全 文 ： 由表可以看出 , 3种溶剂法所得五味子多糖对大肠杆菌 、
金黄色葡萄球菌 、白色念珠菌 、铜绿假单胞菌 、肺炎白氏克雷
菌 、枯草杆菌等几种菌种的生长均有不同程度的抑制作用 ,
其中对金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、肺炎白氏克雷菌的抑制
作用较强 , 且 3种溶剂法所得五味子多糖对不同菌种的抑制
作用没有显著性差异。 其中阴性对照实验可知溶剂蒸馏水
对几种菌种均无任何抑制作用 ,阳性对照实验显示 0.08 mg/
mL的多糖对金黄色葡萄球菌 、白色念珠菌 、铜绿假单胞菌 、
肺炎白氏克雷菌 、枯草杆菌均优于 2000 U/mL-1的青霉素
钠 , 而对大肠杆菌的抑制作用却是 2000 U/mL-1的青霉素钠
优于 0.08 mg/mL的多糖。
3 结 论
五味子多糖对 O-
2
·和· OH具有一定的抗氧化能力 ,同
浓度醇碱法所得五味子多糖的抗氧化性明显优于水提法和
碱提法所得多糖 , 可能是因为乙醇的存在保护了某些与抗氧
化性有关的功能基团的稳定性;五味子多糖对金黄色葡萄球
菌 、枯草杆菌 、肺炎白氏克雷菌的抑制作用较强 ,不同溶剂所
得同浓度五味子多糖对同一菌种的抑制作用却基本一致 ,说
明提取溶剂对抑菌作用相关因素几乎没有任何影响 , 同时说
明多糖抑菌的机理与抗氧化机理不相同 , 与这些被乙醇保护
的基团没有关联;五味子多糖对不同菌种的抑制效果不相
同 , 说明五味子多糖对各种菌种的抑制机理存在着差异。
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淡竹叶多糖的提取及体外抗氧化性研究
李志洲
(陕西理工化学与环境科学学院 ,陕西 汉中 723000)
收稿日期:2007-02-05
作者简介:李志洲(1969～ ),男 ,副教授 ,在职研究生;主要从事天然产物的提取及应用研究。 电话:13571629918;0916-2641660;E-mail:
lizhizhou136@sina.com。
关键词:淡竹叶;多糖;纯化;抗氧化
中图分类号:R285.6 文献标识码:B 文章编号:1001-1528(2008)03-0434-03
淡竹叶(LophatherumgracileBrongn)为多年生 、直立宿
根草本 , 高 50 ～ 100cm,具有一定的生物活性 , 近几年来受到
国内外学者关注。现在已经利用从淡竹叶提取出的有效成
分再配以其它辅料 , 制成了具有清热解毒 、清心利尿 、健脾益
气 、消暑解渴功能的纯天然清凉保健饮料。
多糖具有多种生物活性 , 某些多糖不但具有抗癌 、抗病
毒 、抗衰老等作用 ,还是理想的免疫增强剂。因此 ,关于多糖
的研究具有十分重要的意义 [ 1] 。到目前为止 , 已有近 300种
的多糖类化合物从天然产物中分离出来 , 其中从植物中 , 尤
其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要 ,从植物中提取多
糖 , 主要根据其不同的溶解度来选择不同的溶剂进行。 提取
多糖最常用的浸提剂为水(冷水或热水),稀酸 , 稀碱以及二
甲亚砜等溶剂。二甲亚砜价格昂贵 , 并且对人体有害 ,不适
合工业化生产和应用 。用稀酸提取时要求时间短 ,温度最好
不要高于 5 ℃,生产中要考虑制冷 , 增加了成本。用稀碱液
提取多糖时 ,稀碱液有助于植物细胞壁分子间的化学和物理
作用 ,增加了多糖的提取率 ,成本较低 [ 2] 。因此本实验采用
热水浸提法 ,对淡竹叶多糖的提取条件 , 抗氧化性进行了研
究 ,以期为淡竹叶资源的进一步开发利用提供理论依据 , 提
高其利用价值。
1 仪器 , 材料和试剂
1.1 仪器 722E型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪
