全 文 ：浙 江 林 学 院 学 报　2001 , 18(1):1 ～ 5
Journal of Zhejiang Forestry College
　　文章编号:1000-5692(2001)01-0001-05
收稿日期:2000-11-27
作者简介:方伟(1958-), 男 , 浙江义乌人 , 教授 , 博士 , 从事竹子分类与栽培研究。
雷竹不同栽培类型 RAPD分子标记的研究
方　伟1 , 何祯祥2 , 黄坚钦1 , 史钱均1 , 林新春1
(1.浙江林学院 竹类研究所 , 浙江 临安 311300;2.南京林业大学 森林资源与环境学院 , 江苏 南京 210037)
摘要:对雷竹的 19个栽培类型及 2个近缘种进行了 RAPD分析。从 4组 80个引物中筛选出
10个引物 , 产生随机扩增位点 66个 , 其中多态性位点 54个 (占 81.8%)。利用 POPGEN 32
程序进行聚类分析 , 结果表明:①聚类结果可将雷竹的不同栽培类型及其近缘种区分开来 ,
以前认为是雷竹一栽培型的永嘉雷竹不属于 Ph.praecox 种系;②细叶雷竹与阔叶雷竹的产
量高低主要取决于经营管理;③RAPD分子标记对竹类植物种以下等级进行分类有一定的可
靠性 。图 2表3参 8
关键词:雷竹;随机扩增多态性 DNA;分子标记;栽培类型
中图分类号:S795.7;Q946　　　文献标识码:A
雷竹(Phyllostachys praecox)为中国特有的优良笋用竹种[ 1] , 主要分布于浙江西北部的丘陵平原
地带 , 江苏与安徽南部也有少量分布。90年代以来 , 由于雷竹出笋早 、 产量高 、 经济效益显著 , 浙
江省的大部分县 (市), 江西 、 上海 、 江苏 、 安徽 、 福建 、 湖北 、 云南和贵州等省 (市)的部分县
(市)都有引种[ 2] 。在长期的栽培过程中 , 雷竹产生了一定程度的变异 , 形成了许多栽培类型 。这些
栽培类型该如何区分 , 不同栽培类型之间的遗传变异与产量是否相关 , 亟待研究。
随机扩增多态性 DNA (random amplified polymorphic DNA , 简称 RAPD)是 90年代发展起来的以
PCR为手段 , 将 DNA片段多次扩增的酶学方法[ 3] , 已被广泛应用于种质资源分析 、 品种鉴定 、遗传
图谱构建和基因定位等领域[ 4 ～ 7] 。本实验对雷竹各栽培类型及其近缘种作 RAPD分析 , 从 DNA水平
上探讨它们之间的遗传变异 , 并与外部形态特征相结合 , 为分类鉴定提供依据 , 同时联系不同栽培类
型的产量进行比较 , 为雷竹丰产经营特别是品种选择提供分子证据 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
材料来源见表 1 , 凭证标本藏于浙江林学院竹类标本室。
1.2　雷竹总 DNA的提取与纯化
总 DNA的提取采用改进的 CTAB法。在5 mL 离心管中加入 2mL CTAB提取液 (65 ℃预热);取 3
～ 4片竹叶剪碎后用液氮加少量石英砂研磨成粉状再转入上述离心管中 , 在 65 ℃下保温 5 min (期间
需不时摇动);取出离心管置于冰浴中冷却后 , 166.7 s-1离心 10 min;取上清液至另一 5 mL离心管 ,
加入等体积预冷异丙醇沉淀 DNA , 在-20 ℃下冷冻2 h;166.7 s-1离心 10 min , 弃上清 , 倒置 , 自然
干燥后加 500 μL 双蒸水溶解 , 166.7 s-1离心 10 min;将上清液移至 1.5 mL Eppendorf 管中 , 加入
500 μL氯仿 , 166.7 s-1离心 10 min;取上清液至新 Eppendorf管中 , 加入 1/10体积 3 moL·L-1NaAc
(pH 5.2)和 2倍体积的预冷无水乙醇 , -20 ℃下过夜;166.7 s-1离心10 min , 将沉淀物用 70%乙醇漂
洗 , 再用无水乙醇过一下 , 倒置气干后 , 加入 100 μL TE溶解后备用 。
