全 文 ：第１９卷 第６期
Ｖｏｌ．１９ Ｎｏ．６
草 地 学 报
ＡＣＴＡ ＡＧＲＥＳＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
２０１１年 １１月
Ｎｏｖ． ２０１１
应用低能Ｎ＋介导法将大豆外源基因转入
羊柴成熟种子的初步研究
陈玲玲２，那 日１，乌艳红２＊，栾守泉２，正 月２
（１．内蒙古大学物理科学与技术学院／内蒙古大学离子束生物工程自治区重点实验室，内蒙古 呼和浩特 ０１００２１；
２．赤峰市农牧科学研究院，内蒙古 赤峰 ０２４０３１）
摘要：为研究低能Ｎ＋介导大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）基因遗传转化的影响，以羊柴（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）成熟种子为
材料，根据不同注入剂量下羊柴种子的发芽率，计算出羊柴种子发芽率的差异性并绘制出剂量－存活率曲线，找出
最适宜的转化剂量。结果表明：经离子束（２５ｋｅＶ，９００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２）注入后的羊柴成熟种子发芽率的差
异性和剂量－存活率曲线可以确定９００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２是最适宜的转化剂量。将处理后的羊柴种子浸入含
有大豆质粒ＤＮＡ的ＳＳＣ导入介质，２４ｈ后观察到受离子束直接作用的胚部有外源基因的导入和表达，检测到的
ＧＵＳ基因瞬间表达率为１３％，转化体的ＰＣＲ检测结果初步证实了大豆基因已经整合到羊柴基因组中。
关键字：离子束；羊柴；成熟种子；遗传转化
中图分类号：Ｑ７８５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－０４３５（２０１１）０６－１０３６－０６
Ｔｒａｓｆｅｒｉｎｇ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ Ｍａｔｕｒｅ
Ｓｅｅｄｓ ｂｙ Ｌｏｗ Ｅｎｅｒｇｙ Ｎ＋Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
ＣＨＥＮ Ｌｉｎｇ－ｌｉｎｇ２，ＮＡ Ｒｉ １，ＷＵ Ｙａｎ－ｈｏｎｇ２＊，ＬＵＡＮ Ｓｈｏｕ－ｑｕａｎ２，ＺＨＥＮＧ Ｙｕｅ２
（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｏｎ Ｂｅａｍ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ，
Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ０１００２１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｈｉｆｅｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｆｅｎｇ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ０２４０３１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｗ ｅｎｅｒｇｙ Ｎ＋ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ Ｈｅｄｙｓａｒｕｍｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ ｍａｔｕｒｅ ｓｅｅｄｓ ａｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．
Ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅｓ ｏｆ Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍｄｒｙ ｓｅｅｄｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｎ＋ｉｍｐｌａｎｔａ－
ｔｉｏｎ ｄｏｓａｇｅｓ ａｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｏｓａｇｅｓ ａｒｅ ９００×２．６×１０１３
Ｎ＋·ｃｍ－２．Ｔｈｅ ｂｌｕｅ ｃｅｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇβ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ａｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍｃａｌｕｓ ｗｉｔｈ
１３％ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｎｔｅ－
ｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍｇｅｎｏｍｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｉｏｎ ｂｅａｍ；Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ；Ｍａｔｕｒｅ ｓｅｅｄｓ；Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
低能离子束转基因技术打破了传统的转基因法
（基因枪、ＰＥＧ、花粉管通道）操作繁琐、转化率低、重
复性差、基因型依赖性强的限制，是一种较简单易行
的转基因方法。利用离子束对植物细胞的刻蚀作
用，造成受体细胞表面的损伤和穿孔，引起细胞膜透
性和跨膜电场的改变，将外源基因引入植物细
胞［１，２］。本研究利用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增出大豆（Ｇｌｙ－
