全 文 ：棘托竹荪子实体多酚氧化酶特性及其抑制剂的研究
黄志鸿 , 檀东飞＊ , 黄儒珠
(福建师范大学生命科学学院 ,福建 福州　 350108)
摘　要　以邻苯二酚为底物采用分光光度法对棘托竹荪(Dictyophoraechinovolvata)子实体多酚氧化酶的酶学
特性和不同抑制剂对多酚氧化酶活性的影响进行了研究。结果表明 ,棘托竹荪子实体多酚氧化酶的最适反应
pH为 8.0,最适反应温度为 45℃, 高温短时处理能显著抑制多酚氧化酶的活性;L-半胱氨酸(L-Cys)、氯化钠
(NaCl)、维生素 C(Vc)和柠檬酸(C6H8O7)等对多酚氧化酶均有抑制作用。经正交实验筛选的抑制剂组合
(5.0 g/LL-Cys、20.0g/LNaCl、 1.5 g/LVc、10.0 g/LC6H8O7)可以完全抑制多酚氧化酶的活性。
关键词　棘托竹荪;多酚氧化酶;酶学特性;抑制剂;抑制效应
中图分类号　Q554.1　　　文献标识码　A　　　文章编号　1005-7021(2010)04-0001-06
FeatureofPolyphenolOxidasefrom
DictyophoraechinovolvataSporophoreandItsInhibitors
HUANGZhi-hong, TANDong-fei, HUANGRu-zhu
(Col.ofLifeSci., FujianNormalUni., Fuzhou350108)
Abstract　Thecharacteristicsofpolyphenoloxidase(PPO)andtheeffectsofvariousdiferentinhibitorsonPPOac-
tivityfromDictyophoraechinovolvata(De)sporophorewereinvestigatedwithspectrophotometryusingcatecholasa
substrate.TheresultsshowedthattheoptimalpHforDePPOactivitywas8.0, andtheoptimaltemperaturewas45
℃, therefore, temporalhightemperaturetreatmentcouldinhibitPPOactivityevidently.L-cysteine, sodiumchloride,
vitaminCand, citricacidwerealhavinginhibition.Theorthogonaltestindicatedthatthecombinationofinhibitor
(5.0 g/LL-cysteine, 20.0g/Lsodiumchloride, 1.5g/LvitaminC, and10.0 g/Lcitricacid)couldtotalyinhibit
PPOactivity.
Keywords　Dictyophoraechinovolvata;polyphenoloxidase(PPO);enzymecharacter;inhibitor;inhibitingefect
　　棘托竹荪 (DictyophoraechinovolvataZang,
ZhengetHu)隶属真菌门 、担子菌亚门 、腹菌纲 、鬼
笔目 、鬼笔科 、竹荪属 [ 1] ,是我国科学工作者首次
发现并定名的新种[ 2] 。棘托竹荪香气浓郁 ,味道
鲜美 ,营养丰富 ,是名贵的食用真菌之一 ,长期食
用可降低血液中的脂肪和胆固醇。目前 ,在我国
南方已大面积人工栽培 ,是我国竹荪业的龙头产
品 。酶促褐变是棘托竹荪采摘 、运输 、加工 、贮藏
过程中普遍存在的现象。新鲜棘托竹荪菌体呈白
色 ,一旦采摘 ,其内含的多酚类物质极易在酶促催
化下迅速发生氧化而呈褐色 。酶促褐变影响棘托
竹荪的外观 ,同时也使其营养成分和风味发生很
大变化 ,从而降低其商业价值和营养价值。多酚
氧化酶(PolyphenolOxidase, PPO)存在于大多数果
蔬及菌类正常细胞中 , 是导致酶促褐变的主要
酶 [ 3-5] 。果蔬及菌类在采摘过程中的机械损伤或
加工过程中的烘干脱水等 ,使组织细胞遭破坏 ,导
致多酚氧化酶释放 ,进而催化多酚类物质氧化为
　基金项目:福建省自然科学基金计划项目(X0650045)
　作者简介:黄志鸿　男 ,硕士研究生。主要从事生理生化研究。 E-mail:hzh8512@163.com