器有限公司);DZKW-D恒温水浴锅;GR-200电子天平
(A＆DCompany, Limited.MadeinJapan);TDLOB离心机
(上海安亭科学仪器厂)等。
1.2 材料 淡竹叶(市售 ,产地:广西),烘干 、粉碎后备用。
1.3 试剂 苯酚 , 葡萄糖 ,浓硫酸 , 氯仿 ,正丁醇 ,无水乙醇 ,
丙酮 ,乙醚 , 硫酸亚铁铵 , 维生素 C, 邻苯三酚 , 邻二氮菲 , 氢
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氧化钠 , 考马斯亮蓝 G250 ,牛血清蛋白(上海生化试剂厂), 以
上试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 多糖含量的测定
2.1.1 制作标准曲线
采用苯酚—硫酸法 [ 2, 3]绘制标准曲线 , 得回归方程为:A
=9.36C-0.001 75, r=0.998 7
2.1.2 样品含量的测定
将提取液样品准确稀释合适的倍数 ,吸取 1 mL溶液 , 加
入 6%苯酚 1.0mL及浓硫酸 5.0mL,振荡 , 于 100 ℃水浴加
热 10min,放冷。以 2.0mL水同样显色操作为空白 , 于 490
nm处测量其吸光度 ,再用标准曲线的回归方程即可计算出
样品中多糖含量。
计算公式:
总糖百分含量 =(测量浓度 ×稀释倍数 ×提取液体积 /
原料干重)×100%
2.2 多糖的提取
采用热水浸提法 [ 4] , 并通过正交实验对多糖的提取条件
进行优化。
2.3 多糖的纯化—考马斯亮蓝 G
250
与 Sevag结合法
2.3.1 标准曲线的绘制
取 6支试管 , 按表 1数据配制牛血清白蛋白溶液各 5
mL。
表 1 牛血清白蛋白溶液的配制
管号 牛血清白蛋白溶液 /mL 蒸馏水 /mL 蛋白质浓度 /μg/mL
1 0 5 0
2 1 4 200
3 2 3 400
4 3 2 600
5 4 1 800
6 5 0 1 000
准确吸取所配各管溶液 0.2 mL,放入试管中 ,加入考马
斯亮蓝 G250蛋白试剂 10 mL, 振荡充分混匀 , 放置 2 min, 在
595nm下测吸光度 ,以蒸馏水为空白样作出标准曲线 , 得回
归方程。
2.3.2 样品提取液中蛋白质含量的测定
向粗多糖中加入一定量的蒸馏水 ,待充分溶解后 ,准确
吸取多糖液 0.2 mL, 放入具塞试管中 , 加入考马斯亮蓝 G250
蛋白试剂 10mL,振荡充分混匀 ,放置 2 min,在 595 nm下测
吸光度 , 以蒸馏水为空白样 ,并通过标准曲线 ,查得蛋白质浓
度 , 将吸光度代入回归方程 ,计算蛋白质含量。计算公式为:
样品蛋白质含量(%)=(C×多糖液总体积 (mL)×
10-3)/样品鲜重(g)
式中:C为在标准曲线上查得的蛋白质浓度。
2.3.3 脱除蛋白质
采用 Sevag法去除蛋白质 [ 2 , 7-14] 。 取 25 mL粗多糖液 ,
按(氯仿-正丁醇-多糖液 =5∶1∶25)比例加入分液漏斗中 , 摇
匀 , 静置 ,萃取分离 , 取水相测蛋白质含量后 , 以相同比例连
续萃取至蛋白质含量变化不大时 ,向其中加入 3倍量无水乙
醇 ,沉淀多糖 , 离心得沉淀物。沉淀分别用无水乙醇和丙酮
反复洗涤 [ 5] ,干燥 , 得脱蛋白精制多糖。
2.4 淡竹叶多糖的抗氧化性
2.4.1 样品对· OH的清除作用 [ 6]
取 7支 10 mL试管 , 均依次加入 1.0 mL, pH=8.20的
Tris-HCl溶液 , 0.3 mL, 7.5 mmol/L硫酸亚铁铵溶液和 0.3
mL, 7.5 mmol/L邻二氮菲溶液 , 1号为空白 2号再加入 0.2
