全 文 ：植物资源与环境学报　2004 , 13(3):1-6 　　　　　　　　
Journal of Plant Resources and Environment　　　　　
　　　
棘托竹荪凝集素的纯化及其生化特性
林玉满1 , ① , 苏爱华2
(1.福建师范大学化学与材料学院,福建 福州 350007;2.福建卫生学校 ,福建福州 350001)
摘要　棘托竹荪(Dictyophora echinovolvata Zang , Zheng et Hu)子实体经生理盐水抽提 、硫酸铵沉淀 、DEAE-Sepharose和
Sephadex G-100 柱层析纯化得到棘托竹荪凝集素(DEL)。经 PAGE 显示单一条带 , 相对分子质量为38 000 , 其亚基相
对分子质量为 18 900;不含中性糖 , IEF-PAGE 测得其等电点为 4.21。该凝集素对供试的 4 种血型人血和 6 种动物
血的红细胞具有凝集作用 ,也能凝集小鼠淋巴细胞和小鼠S180肉瘤细胞 , 对兔红细胞的凝集作用可被乳糖和果糖所
抑制。DEL含有 15 种氨基酸 ,其中天冬氨酸 、谷氨酸 、甘氨酸和缬氨酸含量较高;N-末端为丙氨酸。 DEL对热不稳
定 ,经 50℃处理 10 min , 活性明显降低;在 pH 4.00 ～ pH 10.14 范围内较稳定;其凝血活性依赖于 Mn2+和 Ca2+,
Mg2+和 Zn2+则无影响。 DEL对小鼠腹腔注射的半致死量为 1 180 mg·kg-1。
关键词:凝集素;棘托竹荪;分离纯化;性质
中图分类号:Q946.1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-0978(2004)03-0001-06
Purification and characterization of the lectin from Dictyophora echinovolvata　LIN Yu-man1 , ① , SU Ai-
hua2(1.College of Chemistry and Materials Science ,Fujian Normal University , Fuzhou 350007 , China;2.
Fujian Health School , Fuzhou 350001 , China), J .Plant Resour.&Environ.2004 , 13(3):1-6
Abstract:The lectin DEL from the fruiting bodies of Dictyophora echinovolvata Zang , Zheng et Hu was
isolated and purified by physiological saline extraction , precipitation of 40% (NH4)2 SO4 and DEAE-
Sepharose, Sephadex G-100 chromatography purification.It turned out to be a single band in PAGE
identification.The relative molecular mass of DELwas 38 000 and the subunit 18 900 , its pIwas about 4.21.
This lectin agglutinated with 4 types of human erythrocytes and 6 types of animal erythrocytes , it also
agglutinated with the lymphocyte cells and S180 tumor cells from mouse.The hemagglutination of the lectin on
rabbit erythrocytes was inhibited by lactose and fructose.It contained 15 kinds of amino acid , in which the
contents of aspartic acid , glutamic acid , glycine and valine were relatively high.The N-terminal of DEL was
alanine.DEL was thermal-unstable , its agglutination activity decreased obviously after being heated 10 min at
50℃, but had high activity within pH 4.00-pH 10.14.Its activity was depended on Mn2+ and Ca2+ , not
on Mg2+ and Zn2+.DEL was toxic to mouse by celiac injection with a LD50 of 1 180 mg·kg-1.