　＊通讯作者。 E-mail:dftan@fjnu.edu.cn
　收稿日期:2010-03-09;修回日期:2010-05-08
1微生物学杂志　 2010年 7月第 30卷 第 4期　JOURNALOFMICROBIOLOGYJuly2010 Vol.30No.4
醌类物质 ,醌类物质进一步相互作用生成高分子
聚合物或与氨基酸 、蛋白质等生成高分子络合物 ,
即褐色素。棘托竹荪的防褐处理 ,以前多采用硫
磺熏蒸法。硫磺熏蒸能达到理想的防褐效果 ,但
熏蒸处理难免残留有害物质 ,如食用危害人体健
康 [ 6] ,曾因此导致竹荪产品严重滞销 ,尤其出口
受到限制。本文以棘托竹荪子实体为材料 ,探讨
其多酚氧化酶的酶学特性及不同抑制剂的抑制效
应 ,在此基础上 ,通过正交试验筛选抑制效果好的
抑制剂组合配方 ,旨在为解决棘托竹荪在采摘 、运
输 、加工及其贮藏过程中的酶促褐变问题提供理
论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　新鲜棘托竹荪　购于福建省古田县 ,品种
为棘托 -89。
1.1.2　试剂　邻苯二酚 、邻苯二甲酸氢钾标准液
(pH4.01)、四硼酸钠标准液(pH9.18)、Na2HPO4 -
KH2PO4、HAc-NaAc、CuSO4 、C6H8O7、Vc、NaCl、L-
半胱氨酸 (L-Cys)、乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-
Na2),以上除 L-Cys为生化试剂外 ,其他均为 A.R
试剂。
1.1.3　仪器　CR22GII高速冷冻离心机(日本 ,
日立);HANNApH211酸度计(北京哈纳科仪科
技有限公司);AL-204电子分析天平(梅特勒-托
利多仪器(上海)有限公司);752 N-紫外可见分
光光度计(上海精密科学仪器有限公司);HH-4
数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)。
1.2　方法
1.2.1　多酚氧化酶粗酶液制备　取新鲜棘托竹
荪子实体的菌裙和菌柄 ,剪碎 ,置研钵中 ,加适量
石英砂及少量预冷的蒸馏水 ,冰浴研磨匀浆。匀
浆于 18 000r/min、4 ℃条件下离心 15 min,取上
清(即粗酶液),置 -18℃冰箱保存备用。
1.2.2　多酚氧化酶活性测定 　取 0.2 mol/L
Na2HPO4 -KH2PO4缓冲液(pH8.0)1.50 mL和粗
酶液 1.00 mL于试管中 , 混匀 ,置 45 ℃水浴预热
2 min,加 0.1 mol/L邻苯二酚溶液 1.00 mL,混
匀 , 继续于 45℃水浴保温。分别取 0和 40min时
的反应液 ,立即测定 400 nm波长下的吸光值 OD1
和 OD2;平行设置一个以等体积蒸馏水替代酶粗
液的底物邻苯二酚自氧化对照管 , 测其吸光值
OD3 ,则吸光值增量为 ΔOD =OD2 -OD1 -OD3。
每个实验管均设置一个重复。多酚氧化酶活力单
位定义为:吸光值每分钟增加 0.001为一个酶活
力单位(U)。
1.2.3　酶反应进程曲线测定 　取 0.2 mol/L
Na2HPO4 -KH2PO4缓冲液(pH8.0)30.00 mL和
粗酶液 20.00 mL, 混匀 ,置 45 ℃水浴预热升温
后 ,加 0.1 mol/L邻苯二酚 20.00 mL, 混匀 , 置
45℃水浴保温 。于反应时间 0 ～ 100 min内分别
每隔 10 min取样 ,测定 400 nm波长下的 OD值。
每个实验管均设置一个重复 ,相同条件和方法做
自氧化对照实验。以反应时间为横坐标 ,酶反应
后产物的吸光值为纵坐标作反应进程曲线 。以曲
线起始段直线部分(其斜率为初速度)最高点对
应的时间作为后续实验的反应时间 。
1.2.4　多酚氧化酶最适反应 pH测定 　根据
1.2.2的酶活测定方法 ,分别于 pH3.0、3.5、4.0、
4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、
9.5、10.0、10.5的缓冲液中 ,加入酶液与底物 ,置
45℃水浴保温 40min,立即测定 OD400。以 pH为
横坐标 ,产物的 OD400为纵坐标作图 ,吸光值最高
处所对应的 pH即为该酶的最适反应 pH。