1.3　雷竹 RAPD扩增反应体系及产物检测
1.3.1　反应体系　总体积15 μL:模板 DNA , 3μL (约 15 ng);0.5μmol·L-1Primer , 1.5 μL;2 mmol·
L
-1
dNTP , 1.5μL;10×Buffer , 1.5μL;DDH , 7.3μL;Taq酶 , 0.2μL (1U)。
各反应管中最后加 20μL 左右矿物油防止挥发。
1.3.2　扩增条件 　雷竹 RAPD扩增条件 (本条件适用于 15 μL 反应体系和 PE9700扩增仪)如下:
95 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s , 42 ℃退火 30 s , 70 ℃延伸 90 s , 反应进行 40个循环;72℃延伸
6 min 。
1.3.3　RAPD扩增产物检测　扩增产物经 1.5%琼脂糖胶 (含有溴化乙锭)在 1×TBE电泳缓冲液中
电泳分离 。电泳结束后在紫外灯下观察照相 。
1.4　数据处理
RAPD扩增带的有无分别用 “1” 和 “0” 表示 , 建立数据文件。利用加拿大 Alberta 大学开发的
POPGEN 32 (for Windows 95)进行统计分析。其中遗传距离 (genetic distance , GD)采用 Neis (1978)
方案进行计算。计算公式为:
Gdij ={Gdij2}=X[ 1 -2X ij2X ] 。
其中:X ij为个体 i和 j共有的谱带数;X 为多态性谱带数。
表 1　材料来源
Table 1　The origin of materials
编号 栽培类型名称 采集地点 采集时间 采集人 产量/ (t·hm-2) 主要形态特征
1 细叶雷竹 (当地引种) 绍兴梅园 1998-04-06 史钱钧 22.5 叶细 , 幼秆节间白粉少
2 阔叶红头雷 (当地引种) 绍兴梅园 1998-04-06 史钱钧 15.0 叶宽 , 幼秆节间白粉少
3 阔叶青头雷 (当地引种) 绍兴梅园 1998-04-06 史钱钧 12.0 叶厚 、 宽 , 秆矮
4 安徽雷竹 (安徽引种) 绍兴车头 1998-04-06 史钱钧 刚引种 节短隆起
5 细叶雷竹 (临安引种) 绍兴县林场 1998-04-06 史钱钧 刚引种 叶细 , 幼秆节间白粉少
6 余姚雷竹 (土名春竹) 余姚三七市镇 1998-04-06 史钱钧 33.0 叶细 , 幼秆节间白粉少
7 金华雷竹 (土名天雷竹) 金华曹宅 1998-04-07 陈晓铃 48.3 叶宽 , 幼秆节间白粉少
8 德清早园竹 德清武康 1998-04-08 史钱钧 30.0 叶细 , 幼秆节间白粉少
9 弯秆雷竹 临安崇阳村 1998-04-12 史钱钧 刚引种 秆节间略弯曲
10 安徽早竹 安徽仙霞镇 1998-04-11 史钱钧 30.0 节短隆起
11 江苏燕竹 江苏南京 1998-04-14 史钱钧 无产量记载 叶宽 , 幼秆节间白粉少
12 永嘉雷竹 (经营较好) 永嘉 1998-04-08 潘美燕 15.0 叶宽 , 幼秆节间白粉少
13 萧山早竹(Ph.propinqua) 安吉竹种园 1998-04-09 史钱钧 无产量记载 近缘种与雷竹对比
14 细叶早竹 安吉竹种园 1998-04-09 史钱钧 无产量记载 叶细 , 幼秆节间白粉少
15 黄条早竹 安吉竹种园 1998-04-09 史钱钧 无产量记载 沟槽黄色
16 嘉兴早竹 安吉竹种园 1998-04-09 史钱钧 无产量记载 叶宽 , 幼秆节间白粉少
17 早竹 安吉竹种园 1998-04-09 史钱钧 无产量记载 特征不详
18 天目早竹(Ph.tianmuensis) 安吉竹种园 1998-04-09 史钱钧 无产量记载 近缘种 , 与雷竹对比
19 雷竹 安吉竹种园 1998-04-09 史钱钧 无产量记载 叶宽 , 幼秆节间白粉少
20 花秆早竹 安吉竹种园 1998-04-09 史钱钧 无产量记载 节间黄绿条纹相间
21 永嘉雷竹 (经营较差) 永嘉 1998-04-08 潘美燕 0.8 叶宽 , 幼秆节间白粉少