Key words:lectin;Dictyophora echinovolvata Zang , Zheng et Hu;isolation and purification;characterization
　　凝集素广泛存在于动物 、植物和微生物中 ,在细
胞凝集 、免疫调节 、抑制肿瘤细胞生长 、鉴别人类血
型和分离纯化某些生物高分子成分等方面都有着重
要的作用[ 1] 。目前 ,凝集素主要来源于高等植物 ,而
从真菌类蕈菌中筛选 、分离和纯化凝集素的研究较
少。Pemberton[ 2]曾对 403 种蕈菌测定 ,发现约 50%
蕈菌子实体提取物对人血红细胞具有凝集作用 ,但
至今为止 ,己纯化的蕈菌凝集素尚不多 ,已成为商品
的蕈菌凝集素 ,只有双孢蘑菇凝集素1种 。
从蕈菌子实体或菌丝体中分离到的许多三萜类
和多糖类物质具有调节寄主的免疫活性和抗肿瘤作
用 ,而凝集素则是蕈菌所含的另一类重要生理活性
物质 ,部分蕈菌凝集素具有抑制肿瘤细胞生长等药
用功效 ,因此 ,对蕈菌凝集素的深入研究 ,将进一步
揭示蕈菌的药物学作用机制 ,为更好地开发利用这
一宝贵资源提供科学依据。
棘托竹荪(Dictyophora echinovolvata Zang , Zheng
et Hu)是食 、药兼用蕈菌之一 ,从其子实体中已分离
纯化具有抑制肿瘤活性的多糖 DE2-2[ 3] ,但其凝集
素的研究至今未见报道 。本文报道了从新鲜棘托竹
收稿日期:2004-01-28
基金项目:福建省教育厅资助项目(JB00029)和福建省高校测试基金
项目(CJ-057)
作者简介:林玉满(1962-), 男 ,福建仙游人 ,硕士 , 副研究员 ,主要
从事生物化学研究工作。
①　通信联系人 E-mail:ymlin@fjnu.edu.cn
荪子实体中分离纯化凝集素的结果及其该凝集素部
分性质的研究结果。
1　材料和方法
1.1　材料和试剂
供试样品采用人工栽培的新鲜棘托竹荪子实
体。小鼠 、兔由福建医科大学提供 ,鸡 、鸭 、鱼等购自
农贸市场 。小鼠 S180肉瘤细胞为福建医学科学研究
院赠送 ,人血由福建师范大学医院提供;低分子量标
准蛋白质 、Sephadex G-100 和 DEAE-Sepharose 为
Pharmacia 公司产品;Ampholine pH 3.5 ～ pH 10等电
聚焦电泳试剂均采用 LKB公司产品;N-乙酰半乳糖
胺 、半乳糖 、甘露糖和岩藻糖为 Sigma 公司产品 ,其
他糖为国产分析纯或生化试剂 ,其余试剂为分析纯 。
1.2　方法　
1.2.1　凝集素的分离和纯化　新鲜棘托竹荪子实
体洗净 、剪切后 ,用带冷却水的高速捣碎机匀浆 ,加
生理盐水抽提 , 抽提液加固体硫酸铵至 40%饱和
度 ,4℃离心(3 500 g ,20 min),分别收集上清液和沉
淀物 ,经测定沉淀物对兔红细胞具有高的血凝活性 ,
上清液则无活性。沉淀物溶于 PBS I(0.05 mol·L-1
磷酸缓冲液+0.15 mol·L-1 NaCl , pH 7.2),并对同
一缓冲液透析至外透析液无 SO42-检出后 ,取适量
透析后的粗品 , 上 DEAE-Sepharose 柱(1.6 cm ×
4 0 cm),用PBS Ⅱ(0.05 mol·L-1磷酸缓冲液+0.5
mol·L-1 NaCl , pH 7.2)对 PB(0.05 mol·L-1磷酸缓
冲液 ,pH 7.2)进行梯度洗脱 ,每管 5 mL ,分管收集 。
采用 LKB 柱层析系统自动检测 , 检测波长为 278
nm ,根据检测仪自动记录的各洗脱峰 ,用兔红细胞
检测各峰的血凝活性 。经活性测定后 ,收集活性部
分的洗脱液 , 冷冻干燥浓缩至适当体积 , 再经
Sephadex G-100柱(2.6 cm×60 cm)进一步纯化 ,洗脱
液为 PBS I , 每管5 mL ,分管收集 ,同法检测 ,活性部
分经蒸馏水透析去盐 ,冷冻干燥 ,得 DEL纯品 。
1.2.2 　纯度检查 　采用聚丙烯酰胺凝胶电
泳法测定[ 4] 。电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液
(pH 8.3),凝胶浓度7.5%。电泳后凝胶条分别以考
马斯亮蓝 R-250和高碘酸-Schiff试剂染色 。
1.2.3　血凝活性测定　人血和兔等动物血血样加
入Alsever抗凝剂 ,离心去除血浆 ,血球用生理盐水
洗涤 3 ～ 5次 ,最后配成 2%红细胞悬液 。
参照文献[ 1] 方法 ,在“V”型血凝板中每孔加
25μL PBS I ,取 25 μL凝集素溶液与等量 PBS I 作倍
比稀释 ,然后加 25 μL 2%兔红细胞 ,振荡后室温放
置 2 h ,肉眼或显微镜观察结果 。
1.2.4　热稳定性测定　按文献[ 5] 方法进行 ,凝集