1.2.5　多酚氧化酶最适反应温度测定 　根据
1.2.2的酶活测定方法 ,采用 1.2.4测定所得的最
适反应 pH,配置反应液 ,分别将反应液置 5、7.5、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、 70、80、90 ℃
的水浴保温 40 min, 测定 OD400。以温度为横坐
标 ,产物吸光值为纵坐标作图 ,最高吸光值所对应
的温度即为该酶的最适反应温度。
1.2.6　多酚氧化酶温度稳定性测定　取一定量
的粗酶液于 90℃水浴加热 ,待酶液温度恰好升至
90℃时 ,取样 1次 ,并将取出的酶液冷却至室温。
随后每隔 1 min取样 1次 ,共 10次。取出的酶液
同样按 1.2.2酶活力测定方法 ,测定 OD400 ,依此
计算出剩余的酶活力;同样方法测在 80和 70 ℃
保温条件下酶的稳定性 ,取样时间间隔分别为 3
min和 5 min;同法测定酶在 60、50和 45℃时的稳
定性 ,取样时间间隔为 10min。
1.2.7　抑制剂 、激活剂对多酚氧化酶活性的影响
　参照多酚氧化酶活性测定方法 ,每种抑制剂或
激活剂设置 2个实验管 , 1个为加抑制剂或激活
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剂的酶活测定管(反应液为邻苯二酚 +酶 +抑制
剂或激活剂 ,三者体积比为 1∶1∶1);另 1个为
加抑制剂或激活剂的邻苯二酚自氧化对照管(反
应液为邻苯二酚 +蒸馏水 +抑制剂或激活剂 ,三
者比例同酶活测定管), 每管均设置 1个重复。
同时 ,再做同样比例的正常酶活测定管和邻苯二
酚自氧化管(即抑制剂或激活剂用同体积的蒸馏
水替代)。所有操作同 1.2.2。由此得出加入抑
制剂或激活剂的酶与正常酶的相对酶活力 。同法
测定不同浓度抑制剂对酶活的影响。
1.2.8　正交试验筛选多酚氧化酶抑制剂最佳组
合　通过上述测定结果 ,结合实际应用的可行性 ,
选取 4种抑制剂(L-Cys、NaCl、Vc和 C6H8O7)进
行四因素三水平的正交试验 ,见表 1,通过试验筛
选最佳抑制水平的抑制剂浓度组合。
表 1　正交试验设计表 L
9
(43)
Table1　Thetableoforthogonaltest
因素
水平
C6H8O7 Vc L-Cys NaCl
/(g· L-1) /(g· L-1) /(g· L-1) /(g· L-1)
1 10.0 0.5 3.0 10.0
2 15.0 1.0 4.0 20.0
3 20.0 1.5 5.0 30.0
2　结果与分析
2.1　棘托竹荪子实体多酚氧化酶反应进程
图 1　多酚氧化酶反应进程曲线
Fig.1　ThereactionprocesscurveofPPO
　　由图 1可知 ,酶促反应时间与产物生成量在
40 min内基本呈直线关系 , 40 min后反应曲线趋
于平坦 。因此选择 40 min作为后续实验的反应
时间。
2.2　pH对棘托竹荪子实体多酚氧化酶活性的
影响
图 2　pH对多酚氧化酶活力的影响
Fig.2　EfectofpHonPPOactivity
　　由图 2可知 ,棘托竹荪子实体多酚氧化酶对
pH的变化较敏感。当 pH从 3.5上升至 4.5时 ,
酶活力迅速上升 ,而当 pH大于 8.0时 ,酶活力则
急剧下降。在 pH7.0 ～ 8.5范围内 ,酶活力均较
高 ,其中 pH8.0时 ,酶活力最高。
2.3　温度对棘托竹荪子实体多酚氧化酶活性的
影响
2.3.1　多酚氧化酶最适反应温度
图 3　温度对多酚氧化酶活力的影响
Fig.3　EfectoftemperatureonPPOactivity
　　由图 3可知 ,棘托竹荪子实体多酚氧化酶反
应温度范围较宽 。 5 ～ 45 ℃酶活随温度增高上升
很快 , 45 ～ 60 ℃则酶活逐渐下降 ,降至 70 ℃仍有
一定活力 , 70 ～ 80℃急剧下降 , 90℃时 ,酶活降为
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0。可见 ,在 30 ～ 60℃范围内 ,棘托竹荪子实体多
酚氧化酶均具有较高活性 ,其最适反应温度为
45 ℃。
2.3.2　多酚氧化酶的热稳定性　棘托竹荪子实
体多酚氧化酶在不同温度的水浴中保温不同时间
对酶活力的影响实验结果表明(见图 4),相对于