mL, 7.5 mmol/L过氧化氢溶液 , 3 ～ 6号分别加入 1 mL不同
浓度的多糖液 , 7号加入 1 mL, 0.2mg/mLVe(显色剂均在最
后定容前加入), 定容至刻度。在 37.0℃水浴中反应 1h,在
510 nm下测吸光度 A, 计算对· OH的清除率。
计算公式:· OH的清除率 =[ (A3 -A2)/A1 -A2 ] ×
100%
式中:A1和 A2分别为体系不加过氧化氢和加过氧化氢
时的吸光度 , A3为加入多糖溶液后的吸光度。
2.4.2 样品对 O-2 的清除作用 [ 8 , 11]
取 5支 10mL试管 , 向其中加 5mLTris-HCl缓冲液 , 2 ～
5号试管分别加入一定质量浓度的淡竹叶多糖溶液 , 将这 5
支试管在 25 ℃恒温水浴中放置 20 min后 ,加入 0.1 mL25
℃预热的邻笨三酚溶液 , 迅速混匀 ,在 5 min内 , 每隔 30 s在
420 nm处测定溶液的吸光度。计算吸光度随时间的变化
率 ,并与空白液比较 , 便可得出被测物抑制超氧阴离子积累
作用的能力。
清除率计算式:清除率 = F0 -FxF0 ×100%
式中:F0和 Fx分别表示空白溶液和被测溶液的吸光度
随时间的变化率。
3 结果与讨论
3.1 多糖提取的最佳工艺条件确定
3.1.1 多糖的提取
称取 5 g粉碎过的淡竹叶 , 加入一定量蒸馏水 , 置于烧
杯 ,放入恒温水浴中提取多糖一定时间后 , 过滤 , 得粗多糖
液 ,取粗多糖液 1 mL, 测量多糖含量。再将粗多糖液浓缩 ,
醇析 ,离心 , 烘干 ,得淡竹叶粗多糖 。
3.1.2 多糖提取最佳工艺条件的确定
首先进行了浸提温度 、浸提时间 、料液比 、pH值的单因
素实验 ,根据单因素实验结果设计正交试验 [ 12 , 13] ,试验的因
素水平见表 2。
表 2 正交试验因素与水平
因素水平 A温度 /℃ B浸提时间 /h C料液比 DpH值
1 70 1 1∶20 6
2 80 2 1∶30 7
3 90 3 1∶40 8
对上述因素及水平作 L
9
(34)正交试验 ,结果见表 3。
根据表 3结果分析可知 ,淡竹叶多糖提取的最佳工艺条
件为 A2B3C3D3 ,因 B2与 B3的影响程度相当 ,同时考虑到生
产周期 ,故采用 A2B2C3D3优化组合条件 , 即浸提温度为 80
℃,浸提时间为 2 h,料液比为 1∶40, pH=8, 在此条件下 , 采
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用热水浸提法提取淡竹叶多糖 , 提取率为 8.95%。 其因素
对多糖提取率影响的程度依次为 C>A>D>B。
表 3 淡竹叶多糖提取正交试验
试验号 A B C D 提取率 /%
1 1 1 1 1 1.89
2 1 2 2 2 3.75
3 1 3 3 3 5.81
4 2 1 2 3 4.70
5 2 2 3 3 8.95
6 2 3 1 2 4.95
7 3 1 3 2 7.34
8 3 2 1 3 2.51
9 3 3 2 1 5.12
K1 11.45 13.93 9.350 11.71
K2 18.60 15.21 13.57 16.04
K3 14.97 15.88 22.10 17.27
K1 3.82 4.64 3.12 3.90
K2 6.20 5.07 4.52 5.35
K3 4.99 5.29 7.37 5.76
R 2.38 0.65 4.25 1.86
3.2 多糖的纯化
3.2.1 标准曲线的绘制
采用考马斯亮蓝 G250染色法绘得标准曲线 , 得回归方程
为 A=0.028+0.592C r=0.998 9。
3.2.2 蛋白质含量的测定
提取的粗多糖经 Sevag法脱蛋白后 , 得到的结果如图 1。
图 1 Savag法蛋白脱除效果