素初始浓度为300 μg·mL-1 ,保温时间 10 min 。
1.2.5　酸碱稳定性测定　凝集素初始浓度为 300
μg·mL-1 ,在 pH 4.00 ～ pH 10.14 缓冲系统中 ,25℃
静置 2 h ,经倍比稀释后 ,用兔红细胞测定不同 pH
条件的血凝活性。pH 4.00 ～ pH 6.00:采用 0.015
mol·L-1柠檬酸-Na2HPO3缓冲液 ;pH 6 .5 0 ～
pH 7 .5 0:采用0.015 mol·L-1磷酸盐缓冲液 ;
pH 8.00 ～ pH 9.00:采用 0.015 mol·L-1 Tris-HCl缓
冲液;pH 9.51 ～ pH 10.14:采用0.015 mol·L-1
Na2CO3-NaHCO3缓冲液 。
1.2.6　糖含量测定　按 Dubois的方法进行[ 6] 。配
制 400 mg·L-1葡萄糖标准溶液 , 分别取 0.4 、 0.6 、
0.8 、1.0 、1.2 、1.4 、1.6和 1.8 mL ,各加 H2O至 2.0
mL ,然后加入 6%苯酚 1.0 mL ,浓 H2SO4 5.0 mL ,静
止 10 min ,摇匀 ,室温放置 20 min ,于 490 nm 测定吸
光度 A490 ,以糖微克数为横坐标 ,A490为纵坐标 ,绘制
标准曲线 。样品按同法测定 ,根据标准曲线计算糖
含量。
1.2.7　氨基酸组成分析　由国家医药管理局福建
省微生物研究所测定。凝集素用 6 mol·L-1 HCl于
110℃水解 24 h ,用 HITACH 835-50型氨基酸自动分
析仪测定。
1.2.8　亚基相对分子质量测定　按文献[ 7] 的方
法 ,采用 1%SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 ,凝胶
浓度7.5%,内含巯基乙醇;考马斯亮蓝 R-250染色。
所用标准蛋白质为磷酸化酶 b(94 000)、牛血清白蛋
白(67 000)、卵清蛋白(43 000)、碳酸酐酶(30 000)、
大 豆胰蛋白酶抑制剂(20 100)和α-乳清蛋白
(14 400)。根据标准蛋白质和凝集素的迁移率 ,按
Weber的方法求得亚基相对分子质量[ 8] 。
1.2.9　相对分子质量测定　采用 Sephadex G-100凝
胶过滤法。分子量标准蛋白质为:牛血清白蛋白
(67 000)、卵清蛋白(43 000)、胰凝乳蛋白酶原
(25 000)和核糖核酸酶(13 700)。有效分配系数 K av
=(Ve-V0)/(Vt-V0), V0为外水体积 , V t为凝胶床
体积 , Ve为洗脱体积 ,根据各分子量标准蛋白质的
洗脱体积 Ve ,求出相应的 K av ,而 K av与蛋白质分子
2　　　　　　　　　　　　　　　　　　　植 物 资 源 与 环 境 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 13 卷
量存在着线性关系 ,即 K av =-blgM+C , 以标准蛋
白分子量的对数为纵坐标 ,以 K av为横坐标作图 ,绘
制标准曲线 ,根据DEL的洗脱体积 ,求出相应的 K av
值 ,从标准曲线求得 DEL的相对分子质量。
1 .2.10　糖抑制实验[ 1] 　凝集素的初始浓度为300
μg·mL-1 ,在“V”型血凝板上 ,凝集素倍比稀释后 ,加
入40 mmol·L-1各种糖溶液 ,混合 ,1 h后加入 25 μL
2%兔红细胞 ,振荡后室温放置 2 h ,观察凝集结果 。
1.2.11　等电点测定　采用等电聚焦电泳法 ,测定
方法参照 LKB 公司生产的多用电泳仪操作手册 ,
Ampholine的pH范围为3.5 ～ 10 .0 , 凝胶浓度为
4.8%,采用表面电极测定凝胶板的 pH值。
1.2.12　金属离子对凝集活性的影响　取 2 ～ 3 mL
凝集素溶液对 10 mmol·L-1 EDTA 溶液(生理盐水配
制)充分透析 , 再用生理盐水充分透析去除多余
EDTA ,待用 。取已去除金属离子的凝集素溶液
25μL ,用生理盐水进行倍比稀释后 ,分别加入 10
nmol·L-1 Ca2+ 、Mn2+ 、Zn2+和 Mg2+ 25 μL ,振摇后 ,
分别加入 25 μL 兔红细胞悬液 ,室温放置 2 h ,显微
镜下检查凝集结果。并以未经 EDTA处理的凝集素
溶液为对照组。
1.2.13　N-末端测定　按照 Chang[ 9]的方法进行。
1.2.14　对小鼠淋巴细胞和 S180肉瘤细胞凝集活性
测定
1.2.14.1　淋巴细胞和 S180肉瘤细胞分离　淋巴细
胞的分离:小鼠眼眶放血致死 ,取小鼠脾脏 ,研磨分
散细胞后 ,加在淋巴细胞分离液上进行离心分离 ,分
离出的淋巴细胞经生理盐水离心洗涤后 ,用生理盐
