全 文 ：羊茅种子愈伤组织诱导及
再生体系的建立
金忠民 ,沙伟 ,张艳馥 ,孙 微 ,刘文靖
(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院 ,黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘要:以羊茅(Festuca ovina)成熟种子为外植体材料 , 在改良的 MS(MSM)培养基上分别添加不同质量浓度
的 2 , 4-二氯苯氧乙酸(2 , 4-D)、激动素(KT)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、奈乙酸(NAA), 探讨不同的激素组合对
愈伤组织诱导 、植株分化以及植株生根的影响 , 以建立羊茅无性系的高效再生体系。结果表明 , 羊茅在
M SM +6.0 mg/ L 2 , 4-D+0.02 mg/ L KT 的培养基中愈伤组织诱导生长最好;在 MSM +2.0 mg/ L 6-BA+
0.6 mg/ L NAA 培养基上植株分化率最高 , 达 82%;在 1/ 2 MSM +0.6 mg/ L NAA 培养基上生根率达
100%。
关键词:羊茅;愈伤组织;再生体系
中图分类号:S543;Q945.39　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2010)10-0060-04
① 　羊茅(Festuca ovina)为禾本科 ,羊茅属 ,羊茅
种 ,原产欧洲 ,在中国多分布于西南和西北各地的
高山地 、亚高山地 ,东北 、内蒙古草原和四川西部
山地海拔 2 800 ～ 4 700 m 处也有分布 ,是山地草
原主要的优良牧草 。羊茅草丛低矮平整 ,纤细美
观 ,因其叶片细 、观赏价值高的特点被用于公园 、
高尔夫球场草坪 、花坛 、岩石园 、工厂和居住区绿
地。羊茅已成为冷季型草坪草的重点研究对象。
近年来随着植物基因工程研究的进展 ,有关
草坪草转基因成功的报道不断出现[ 1-9] 。激动素
(KT)和 6-苄氨基嘌呤(6-BA)有利于结缕草
(Zoysia japonica)的愈伤组织分化[ 10] ,培养基中
添加 0.1 mg/ L 6-BA 可以促进匍匐剪股颖
(Agrost is stoloni fera)愈伤组织的形成[ 11] 。2 , 4-
二氯苯氧乙酸(2 , 4-D)在诱导高羊茅(Festuca
elata)愈伤组织形成中起了主要作用 ,高质量浓
度的 2 , 4-D 是使高羊茅愈伤组织形成毛状根的
直接原因 ,KT 可以降低 2 , 4-D质量浓度 ,同时还
可以提高愈伤组织的品质 ,较高质量浓度 KT 对
愈伤组织的诱导和生长有不利影响[ 12] 。在 MS
培养基中添加 6-BA 和 NAA 可以促进高羊茅愈
伤组织的分化和生根[ 13] 。2 , 4-D 可以诱导羊草
(Leymus chinensis)种子分化出愈伤组织 ,低质量
浓度的 2 , 4-D 诱导能力显著高于高质量浓度
的[ 14] 。通过基因工程技术改良羊茅 ,培育优质 、
高产羊茅新品种的研究报道很少。本研究以羊茅
成熟种子为外植体对其愈伤组织诱导及植株再生
进行了探讨 ,建立羊茅愈伤组织再生体系 ,以胚性
愈伤组织为受体材料 ,将抗逆基因导入其中 ,期望
获得抗旱 、抗盐的新种质 ,为培育抗逆羊茅新品种
奠定基础 。
1　材料与方法
1.1 试验材料 　选用饱满的羊茅种子为外植
体 ,草种由北京种子公司提供 。
1.2 试验方法 　基本培养基为 MSM 培养
基[ 15] ,基本成分是 MS 无机盐+水解酪蛋白 1.0
mg/L+VB1 9.9 mg/L +VB6 9.5 mg/L+尼克酸
4.5 mg/L +琼脂 8.0 g/ L+蔗糖 30 g/ L;诱导及
继代培养基为 MSM 培养基 +2 , 4-D(2.0 、4.0 、
6.0 、8.0 、10.0 mg/L)+KT 0.02 mg/ L;分化培
养基为 MSM 培养基 +6-BA (1.0 、2.0 、3.0
mg/L)+NAA(0.2 、0.4 、0.6 mg/L);生根培养
60-63
10/2010 草　业　科　学PRATACULTURAL SCIENCE 27 卷 10 期Vol.27.No.10
①收稿日期:2010-03-25基金项目:黑龙江省教育厅资助项目(11544055)作者简介:金忠民(1968-),女 ,黑龙江绥化人 ,副教授 ,在读博士生 ,主要从事植物生理生态和植物分子遗传学的教学和研究。
E-mai l:jinzh ongmin2008@sohu.com通信作者:沙伟　E-mail:shw 1129@263.net
基为 1/2 MSM 培养基 +NAA(0.2 、0.4 、0.6
mg/L)。各添加 3%的蔗糖 , 7 g/L 琼脂 , pH 值
5.8。
培养方法:将成熟种子用 0.1%的升汞消毒
15 min ,然后用无菌水冲洗 3 ～ 4次 ,晾干后接种