由图知 , 当除蛋白质的次数达到 3次时 , 多糖中蛋白质
的含量已经很小 , 脱除率达到了 95%。
3.3 淡竹叶多糖的抗氧化性
3.3.1 多糖对· OH的清除率
精密称取一定量的精致多糖和 Vc, 配置不同浓度的淡
竹叶多糖溶液 、 0.2 mg/mL的 Vc溶液分别添加到 Tris-F2+e -
邻二氮菲-H2O2体系中 , 以蒸馏水为空白 ,在 37 ℃水浴中反
应 1h后 , 在 510 nm下测其吸光度 A,计算清除率 , 结果见表
4。
表 4 不同浓度多糖溶液对· OH的清除率
质量浓度 /mg/mL 清除率 /%
0.092 28.16
0.272 34.95
0.592 42.72
0.838 54.37
0.20(Vc) 41.75
由表 4可见 , 0.2 mg/mLVc溶液对 · OH的清除率为
41.75%,而当淡竹叶多糖溶液浓度为 0.592 mg/mL时 , 其清
除率已经超过了 Vc溶液 ,当淡竹叶多糖溶液的浓度为 0.838
mg/mL时 , 清除率已达 54.37%,这说明淡竹叶多糖对 · OH
有较强的清除作用。且随多糖浓度的增加 , 清除作用增强。
3.3.2 多糖对 O-2 的清除率
按 2.4.2所述方法 , 分别做了不同质量浓度的淡竹叶多
糖对 O-
2
的清除作用 ,结果见图 2。
图 2 多糖对超氧阴离子 O-
2
的清除作用
从图 2可以看出 ,当多糖浓度为 0.838mg/mL时 ,对 O-
2
的清除率已经达到了 41.37%, 这说明该多糖在体外可以清
除 O-2 , 具有直接清除超氧自由基的抗氧化活性。且随着多
糖液浓度的升高清除率也升高。
4 结论
(1)采用热水浸提淡竹叶中的多糖 ,提取最适条件为:
浸提温度 80 ℃,浸提时间 2 h, pH=8, 料水比 1∶40。在此条
件下多糖的提取率为 8.95%。 该法具有提取条件温和 、易
控制 、成本低 、易操作 ,避免使用有毒的有机溶剂 ,可行性强。
(2)采用考马斯亮蓝 G250染色法和 Sevag结合法 , 测得
淡竹叶粗多糖中蛋白质含量为 0.39%, 经过 3次脱蛋白后 ,
蛋白脱除率可达 95%。将这两种方法结合 , 突破了 Sevag法
脱除蛋白过程的定量分析弱项 , 同时 , 因考马斯亮蓝 G240染
色法常与胰蛋白酶结合进行蛋白脱除 , 成本较高 , 这两种方
法结合后有快捷 、准确 、成本低的优点。
(3)抗氧化实验结果表明 , 热水提取的淡竹叶多糖 , 对
· OH和 O-2 均有较强的清除能力 , 当淡竹叶多糖溶液的浓
度为 0.838 mg/mL时 , 清除率分别达到 54.37%和 41.37%,
这说明 ,淡竹叶多糖具有的较强的生理活性 , 具有较高的研
究开发价值。
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丹参在恶性梗阻性黄疸时对肿瘤血管影响的实验研究
王新春 , 夏荣龙 , 李永丽
(河南大学第一附属医院 ,河南大学消化疾病研究所 ,河南 开封 475001)
收稿日期:2007-02-10
作者简介:王新春(1964～ ),男 ,主任药师。研究方向:药效学及消化病治疗药物筛选。电话:0378-5661721。
关键词:恶性梗阻性黄疸;肿瘤血管密度;血管内皮生长因子(VEGF);丹参
中图分类号:R285.6 文献标识码:B 文章编号:1001-1528(2008)03-0437-02
本实验用 Walker-256肝癌株近肝门部肝实质内种植致
移植性肝癌侵袭高位胆管 , 造成胆道癌性狭窄 , 建立 SD大
鼠恶性梗阻性黄疸模型。通过对模型 ip丹参或 5-Fu,观察
肝癌 、癌周 、临近肝叶及肺组织中血管内皮生长因子
(VEGF)的表达 , 并对其结果进行统计学分析。