水配成1 mL含 1×107个细胞的悬液 。
S180肉瘤细胞的分离:将带瘤的小鼠眼眶放血致
死 ,取长于小鼠腋下的肉瘤 ,除去结缔组织 ,剪切成
小块 ,用生理盐水洗去血污 ,经研磨分散细胞 ,离心
洗涤 2次后 ,配成 1 mL 含 1×107个小鼠 S180肉瘤细
胞的悬液 。
1.2.14.2　凝集活性测定　参照文献[ 1]方法进行 。
300μg·mL-1凝集素溶液与等量的 PBS Ⅰ作倍比稀
释 ,分别加入小鼠淋巴细胞和 S180肉瘤细胞 ,观察凝
集结果。
1.2.15　对小鼠的半致死剂量测定　参照夏炳南
等[ 10]方法 。选用刚成年的健康小鼠 50只 ,每只重
约20 g ,随机分成 5组 ,每组10只;预先确定 DEL 对
小鼠的最大全不死量(LD0)和最小的全致死量
(LD100),再确定中间剂量 ,给小鼠腹腔注射不同剂
量的 DEL ,注射后观察 3 d ,根据各组小鼠的死亡数
计算死亡率。采用目测概率单位法 ,计算出小鼠的
半致死剂量 。
2　结果和分析
2.1　棘托竹荪凝集素的分离和纯化
棘托竹荪子实体经捣碎 、生理盐水抽提和硫酸
铵沉淀得到凝集素粗品。该粗品经 DEAE-Sepharose
柱层析 ,用PBS Ⅱ对 PB 进行梯度洗脱 ,得到 4个洗
脱峰(图 1),经血凝活性测定 ,第 3个洗脱峰具有高
的血凝活性 ,该活性部分经 Sephadex G-100 柱进一
步纯化 ,得到 2个洗脱峰(图 2),经血凝活性测定 ,
第 2峰具有血凝活性 ,而第 1峰则无活性 。收集第 2
洗脱峰的洗脱液 ,经透析去盐 ,冷冻干燥后获得棘托
竹荪凝集素纯品 DEL。
a:洗脱曲线 Elution curve;b:洗脱剂 Eluant
图 1　棘托竹荪凝集素的 DEAE-Sepharose柱层析洗脱曲线
Fig.1　The elution curve of DEAE-Sepharose chromatography of
Dictyophora echinovolvata Zang, Zheng et Hu lectin
图 2　棘托竹荪凝集素的 Sephadex G-100柱层析洗脱曲线
(PBSI洗脱)
Fig.2　The elution curve of sephadex G-100 chromatography of
Dictyophora echinovolvata Zang , Zheng et Hu lectin Eluted with PBS I
3第 3 期　　　　　　　　　　　　　林平满等:棘托竹荪凝集素的纯化及其生化特性
2.2　棘托竹荪凝集素纯度鉴定
DEAE-Sepharose 柱层析的第 3峰粗品经聚丙烯
酰胺凝胶电泳 ,考马斯亮蓝染色 ,呈现 2条着色带
(图 3-A),用 Sephadex G-100柱进一步纯化 ,活性峰
样品经电泳 ,考马斯亮蓝染色 , 呈现出单一着色带
(图 3-B),但用高碘酸-Schiff试剂进行糖蛋白染色则
不着色。电泳结果显示所得到的凝集素为纯品。
2.3　棘托竹荪凝集素相对分子质量和亚基相对分
子质量测定
经1%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,按Weber 方
法 ,根据标准蛋白质分子质量标准曲线求得棘托竹
荪凝集素亚基相对分子质量为 18 900(图 4)。
A:凝集素粗品 Crude lectin;B:凝集素纯品 Puried lectin
图 3　棘托竹荪凝集素的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
Fig.3　The pattern of Dictyophora echinovolvata
Zang , Zheng et Hu lectin on PAGE
1.磷酸化酶 b　Phosphorylase b(94 000);　2.牛血清白蛋白 Albumin
(67 000);3.卵清蛋白 Ovalbumin(43 000);4.碳酸酐酶 Carbonic
anhydrase(30 000);5.大豆胰蛋白酶抑制剂 Trypsin inhibitor(20 100);
6.α-乳清蛋白α-Lactalbumin(14 400);a.棘托竹荪凝集素亚基 The
subuni t of Dictyophora echinovolvata
图 4　棘托竹荪凝集素亚基相对分子质量的测定
Fig.4 　Determination of relative molecular mass of the subunit of
Dictyophora echinovolvata Zang , Zheng et Hu lectin
DEL经 Sephadex G-100凝胶过滤 , 呈现单一对