2　结果与分析
2.1　随机引物的筛选
引物初筛在OPB 、 OPC 、 OPP和OPY4组共 80个引物中进行 , 最后确定10个扩增效果较好的引物
2 浙 江 林 学 院 学 报　　　　　　　　　　　　　　　2001 年 3月
对样品DNA进行扩增 (引物名称序列及扩增谱带情况见表 2)。
表 2　引物序列及扩增情况
Table 2　The sequences and amlification of primers
引物名称 引物序列 扩增总位点数 多态性位点数
OPB-15 5′GGAGGGTGTT3′ 6 6
OPB-20 5′GGACCCTTAC3′ 8 6
OPC-01 5′TTCGAGCCAG3′ 7 7
OPC-06 5′GAACGGACTC3′ 3 3
OPC-07 5′GTCCCGACGC3′ 4 4
OPC-11 5′AAAGCTGCGG3′ 5 4
OPC-19 5′GTTGCCAGCC3′ 13 12
OPY-17 5′AGAGCCGTCA3′ 4 4
OPY-13 5′GGGTCTCGGT3′ 8 4
OPY-15 5′AGTCGCCCTT3′ 8 5
总计 10 66 55
图 1　RAPD扩增指纹图谱 (引物:OPC19)
Figure 1　RAPD amplified fingerprints (primer:OPC19)
2.2　雷竹 RAPD扩增结果
10个引物对雷竹 19个栽培类型及 2
个近缘种的 DNA均能扩增出较为清晰的
谱带 , 不同引物扩出的 DNA 片段长度处
于100 ～ 2 400 bp 之间 。共得到随机扩增
位点 66 个 , 平均每个引物产生 6.6 个 ,
其中多态性位点 54 个 , 占总位点数的
81.8%。雷竹 RAPD扩增结果见图 1 (引
物OPC19)。
2.3　聚类分析
10个引物对雷竹不同栽培类型及近
缘种 DNA扩增谱带经 POPGEN 32程序统
计分析 , 建立遗传距离矩阵 (表 3)及聚
类系统树 (图 2)。结果表明:雷竹不同
栽培类型之间的相似性较高 , 各个类型之
间的遗传距离值在 0.062 5 ～ 0.552 1 之
间 , 大部分在 0.4以下。据聚类图可将上
述类群划分成 2 类:第 1类包括 1号 、 6
号 、 5号 、 8 号 、 20号 、 9号 、 14 号 、 15
号 、 17号 、 16号 、 7号 、 2号 、 4 号 、 10
号 、 19号 、 11 号 、 3号共 17 个雷竹栽培
类型;第 2 类包括 12 号 、 21 号 、 3 号
(萧山早竹)和 18号 (天目早竹)。经实地考证确认 , 永嘉雷竹 (12号和 21号)不属于 Ph.praecox
种系 。表明 , 由 RAPD分子标记所得出的聚类分析图可以很好地将 Ph.praecox 的不同栽培类型及其
近缘种区分开来 。
表 3　遗传距离
Table 3　Genetic distance
PopGD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2 0.277 6
3 0.297 8 0.383 0
4 0.238 4 0.200 7 0.3830
5 0.146 6 0.257 8 0.4055 0.219 4
6 0.129 2 0.361 0 0.2194 0.318 5 0.146 6
7 0.277 6 0.238 4 0.2578 0.277 6 0.219 4 0.200 7
8 0.182 3 0.182 3 0.4520 0.297 8 0.200 7 0.297 8 0.339 5
9 0.164 3 0.277 6 0.3395 0.277 6 0.182 3 0.200 7 0.277 6 0.146 6
10 0.277 6 0.277 6 0.4761 0.238 4 0.257 8 0.361 0 0.361 0 0.297 8 0.1643