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物♂性 SD大鼠 104只 , 体重为(225±
25)g, 另备♂SD幼鼠 10只 ,体重在(100±25)g, 以供癌株传
代用。以上实验用 SD大鼠和幼鼠均为河南大学医学院动
物实验中心提供。 Walker-256肝癌细胞株由中国科学院上
海细胞生物所提供 , 已稳定传代 50次以上。抗 VEGF鼠单
克隆抗体(Labvisioncom.)、抗 CD34鼠单抗 、supervision免疫
组化试剂盒(单抗鼠 IgG)、Envision免疫组化染色剂盒(单抗
鼠 IgG)DAB显色剂均由 DAKO公司提供;复方丹参注射液
(上海第九制药厂 ,批号 00124509)。
1.2 方法 将 Walker-256瘤株从液氮中复苏 , 在传代鼠腹
腔内进行癌株扩增后 , 注入传代 SD幼鼠下肢内侧皮下。 5 d
后 , 在无菌条件下摘出实体瘤 , 取边缘生长活跃的鱼肉样癌
组织 , 切成 1mm×1 mm×1 mm瘤块 ,置于冰生理盐水中漂
洗后备接种用。将 SD大鼠用 20 g/L戊巴比妥(1.3mL/kg)
ip麻醉后 ,常规消毒 , 行腹正中切口进腹 , 充分显露肝门 , 置
手术放大镜视野下 , 在肝右叶与肝中叶的交界部距肝门 5
mm处 , 用眼科镊逆胆管走行方向潜行造隧深约 3 mm, 植入
备用的瘤块后 , 用棉签压迫止血。依次关腹 , 结束手术。常
规饲养 7 d, 即可完成模型鼠的复制 [ 1] 。随机分成 3组:生理
盐水 24只 , ipNS10 mL/kg×7 d。丹参实验组 40只 , ip丹参
10 mL/kg×7 d。 5-FU治疗组 40只 , ip300mg/kg×7d,将不
合格的模型鼠剔除(接种失败 、腹腔接种及无黄疸者)后。
结果实际得到观察数为生理盐水组 16只 、丹参实验组 34只
及 5-FU治疗组 30只。 7 d后 ,用乙醚开放吸入麻醉后 ,行正
中十字切口入腹 ,沿胸骨正中打开胸腔 , 迅速剪开心包行左
心室插管 ,先快后慢灌注生理盐水 100 mL和 40 g/L多聚甲
醛(0.1mol/L)PB固定液 300mL,剪开右心耳放血。待全身
灌注固定完全后 ,切取肝脏及肿瘤 、肺脏标本。 将组织块放
入 40 g/L多聚甲醛溶液中 ,选材 、脱水及石蜡包埋。记录肿
瘤体积 、肝内转移灶数目及肺转移情况 ,并计算:肿瘤体积 =
长径 ×短径 2 ÷2,抑瘤率 =(对照组平均瘤体 -实验组平均
瘤体)÷对照组平均瘤体 ×100%和抑转移率 =(对照组平
均转移率 -实验组平均转移率)÷对照组平均转移率 ×
100%。将选取肝瘤组织 、瘤周组织 、临近肝近叶(左内叶)
及肺组织行 HE染色 , 进行组织病理学检查;同时选取肝癌 、
癌周组织用抗 CD34单抗免疫组化检查测定癌组织中的微血
管密度(Microvesseldensity, MVD), 选取肝癌 、癌周 、临近肝
叶及肺组织中 VEGF表达的免疫组化检查。免疫组化染色
应用 Envision法 ,每例取 4张连续石蜡切片 , 二甲苯脱蜡 ,梯
度乙醇水化 ,微波修复抗原 , TBS冲洗 ,将切片置于湿盒 , 分
别滴入一抗(CD34.VEGF)。阴性对照用 TBS代替—抗室温
孵育 60 min, TBS缓冲液冲洗 ,滴入 Envision液 , 室温孵育 30
min, TBS缓冲液冲洗 , DAB显色 2 ～ 10 min。苏木精复染 、脱
水 、透明 、封固。肿瘤微血管(MVD)计效方法:每张染色片
100倍视野下选择 5个血管最多的肿瘤间质区 , 在 200倍视
野下进行微血管计数 ,共计数 5个视野 , 取其平均值。
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