称的洗脱峰 。经测定外水体积 V0=67.5 mL ,洗脱
体积 Ve =116.4 mL , 可求得 K av =0.33。根据 K av
值 ,即可计算出其相对分子质量为 38 000。上述结
果表明该凝集素是由相对分子质量相同的 2个亚基
组成。
2.4　氨基酸组成分析和中性糖含量测定
DEL 的氨基酸组成见表 1。由于在水解过程中
色氨酸全部被破坏 ,故无法计算 。从表1可以看出 ,
该凝集素含有 15种氨基酸 ,且富含天冬氨酸 、谷氨
酸 、甘氨酸和缬氨酸。
经苯酚-硫酸法检测 ,DEL不含中性糖 。
表 1　棘托竹荪凝集素的氨基酸组成和含量1)
Table 1　The composition and contents of amino acids of Dictyophora
echinovolvata Zang, Zheng et Hu lectin1)
氨基酸
Amino acid
氨基酸含量/ g·g -1
Amino acid content
氨基酸
Amino acid
氨基酸含量/g·g-1
Amino acid content
Asp 0.122 7 Thr 0.077 3
Ser 0.071 3 Glu 0.108 1
Gly 0.095 6 Ala 0.085 5
Cys / Val 0.093 1
Ile 0.081 3 Leu 0.063 7
Tyr 0.051 4 Phe 0.036 8
Lys 0.027 8 Arg 0.033 2
Pro 0.025 4 His 0.012 3
Met / Trp ND
　1)ND:未测 Not determination
2.5　糖抑制实验
棘托竹荪子实体凝集素的糖抑制实验结果见表
2。从表 2可知 ,该凝集素的凝集活性可被乳糖和果
糖所抑制。
表 2　糖对棘托竹荪凝集素凝血活性的抑制作用1)
Table 2 　 Inhibition to agglutination activity of Dictyophora
echinovolvata Zang, Zheng et Hu lectin by sugars1)
　糖
Sugar
倍比稀释的凝集素的凝集活性
Agglutination activity of
serial 2-fold dilution of lectin
2-1 2-2 2-3 2-4 2-5
半乳糖 Gal + + + + +
甘露糖 Man + + + + +
岩藻糖 Fuc + + + + +
阿拉伯糖 Ara + + + + +
果糖 Fru - - - - -
木糖 Xyl + + + + +
鼠李糖 Rha + + + + +
N-乙酰葡萄糖胺 GlcNAc + + + + +
N-乙酰半乳糖胺 GalNA + + + + +
蔗糖 Suc + + + + +
葡萄糖 Glc + + + + +
乳糖 Lac - - - - -
　1)+:凝集 Hemagglutination;-:不凝集 Non-hemagglutination
4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　植 物 资 源 与 环 境 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 13 卷
2.6　棘托竹荪凝集素对红细胞的凝血活性
棘托竹荪凝集素初始浓度为300μg·mL-1 ,经倍
比稀释后 ,对不同种属红细胞凝集作用见表 3。结
果表明 , DEL 对所测试的各种血红细胞均有凝集作
用 ,但凝集强度有很大差异 。对兔红细胞的凝集活
性最高 ,最低凝集浓度为0.30μg·mL-1 ,对鳖红细胞
的凝集活性最低 ,最低凝集浓度为 37.50 μg·mL-1 ,
而对不同血型人血红细胞的凝集活性则相差无几 ,
最低凝集浓度为 4.36 ～ 9.38μg·mL-1 。
2.7　棘托竹荪凝集素对小鼠淋巴细胞和 S180肉瘤
细胞的凝集作用
DEL对小鼠淋巴细胞和小鼠 S180肉瘤细胞均有
凝集作用 ,但强度差异较大(见表 4)。对小鼠淋巴
细胞最低凝集浓度为 18.75μg·mL-1 ,而对小鼠 S180
肉瘤细胞最低凝集浓度为 2.35 μg·mL-1 。
2.8　棘托竹荪凝集素等电点和N-末端测定
经等电聚焦电泳显示棘托竹荪凝集素pI为
表 3　棘托竹荪凝集素的凝血活性1)
Table 3　Agglutinating activity of Dictyophora echinovolvata Zang ,
Zheng et Hu lectin1)
红细胞
Red cell
倍比稀释的凝集素的凝血活性
Agglutinating activity of serial 2-fold di lution of lectin