11 0.339 5 0.339 5 0.3610 0.476 1 0.405 5 0.339 5 0.297 8 0.238 4 0.2978 0.476 1
12 0.428 5 0.383 0 0.4520 0.383 0 0.500 8 0.476 1 0.297 8 0.452 0 0.3830 0.428 5 0.500 8
13 0.297 8 0.257 8 0.4055 0.428 5 0.361 0 0.383 0 0.383 0 0.238 4 0.2978 0.476 1 0.361 0 0.361 0
14 0.146 6 0.297 8 0.2776 0.297 8 0.238 4 0.146 6 0.297 8 0.200 7 0.1466 0.297 8 0.361 0 0.361 0 0.238 4
15 0.200 7 0.200 7 0.2978 0.318 5 0.219 4 0.238 4 0.238 4 0.219 4 0.1292 0.200 7 0.297 8 0.339 5 0.257 8 0.146 6
16 0.257 8 0.182 3 0.4055 0.257 8 0.238 4 0.297 8 0.182 3 0.200 7 0.2194 0.339 5 0.318 5 0.277 6 0.277 6 0.238 4 0.1823
17 0.257 8 0.219 4 0.2776 0.339 5 0.277 6 0.219 4 0.182 3 0.200 7 0.1466 0.257 8 0.238 4 0.318 5 0.277 6 0.164 3 0.0788 0.129 2
18 0.361 0 0.277 6 0.4285 0.452 0 0.383 0 0.361 0 0.318 5 0.257 8 0.2776 0.405 5 0.297 8 0.297 8 0.219 4 0.339 5 0.2776 0.257 8 0.219 4
19 0.277 6 0.361 0 0.3830 0.318 5 0.383 0 0.361 0 0.318 5 0.383 0 0.3185 0.277 6 0.428 5 0.383 0 0.476 1 0.297 8 0.3610 0.297 8 0.297 8 0.552 1
20 0.200 7 0.238 4 0.3830 0.277 6 0.219 4 0.277 6 0.277 6 0.112 1 0.1292 0.318 5 0.297 8 0.339 5 0.219 4 0.146 6 0.2007 0.112 1 0.146 6 0.238 4 0.318 5
21 0.383 0 0.383 0 0.3610 0.383 0 0.500 8 0.383 0 0.257 8 0.405 5 0.3395 0.476 1 0.452 0 0.062 5 0.277 6 0.277 6 0.2978 0.238 4 0.238 4 0.297 8 0.339 5 0.297 8
3第 18卷第1 期 　　　　方　伟等:雷竹不同栽培类型 RAPD分子标记的研究 　
图 2　RAPD聚类树系图
Figure 2　A dendrogram of RAPD
3　讨论
3.1　聚类结果与外部形态的关系
通过聚类可知 , 绍兴细叶雷竹 、阔叶红头雷
竹 、 阔叶青头雷竹 、 安徽雷竹 、临安雷竹 、 余姚
雷竹 、金华雷竹 、德清早园竹 、弯秆雷竹 、 安徽
早竹 、江苏燕竹 、细叶早竹 、 黄条早竹 、嘉兴早
竹 、早竹 、 安吉雷竹和花秆早竹等都聚为一类 ,
说明这些不同栽培类型之间的关系较为密切 。尽
管黄条早竹的沟槽为黄色 , 花秆早竹节间有绿黄
相间之条纹而在外部形态上与雷竹原变型有明显
区别 , 安徽早竹和江苏燕竹等则与雷竹原变型在
地理分布上有很大距离 , 但聚类结果表明它们与
雷竹原变型间的亲缘关系仍相当接近。江苏燕
竹 、 安徽雷竹等很可能发源于雷竹原产地浙江的
临安 、德清 、余杭一带。就如同丁雨龙[ 8]所进行
的研究一样 , 比利时历史上从中国引种的 Ph .