其他实验温度 ,棘托竹荪子实体多酚氧化酶在最
适温度(45 ℃)时的热稳定性最佳 , 45 ℃时该酶
能保持较长时间的催化活性 ,温度升高 ,则稳定性
下降 ,且温度越高 ,稳定性下降得越快。如 80 ℃
经 30min后 ,相对酶活仅存 10%左右;而 90℃经
8 min,酶活则降为 0,即该酶已完全变性失活。
图 4　温度对多酚氧化酶稳定性的影响
Fig.4　EffectoftemperatureonPPOstability
2.4　抑制剂 、激活剂对多酚氧化酶活性的影响
2.4.1　不同抑制剂 、激活剂对多酚氧化酶活性的
影响　5.0 g/L的不同抑制剂 、激活剂对棘托竹
荪子实体多酚氧化酶活性的影响见表 2。由表 2
可知 ,供试 6种试剂除 CuSO4为棘托竹荪子实体
多酚氧化酶的激活剂外 ,其余 5种均为该酶的抑
制剂。 5种抑制剂对该酶的抑制作用依次为 Vc
>C6H8O7 >L-Cys>EDTA-Na2 >NaCl。
2.4.2　不同浓度抑制剂对多酚氧化酶的抑制作
用　根据 2.4.1实验结果 ,选择对人体健康安全
的食品添加剂 C6H8O7 、NaCl、Vc和 L-Cys,进一步
作不同浓度抑制剂对棘托竹荪子实体多酚氧化酶
酶活的抑制效果实验 ,结果如图 5、图 6、图 7、图
8。由图 5可知 ,随抑制剂柠檬酸浓度的增加 ,多
酚氧化酶相对酶活逐步降低 ,即抑制作用逐步增
强 。图 6 ～ 8的实验结果也表明 ,抑制剂浓度越
高 ,对酶的抑制作用越强。
表 2　不同抑制剂 、激活剂对多酚氧化酶活力的影响
Table2　EfectofinhibitorandactivatoronPPOactivity
抑制剂 、激活剂 /(5.0g· L-1) 相对酶活力 /%
对照 100
C6H8O7 42.4
EDTA-Na2 69.1
L-Cys 50.8
NaCl 84.9
CuSO4 279.3
Vc 35.6
图 5　不同浓度柠檬酸对多酚氧化酶活力的影响
Fig.5　Efectofcitricacidofdiferent
concentrationsonPPOactivity
图 6　不同浓度 NaCl对多酚氧化酶活力的影响
Fig.6　Efectofsodiumchlorideofdiferent
concentrationsonPPOactivity
2.4.3　正交试验结果　由 2.4.2实验结果可知 ,
单一抑制剂对多酚氧化酶的抑制效果并不十分理
想 ,若要达到理想的抑制效果 ,则抑制剂浓度要很
高 。可见 ,单一抑制剂可能无法符合实际应用的
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要求。为此 ,在上述实验基础上 ,将 4种抑制剂进
行复配 ,每种抑制剂各选择 3水平的浓度(表 1),
按正交试验 L9(43)安排实验 ,以期筛选到抑制效
果好 ,并能应用于实际的抑制剂组合 ,见表 3。比
较表 3中的 R值可知 , 按本正交试验设计的浓
度 , 4种抑制剂中 , L-Cys是最主要的影响因素 ,其
次是 NaCl,再次是 Vc,最后是 C6H8O7。
图 7　不同浓度 Vc对多酚氧化酶活力的影响
Fig.7　EfectofvitaminCofdiferent
concentrationsonPPOactivity
图 8　不同浓度 L-Cys对多酚氧化酶活力的影响
Fig.8　EfectofL-cysteineofdiferent
concentrationsonPPOactivity
2.4.4　最优抑制剂组合的验证　由表 3中的 Ki
值可知 ,本正交试验中的最优抑制浓度组合水平
为:C6H8O7水平 1, Vc水平 3, L-Cys水平 3, NaCl
水平 2,即达到最佳抑制效果的抑制剂组合为:
10.0g/LC6H8O7 、1.5 g/LVc、5.0 g/LL-Cys和
20.0g/LNaCl。该最优组合未出现在正交实验
中 ,故补做此组合的抑制验证实验 。验证实验测
得的多酚氧化酶相对酶活为 0,表明此组合可完
全抑制棘托竹荪子实体多酚氧化酶的活性 。
表 3　正交试验结果
Table3　Theresultoforthogonaltest
相对酶活力 /%
试验号 C6H8O7 Vc L-Cys NaCl
Ⅰ Ⅱ 均值
1 1 1 1 1 3.24 4.17 3.71
2 1 2 2 2 2.13 2.13 2.13