在不同激素配比的诱导培养基上进行诱导。每个
处理接种 100 粒种子 ,待愈伤组织长到直径为
2 ～ 3 mm 时 ,继代培养 ,将结构致密 、颗粒状 、浅
黄的胚性愈伤组织转至分化培养基上进行培养 ,
每个处理接种 50 块愈伤组织 。大约 30 d 后 ,统
计愈伤组织分化率。待长出 2 ～ 3 cm 的芽时将其
转移到生根培养基上培养 ,20 d左右长出 4 cm 左
右的幼根 ,经 2 d的室内练苗后进行移栽。每天
光照 12 h ,光照强度约为 2 000 lx 。全部培养过
程的温度都控制在(26±1)℃[ 16-23] 。各处理均重
复 3次。
愈伤组织诱导 、分化与生根率计算公式如下:
发芽率=发芽的羊茅种子数接种的羊茅种子数×100%;
出愈率= 愈伤组织块数接种的羊茅种子数×100%;
分化率= 分化植株数接种愈伤组织块数×100%;
生根率= 生根愈伤数接种愈伤组织块数×100%。
1.3 数据分析　数据采用 SAS 9.0统计分析
软件处理 ,进行最小显著差数法(LSD)多重比较。
2　结果与分析
2.1 不同质量浓度 2 , 4-D 对羊茅种子愈伤
组织的影响 　从表 1 可以看出 ,羊茅种子出
芽率和诱导率随 2 , 4-D质量浓度的不同而不同 ,
2 ,4-D质量浓度为 6.0 mg/ L 和 4.0 mg/L 时出
芽率相当 ,且显著高于其他处理(P<0.05);2 ,4-D
质量浓度为 6.0 mg/L 时 ,诱导率显著高于其他
处理(P<0.05);各处理褐化率均较低。经继代
培养后 ,愈伤组织呈浅黄 、颗粒状 、紧密的具有分
化能力的形态 ,转入分化培养基进行培养。
2.2 不同激素配比对羊茅愈伤组织分化的
影响　羊茅愈伤组织在分化培养基上处理 7 d
后开始分化 ,一些愈伤组织逐渐开始出现绿点 ,直
至愈伤组织完全变绿 。处理 8培养基组合最适合
表 1　不同质量浓度 2 , 4-D对羊茅种子愈伤组织的影响
处理 激素质量浓度(mg/ L) 出芽率(%) 诱导率(%) 褐化率(%) 愈伤组织形态
1 2 , 4-D(2.0)+KT(0.02) 72c 67bc 4 白 , 较紧密
2 2 , 4-D(4.0)+KT(0.02) 89a 71b 2 白 , 较紧密
3 2 , 4-D(6.0)+KT(0.02) 88a 78a 2 浅黄 , 紧密
4 2 , 4-D(8.0)+KT(0.02) 79b 60c 3 透明 , 松软
5 2 , 4-D(10.0)+KT(0.02) 77b 62c 2 透明 , 松软
　注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。
表 2　不同质量浓度激素配比对羊茅愈伤组织分化的影响
处理 激素质量浓度(mg/ L) 分化愈伤组织数(个) 分化率(%) 平均每块愈伤组织上的芽数(>1 cm)
1 6-BA(1.0)+NAA(0.2) 21de 42f 3e
2 6-BA(2.0)+NAA(0.2) 30c 60cd 8d
3 6-BA(3.0)+NAA(0.2) 20e 40f 6d
4 6-BA(1.0)+NAA(0.4) 25d 50e 6d
5 6-BA(2.0)+NAA(0.4) 35bc 70bc 12c
6 6-BA(3.0)+NAA(0.4) 30c 60d 12c
7 6-BA(1.0)+NAA(0.6) 37b 74b 22a
8 6-BA(2.0)+NAA(0.6) 41a 82a 23a
9 6-BA(3.0)+NAA(0.6) 32c 64c 18b
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羊茅愈伤组织分化 ,分化率达 82%,且显著 。高
于其他处理(P <0.05);分化率最低的为处理 3
组合 ,仅为 40%
2.3 不同激素配比对羊茅不定芽生根的影
响　当羊茅愈伤组织分化出的芽长到 2 ～ 3 cm
时 ,切取生长健壮的分化植株转到生根培养基上 ,
1/2 MSM 培养基+0.6 mg/L NAA 生根率显著
高于其他处理(P <0.05),达 100%。幼根长到 4
cm 左右时经 2 d的室内练苗后移栽到花盆中 ,放
入温控培养箱中培养 ,小苗成活率均达 100%。
表 3　不同质量浓度 NAA对羊茅不定芽生根的影响
处理 激素质量浓度(mg/ L) 生根率(%)成活率(%)
1 1/ 2MSM+NAA(0.2) 68b 100
2 1/ 2MSM+NAA(0.4) 69b 100
3 1/ 2MSM+NAA(0.6) 100a 100
3　讨论与结论
提高愈伤组织诱导率是建立再生体系的第一
步 ,没有高频的诱导率 ,便无法得到大量的 、高品
质的愈伤组织 ,其随后的分化及生根也难以进行 。
张万军等[ 12] 认为 2 , 4-D在诱导高羊茅愈伤组织
形成中起了主要作用 ,较高质量浓度 K T 对愈伤
组织的诱导和生长有不利影响 。2 , 4-D 和 K T 的
合理配比对高羊茅的愈伤组织诱导 、保持和分化