violascens经 RAPD分子标记研究 , 结合形态特征认为就是浙江 、江苏 、安徽广为栽培的早竹 (雷竹)。
绍兴的阔叶青头雷竹较为特殊 , 当地农户从出笋未抽枝展叶之时即将笋头掐掉 , 待到抽枝展叶时又将
枝条先端部分去掉 , 以便其他套种植物如豆类和蔬菜类能够较好生长 , 在形态上造成秆很低矮 , 叶子
厚而大 , 枝叶浓密 , 形态上与其他类型差别很大 。从聚类结果看 , 与其他栽培变型的差异也相对较
大 , 但仍聚为一类。天目早竹幼秆翠绿无白粉 , 箨舌不下延与 Ph.praecox 明显有别 , 从聚类结果也
可看出这一点。萧山早竹尽管从秆箨 、 节间等外部形态及出笋期等方面与雷竹很相近 , 但从聚类结果
看仍有较大差别 , 为不同种类当无疑问 。以前通常被认为是雷竹一栽培类型的永嘉雷竹与天目早竹和
萧山早竹聚为一类 , 经实地考证可以确认永嘉雷竹不属于 Ph.praecox 种系 。
3.2　聚类结果与竹笋产量的关系
以前通常将雷竹划分为细叶雷竹与阔叶雷竹两大类 , 并认为细叶雷竹竹笋产量较高 。聚类结果表
明 , 这两大类雷竹内部遗传变异相关不大 。结合产量调查可知 (表 1), 只要栽培管理良好 , 阔叶雷
竹也能获得高产 。细叶雷竹与阔叶雷竹产量高低主要取决于经营管理 , 这与历来主张只发展细叶雷竹
的观点相左。
3.3　RAPD分子标记对竹类植物种以下等级进行分类的可信度
RAPD分子标记是一种显性标记 , 难以提供完整的遗传信息 , 但由于可用于 RAPD分析的引物很
多 , 利用一系列引物可以使检测区域几乎覆盖整个基因组 , 提高分类的可靠性。RAPD反应的退火温
度较常见 PCR反应的退火温度要低 , 反应易受环境条件的影响而导致实验的重复性差。这一缺陷可
通过严格反应体系和优化反应条件来克服 。在本实验中 , DNA 扩增产物的重复性是比较好的 , 可信
度较高 。从扩增结果看 , 10个引物对雷竹不同栽培类型 DNA 扩增所得到的多态性位点比较丰富 , 可
很好地将它们区分开来。鉴于竹类植物种以下等级从形态学上分类难度很大 , 利用 RAPD分子标记进
行分类便成为一种较为有效的方法 。同时还可以将 RAPD标记与其他分类方法相结合 , 使分类的可靠
性进一步提高。
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Studies on cultivars of Phyllostachys pxaecox with RAPD molecular markers
FANG Wei1 , HE Zheng-xiang2 , HUANG Jian-qin1 , SHI Qian-jun1 , LIN Xin-chun1
(1.Bamboo Research Institute , Zhejiang Forestry College , Linan 311300 , Zhejiang , China;2.College
of Forest Resources and Environment , Nanjiang Forestry University , Nanjiang 210037 , Jiangsu , China)
Abstract:With RAPD molecular markers , 19 cultivars and 2 affinis species of Phyllostachys praecox were
analysed.Using 10 primers screened from 80 primers , 66 loci were amplified , and 54 of these were polymorphic
(81.8%).The UPGMA cluster analysis of POPGEN 32 program showed:(1)The cultivars and affinis species of
Ph.praecox can be divided by UPGMA analysis , and the Yongjia Lei Bamboo recognized as one of the cultivars of
Lei Bamboo before doesnt belong to Ph.praecox.(2)The production of narrow-leaved Lei Bamboo and broad-
leaved Lei Bamboo mainly decided by management. (3)The classification on bamboo under species based on
RAPD markers is somewhat reliable.
Key words:Phyllostachys praecox ;random amplified polymorphic DNA;molecular markers;cultivars
5第 18卷第1 期 　　　　方　伟等:雷竹不同栽培类型 RAPD分子标记的研究