3 1 3 3 3 1.28 1.71 1.50
4 2 1 2 3 4.63 5.09 4.86
5 2 2 3 2 3.70 4.17 3.94
6 2 3 1 1 2.78 1.85 2.32
7 3 1 3 2 0.85 0.00 0.43
8 3 2 1 3 7.41 6.94 7.18
9 3 3 2 1 3.24 3.24 3.24
Ⅰ 7.34 9.00 13.21 9.27
Ⅱ 11.12 13.25 10.23 6.50
Ⅲ 10.85 7.06 5.87 13.54
K1 2.45 3.00 4.40 3.09
K2 3.71 4.42 3.41 2.17
K3 3.62 2.35 1.96 4.51
R 1.26 2.07 2.44 2.34
3　讨　论
　　多酚氧化酶酶促褐变是以多酚类物质为底
物 ,在有氧存在条件下 ,经多酚氧化酶的催化作
用 ,将无色的酚类化合物氧化形成醌 ,醌相互多聚
或与氨基酸 、蛋白质等结合产生黑色或褐色的色
素沉淀 。从反应本质看 ,底物 、氧和酶是引起褐变
不可或缺的条件。因此 ,抑制酶活性是防止棘托
竹荪子实体褐变的主要途径之一。
从实验结果看 ,棘托竹荪子实体多酚氧化酶
在 pH7.0 ～ 8.5范围内均具有较高活性 ,且对 pH
变化敏感 。这是由于多酚氧化酶为含铜离子的
酶 ,在不同 pH环境下 ,辅基铜会表现出不同的存
在形式 ,或以 Cu2+的形式解离 ,或生成Cu(OH)2 ,
故其对 pH变化敏感。因此 ,通过改变酶所处微
环境的 pH可以影响酶的活性 。
棘托竹荪子实体多酚氧化酶在 30 ～ 60 ℃温
度范围内活性均较高 ,其中 45 ℃是其发挥作用的
最适温度。此外 , 45 ～ 60℃棘托竹荪多酚氧化酶
的热稳定性都较高 , 45℃和 60℃保温 100 min其
相对酶活分别为 60%和 30%,但当温度达 90 ℃
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时 ,保温 8 min,酶已完全失活。可见 ,该酶的作用
温度范围较宽 ,对温度也比较敏感 ,通过调节温度
可以影响酶的活性。
多酚氧化酶活性能被各种抑制剂抑制 , 如
EDTA-Na2、Vc、L-Cys、C6H8O7和 NaCl等。 EDTA-
Na2为金属离子螯合剂 ,可螯合多酚氧化酶辅基
的铜离子 ,从而对该酶起抑制作用;Vc既是醌类
物质的还原剂 ,又可作为酶分子中铜离子的螯合
剂 [ 7] ;L-Cys可与酶促褐变反应的中间产物醌生
成稳定的无色物质 ,从而阻止黑色素的生成 [ 7] ;
C6H8O7含 3个羧基 ,对多酚氧化酶的辅基铜也有
较强的螯合作用 ,同时 C6H8O7的酸性还能降低
体系的 pH[ 8] ;NaCl可以驱除溶液中的氧气 ,同时
Na+可与多酚氧化酶中的 Cu2 +竞争 ,降低了多酚
氧化酶的活性。从实验结果看 ,相同浓度的 5种
抑制剂对棘托竹荪子实体多酚氧化酶的抑制作用
依次为 Vc>C6H8O7 >L-Cys>EDTA-Na2 >NaCl。
若使用单一抑制剂 ,要达到理想的抑制效果 ,所需
的剂量较大;若将各种抑制剂进行复配 ,则抑制效
果明显优于单一抑制剂 ,且抑制剂用量可大大
降低。
综上可知 ,以邻苯二酚为底物 ,棘托竹荪子实
体多酚氧化酶反应时间在 40 min内与产物生成
量基本呈直线关系;酶的最适反应温度为 45 ℃,
最适反应 pH为 8.0。可通过热处理 ,或改变 pH
或加入抑制剂 ,影响棘托竹荪子实体多酚氧化酶
的活性 。 5种相同浓度的抑制剂对该酶的抑制作
用为 Vc>C6H8O7 >L-Cys>EDTA-Na2 >NaCl。
应用正交试验筛选的复配抑制剂 (10.0 g/L
C6H8O7 、1.5 g/LVc、 5.0 g/LL-Cys、 20.0 g/L
NaCl),可以完全抑制棘托竹荪子实体多酚氧化
酶的活性。
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·更正·
本刊 2009年第 5期第 30 ～ 34页刊登的文章 “rhSCF在大肠埃希菌中的高效表达及纯
化 ” ,第一作者王克波 ,通讯作者应为王晶翼 ,特此更正 !
6 　　　　　　　　　微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　　30卷