起了关键的作用 。魏琪等[ 14] 研究羊草种子愈伤
组织诱导时发现较高质量浓度的 2 , 4-D作用下形
成的愈伤组织较少 ,加入 NAA 的生根培养基生
根较慢。易自力等[ 18] 研究认为对于不同的草坪
草而言 , 基因型的差异对其愈伤组织诱导的影响
极大 。张志飞等[ 21] 认为高羊茅的愈伤组织的诱
导率与基因型有关 ,高羊茅再生苗中出现白化苗
的频率比匍匐剪股颖和多年生黑麦草(Lolium
perenne)的高 ,可能是与高羊茅愈伤组织诱导时
2 ,4-D的质量浓度较高有关 。刘文真等[ 24] 研究多
年生黑麦草愈伤组织诱导 ,当以 2 , 4-D 作为唯一
生长激素时 , 随着 2 , 4-D 质量浓度的升高(从 3
mg/L 到 9 mg/ L),植株的再生率明显提高 。然
而 ,随着 2 ,4-D质量浓度的升高 ,培养细胞和组织
发生突变的几率也增大。
本研究结果表明 ,不同质量浓度 2 ,4-D 对羊
茅愈伤组织的诱导率不同 ,在 0.02 mg/L KT 浓
度下 ,随着 2 ,4-D质量浓度的增高 ,愈伤组织的诱
导率呈先升高后降低趋势 ,处理间差异显著 。出
芽的种子均能形成愈伤组织 ,较低质量浓度 2 ,4-D
的诱导效果较好 ,质量浓度超过 6.0 mg/L 诱导
率明显下降 ,最佳诱导质量浓度为 6.0 mg/L 。试
验确定 MSM +6.0 mg/L 2 ,4-D+0.02 mg/L K T
为羊茅种子愈伤组织诱导和继代培养基。经继代
培养后愈伤组织转入分化培养基进行培养 。本研
究确定处理 8(分化培养基 MSM +2.0 mg/L
6-BA +0.6 mg/ L NAA)是最适合羊茅愈伤组织
分化的培养基组合 ,分化率为 82%,其促进羊茅
愈伤组织分化效果与其他处理相比差异显著 。最
低为处理 3组合 ,为 40%。处理 8平均每块愈伤
组织上的芽数最多 ,低质量浓度 NAA 培养基的
平均出芽数较低 ,高质量浓度 NAA 对芽分化率
有促进作用 。试验显示经过 2 ～ 3次继代培养有
助于羊茅的愈伤组织向胚性愈伤转化 , 从而提高
羊茅愈伤组织的分化率 ,继代培养次数增加易出
现白化苗 ,生根培养基 1/2 M SM +0.6 mg/L
NAA 生根率最高 , 达 100%, 小苗成活率达
100%。
本研究已建立再生频率较高的组织培养方
法 ,所诱导的愈伤组织可作为转基因研究的受体
材料 ,用于羊茅基因工程操作 ,培育优质 、高产羊
茅新品种。
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Establ ishment of regeneration system and callus inducing of Festuca ovina seeds
JIN Zhong-min ,SHA Wei ,ZHANG Yan-fu ,SUN Wei , LIU Wen-jing
(College of Life Science and A gricul ture and Forestry , Qiqihaer U niversi ty ,
Heilongjiang Qiqihae r 161006 , China)
Abstract:The mature seed o f the Festuca ovina taken as the explants to study the effects of different
ho rmone composi tions on callus induct ion , regeneration and ro oting.In modified MS medium (MSM)
with different concentrat ions of 2 ,4-D , K T , 6-BA and NAA to establish fescue clones and efficient re-
generation system.The results show ed that the medium M SM +6.0 mg/ L 2 , 4-D +0.02 mg/ L K T
was bet ter for callus induction , the regenerat ion rate in medium of MSM +2.0 mg/L 6-BA +0.6
mg/L NAA was the highest , about 82%.The ro oting rate reached 100% in 1/2MSM +0.6 mg/L
NAA .The be st regene rat ion made a sound founda tion for the subsequent t ransgenic research.
Key words:Festuca ov ina;callus;regeneration
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