、X3 的交互作用较强，
在编码值为 0 以上的 X2 在 X3 很大的范围内都能够
得到较大的响应值(图 6－ d) ;X2、X4 的交互作用不
大，编码值较大的 X2 和 X4 反而使得响应值 Y 有减
小的趋势，可能是时间过长导致一些大分子多糖的
降解(图 6－e)。图 6 所拟合的响应曲面的形状，抛物
面开口向下，说明所拟合的回归模型有极大值点。
2.3.3 最优工艺参数的确定 综合提取成本等因
素，通过 Design－Expert7.0 软件进行数据分析确定各
因素的最佳取值，得到回归模型存在的最大值点，Y
的最大预测值为 12.64%，即多糖得率可达到
12.64%，稳定点 (X1，X2，X3，X4)的 编 码 值 为
(－0.02853，0.61872，047231，0.32783) ，与之对应的实
116
图 6 各因素对棘托竹荪菌盖多糖得率影响的响应面图
Fig.6 The response surface of
polysaccharides yield as affected by factors
际值为提取温度为 94.85℃，料液比为 1∶38.85g /mL，
提取次数为 3.47，提取时间为 3.66h，考虑到实际操作
的便利，将提取工艺参数修正为提取温度为 95℃，料
液比为 1∶39g /mL，提取次数为 3，提取时间为 3.5h。以
上述条件进行实验结果的验证，在此优化条件下共进
行 3次平行验证实验，棘托竹荪菌盖多糖的得率为
12.13%。实验值与模型预测值基本一致。说明通过
响应面优化后得出的回归方程具有一定的实践意义。
2.4 体外抗氧化实验结果
2.4.1 总还原能力的测定 一种化合物的还原能力
可以作为潜在的抗氧化活性的一个重要指标。一般
情况下，样品的还原能力与抗氧化性呈显著的相关
性;样品反应后的生成物在 700nm处有最大吸收，吸
光值的大小反映了抗氧化能力的大小，吸光度值越
大，则样品的还原能力越强［19］。由图 7 可知，棘托竹
荪菌盖多糖在一定质量浓度范围内有显著的还原能
力，并随着浓度增加而增加。且质量浓度在 0.1 ～
0.2mg /mL范围内，与还原力呈现明显量效关系。在
所测定的浓度范围内，棘托竹荪菌盖多糖的还原能
力明显低于 VC。
图 7 多糖还原能力
Fig.7 Ｒeducing power of polysaccharide
2.4.2 对 O －2·的清除作用 由图8可知，棘托竹荪菌
盖多糖对超氧阴离子自由基有一定的清除能力，并
随着浓度的不断增加，清除率不断增加，并在 0.05～
0.35mg /mL质量浓度范围内呈线性关系，其回归曲线为
y =15.53596 + 74.26267X，Ｒ2 = 0.997312。在所测定的浓
度范围内，棘托竹荪菌盖多糖清除率明显低于 VC。
图 8 超氧自由基的清除活性
Fig.8 Scavenging effects of the samples
on superoxide radical
2.4.3 对 DPPH·的清除作用 由图9可知，棘托竹荪
菌盖多糖有一定的清除 DPPH·的能力，但随着质量
浓度的增大清除率变化不大，未呈现一定的量效关
系。在所测定的浓度范围内，棘托竹荪菌盖多糖清
除率明显低于 VC。
2.4.4 对·OH 的清除作用 由图10 可知，不同浓度
117
图 9 DPPH自由基的清除活性
Fig.9 Scavenging effects of the samples on DPPH radical
的棘托竹荪菌盖多糖对 H2O2 /Fe
2 +体系通过 Fenton
反应产生的·OH都具有清除作用，且随浓度的增加，
清除率上升，呈现出良好的量效关系。在质量浓度
为 0.5mg /mL时，VC 清除率为 42.24%，棘托竹荪多糖
清除率为 19.40%，说明棘托竹荪多糖具有体外抗氧
化活性。
图 10 羟基自由基的清除活性
Fig.10 Scavenging effects of the samples hydroxyl radical
2.4.5 半数清除质量浓度(EC50)测定结果
EC50指清除率为 50%时所需样品的质量浓度。
所需质量浓度越低，表明半清除率越高，清除效果越
好。由表 5 可知，以 VC 为对照，棘托竹荪菌盖多糖
对 O －2·、DPPH·、·OH 均具有清除作用，表明棘托竹
荪菌盖多糖具有一定的抗氧化能力。
表 5 多糖和 VC的 EC50值
Table 5 The value of EC50 on polysaccharides and VC
指标
EC50(mg /mL)
棘托竹荪菌盖多糖 VC
O －2 · 5.04 0.05
DPPH· 2.62 0.02
·OH 1.35 0.60
3 结论
3.1 本文采用热水浸提法提取棘托竹荪菌盖多糖，
在单因素实验的基础上，将响应面法应用于优化棘
托竹荪菌盖多糖的提取，考察了料液比、提取次数、
提取时间以及提取温度对多糖得率的影响。得到多
糖提取的最佳工艺条件:提取温度为 95℃，料液比为
1∶39g /mL，提取次数为 3 次，提取时间为 3.5h，在此
优化条件下棘托竹荪菌盖多糖的得率为 12.13%。
3.2 棘托竹荪菌盖多糖具有明显的还原能力，对超
氧阴离子自由基、(DPPH·)有机自由基、羟自由基均
表现出良好的清除能力，随着多糖浓度的增加，还原
能力及三种自由基的清除能力也相应增加，且在一
定的浓度范围内，呈现一定的量效关系，其清除效果
明显低于 VC。总体而言，棘托竹荪多糖是一种具有
抗氧化活性的物质。
参考文献
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中国林业出版社，1991;271.
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