2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6 2-7 2-8 2-9 2-10 2-11
人 Human
　A型 type A + + + + + - - - - - -
　B型 type B + + + + + + - - - - -
　AB型 type AB + + + + + + - - - - -
　O型 type O + + + + + - - - - - -
兔 Rabbit + + + + + + + + + + -
小牛 Calf + + + + + + + - - - -
鸭 Duck + + + + - - - - - - -
鸡 Chicken + + + + + + - - - - -
鲫鱼 Crucian + + + + + + + + - - -
鳖 Tertle + + + - - - - - - - -
　1)+:凝集 Hemagglutination;-:不凝集 Non-hemagglutinat ion
表 4　棘托竹荪凝集素对小鼠淋巴细胞和 S180肉瘤细胞的凝集活
性1)
Table 4　The agglutination activity of Dictyophora echinovolvata Zang ,
Zheng et Hu lectin to lymphocyte and S180 tumor cell of mouse
1)
细胞种类
　Cell
倍比稀释的凝集素的凝集活性
Agglutination activity of serial
2-fold di lution of lectin
2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6 2-7 2-8 2-9
淋巴细胞 Lymphocyte + + + + - - - - -
S180肉瘤细胞
　S180 tumor cell
+ + + + + + + - -
　1)+:凝集 Hemagglutination;-:不凝集 Non-hemagglutinat ion
4.21。其 N-末端为丙氨酸 。
2.9　棘托竹荪凝集素的热稳定性
温度对棘托竹荪凝集素凝集活性的影响见表
5。结果表明 ,该凝集素经 50℃处理 10 min ,其凝集
活性降低较为明显;60 ～ 100℃处理后 ,活性则完全
消失 ,说明该凝集素对热不稳定性。
表 5　不同温度对棘托竹荪凝集素活性的影响1)
Table 5　Effect of temperature on agglutination activity of Dictyophora
echinovolvata Zang, Zheng et Hu lectin1)
　温度/ ℃
Temperature
倍比稀释的凝集素的凝集活性
Agglutination activity of serial
2-fold dilution of lectin
2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6 2-7 2-8 2-9 2-10
20 + + + + + + - - - -
30 + + + + + + - - - -
40 + + + + + - - - - -
50 + + + - - - - - - -
60 - - - - - - - - - -
70, 80 ,90 , 100 - - - - - - - - - -
　1)+:凝集 Hemagglutination;-:不凝集 Non-hemagglutination
2.10　棘托竹荪凝集素的酸碱稳定性
不同 pH值对棘托竹荪凝集素凝集活性的影响
见表 6。结果表明 ,在 pH 4.00 ～ pH 10.14之间 ,凝
集活性高;当 pH为 4.00或10.14时 ,其活性略有下
降 。这说明该凝集素对酸碱具有较高的稳定性 。
表 6　pH值对棘托竹荪凝集素凝集活性的影响1)
Table 6 　 Effect of pH on agglutination activity of Dictyophora
echinovolvata Zang, Zheng et Hu lectin1)
　pH
倍比稀释的凝集素的凝集活性
Agglutination activity of serial
2-fold dilution of lectin
2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6 2-7
4.00 + + + + + - -
4.50 + + + + + + -
5.00 + + + + + + -
6.00 + + + + + + -
6.50 + + + + + + -
7.00 + + + + + + -
7.50 + + + + + + -
8.00 + + + + + + -
8.50 + + + + + + -
8.90 + + + + + + -
9.51 + + + + + + -
10.14 + + + + - - -
　1)+:凝集 Hemagglutination;-:不凝集 Non-hemagglutination
2.11　金属离子对棘托竹荪凝集素凝集活性的影响
金属离子对棘托竹荪凝集素凝集活性的影响见
表 7。该凝集素对兔红细胞的凝集活性与金属离子
5第 3 期　　　　　　　　　　　　　林平满等:棘托竹荪凝集素的纯化及其生化特性
有关 。DEL 经 EDTA去除金属离子后 ,其活性消失;
而 Ca2+和 Mn2+可使该凝集素的活性完全恢复 ,
Mg
2+和 Zn2+对其活性则无影响。
表 7　金属离子对棘托竹荪凝集素凝集活性的影响1)
Table 7　Influence of metal ions on agglutination activity of Dictyophora
echinovolvata Zang , Zheng et Hu lectin1)
　处理
Treatment
不同浓度凝集素的凝集活性
Agglutination activity of different
concentration/μg·mL-1
300.0 150.0 75.0 37.5 18.75 9.38 4.69
Non-EDTA + + + + + + +
EDTA - - - - - - -
Mg2+ - - - - - - -
Ca2+ + + + + + + +
Zn2+ - - - - - - -
Mn2+ + + + + + + +
　1) +:凝集 Hemagglutination;-:不凝集 Non-hemagglutination;Non-
EDTA:未经 DETA处理的凝集素(对照)Lectin without treatment
with DETA(contrast);EDTA:经 EDTA处理的凝集素(不含金属
离子)Lectin treated with EDTA(without metal ion)
2.13　棘托竹荪凝集素对小鼠的急性毒性
棘托竹荪凝集素对小鼠的急性毒性实验
结果见表 8。根据各组死亡率 , 计算出该凝集素对
小鼠的 LD50为 1 180 mg·kg-1 ,表明经腹腔注射 ,棘
托竹荪凝集素对小鼠具有中等毒性 。
表 8　棘托竹荪凝集素对小鼠的毒性
Table 8　Toxic activity of Dictyophora echinovolvata Zang, Zheng et
Hu lectin to mouse
剂量
/mg·kg -1
Dose
对数剂量
Logarithm
of dose
总小鼠数
Total
number
of mice
死亡数
Dead
number
of mice
死亡率/%
Dead
ratio
概率单位
Probabi lity
unit
　850 2.929 10 0 　0 -
1 091 3.038 10 2 20 4.16
1 399 3.146 10 6 60 5.25
1 795 3.254 10 9 90 6.28
2 300 3.362 10 10 100 -
3　讨　　论
棘托竹荪凝集素经聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,考马
斯亮蓝染色 ,呈现出单一着色带 ,高碘酸-Schiff试剂
染色则不着色 ,苯酚-硫酸法测定不含中性糖 , 推测
DEL不含糖 ,可能是 1种简单蛋白质。氨基酸分析
表明其含有 15种氨基酸 ,特别是富含天冬氨酸 、谷
氨酸 、甘氨酸和缬氨酸 ,这可能与其空间结构的特异
性密切相关 。因未进行碱水解氨基酸分析 ,该凝集
素是否含有色氨酸需做进一步测定。
乳糖和果糖能抑制 DEL凝集活性 ,可能与 DEL
结合细胞受体的糖结合专一性有关。由于糖结合特
异性是凝集素的最重要特征之一 ,继续研究 DEL 的
糖结合特性 ,对DEL的生理活性等研究有着重要意
义 。DEL 对小鼠淋巴细胞和 S180肉瘤细胞均有凝集
作用 ,说明其凝集作用无选择性;对不同血型人血红
细胞和不同动物的血红细胞均具有凝集作用 ,说明
其凝集作用不具种属专一性 。
有关蕈菌凝集素对小鼠的急性毒性的研究报道
不多 ,草菇凝集素[ 11]对小鼠的半致死剂量 LD50为
17.5 mg·kg-1 ,杨树菇凝集素[ 12]对小鼠的半致死剂
量 LD50为15.85mg·kg-1 ,而DEL 对小鼠的半致死剂
量 LD50为 1 180 mg·kg-1 ,毒性明显低于前两者。
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