ｃｉｎｅ ｍａｘ）１１Ｓ 球 蛋 白 Ｇｙ３ 的 ｃＤＮＡ 序 列，与
ｐＢＩ１２１表达载体连接后得到植物表达载体ｐＢＩ１２１／
Ｇｙ３，并用不同剂量的 Ｎ＋ 注入羊柴（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ
ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ）种子，根据其种子发芽率的差异性和
剂量－存活率曲线找出适宜的转化剂量范围，在离
子束的介导作用下，将大豆ＤＮＡ导入到羊柴干种
子中，并进行了ＧＵＳ染色和ＰＣＲ检测，为利用离子
束介导法进行植物转基因技术提供可行的途径。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
１．１．１ 植物材料 羊柴种子购于宁夏绿洲草业有
限公司。
收稿日期：２０１１－０３－０２；修回日期：２０１１－０７－２０
基金项目：国家自然科学基金（５０２６７００１）；内蒙古自治区自然科学基金重大项目（２００７１１０２０１０１）；内蒙古教育厅基金项目（ＮＪ０５０２５）资助
作者简介：陈玲玲（１９８２－），女，蒙古族，内蒙古赤峰人，硕士研究生，助理研究员，研究方向为牧草栽培与良种繁育，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｌｉｎｇｌｉｎｇ００１
＠ｔｏｍ．ｃｏｍ；＊通信作者 Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｙａｎｗｕｙａｎｈｏｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
第６期 陈玲玲等：应用低能Ｎ＋介导法将大豆外源基因转入羊柴成熟种子的初步研究
１．１．２ 菌株及质粒 已构建好的植物表达载体
ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３，ｐＢＩ１２１质粒中含有ＧＵＳ基因和卡那
霉素抗性基因，其中ＧＵＳ基因编码区有一个能在植
物中特异表达的内含子，使ＧＵＳ基因不能在细菌中
表达。
１．１．３ 酶与试剂 Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ Ｍｉｘ－
ｔｕｒｅ等试剂均购自ＴａＫａＲａ公司，随机引物由大连
宝生物工程公司合成，Ｘ－Ｇｌｕｃ为Ｓｉｇｍａ公司产品，
其他均为国产分析纯化学试剂。
１．２ 试验方法
１．２．１ 植物表达载体的构建 本试验利用 ＲＴ－
ＰＣＲ法扩增出大豆１１Ｓ球蛋白Ｇｙ３的ｃＤＮＡ序列，
并与ｐＢＩ１２１表达载体连接后得到植物表达载体
ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３，将其转化到感受态ＤＨ５α中，用碱裂
解法提取质粒，进行酶切和ＰＣＲ检测［３，４］。
１．２．２ 质粒ＤＮＡ的提取 参照《分子克隆实验指
南》［５］，用碱裂解法中量提取质粒ＤＮＡ，用紫外分光
光度仪测定ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８±０．０２，计算浓度后，
以２００μｇ·ｍＬ
－１溶解于０．１×ＳＳＣ（１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＮａＣｌ，１．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１柠檬酸钠，ｐＨ７．０）缓冲液中备
用。
１．２．３ 羊柴愈伤组织的培养 取羊柴成熟种子，剥
去种壳，常规消毒后用无菌手术刀切下胚部接种于
ＭＳ（添加２，４－Ｄ ２ｍｇ·Ｌ－１，６－ＢＡ １．５ｍｇ·Ｌ－１）诱
导愈伤组织培养基，２６℃暗培养２周［６，７］。
１．２．４ 植物材料对卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）敏
感性检测 试验针对重组质粒ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３上携带
的Ｋａｎ抗性基因，采用卡那霉素进行抗生素敏感性
检测。取相同生长状态的新鲜愈伤组织，记录愈伤
组织的初始重量Ｗ０，移入 Ｋａｎ浓度分别为０，２０，
４０，６０，８０，１００ｍｇ·Ｌ－１的愈伤继代培养基上，培养
３周后记录重量Ｗ１，计算愈伤重量增长率ｒ＝（Ｗ１
－Ｗ０）／Ｗ０，以Ｋａｎ浓度为０的愈伤重量增长率ｒ０
为对照，计算其他浓度条件下愈伤相对重量增长率
Ｒ＝ｒ／ｒ０，由此确定使用的Ｋａｎ筛选浓度［８，９］。
１．２．５ 离子束注入处理 将羊柴成熟种子去种壳
后，胚芽部分朝上插在花泥上，接受离子束注入。注
入离子为Ｎ＋，能量为２５ｋｅＶ，每个脉冲剂量为２．６
×１０１３ ｉｏｎｓ·ｃｍ－２，选用的注入剂量为：（０，１００，
２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，１１００，
１２００，１３００，１４００，１５００）×２．６×１０１３ ｉｏｎｓ·ｃｍ－２。
采用间歇式脉冲注入，每次脉冲剂量为１００，每次注
入间隔时间为５０ｓ。试验随机分组，每组３个重复，
每重复１５０粒种子［１０］。
１．２．６ 种子发芽率的统计 在直径为１０ｃｍ的培
养皿里放置２层滤纸，用蒸馏水润湿，将注入后的种
子和原种对照分别置于培养皿内，加入适量的蒸馏
水放入光照培养箱中２８℃下培养，每天光照时间１６
ｈ，并适时更换滤纸。自第６ｄ开始统计发芽率，至
第１５ｄ结束。
１．２．７ 转化试验 在介导转基因试验中，离子束处
理（注入剂量为９００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２完成后
立即将种子浸入含有质粒ＤＮＡ（２００μｇ·ｍＬ
－１）的
０．１×ＳＳＣ导入介质中，于２６℃温育２４ｈ，取出羊柴
种子用０．１×ＳＳＣ溶液反复冲洗３次，用无菌滤纸
吸干残存溶液，接种于 ＭＳ诱导培养基上，同时设２
个对照，１个是将种子放置于离子束注入环境中，但
不接受离子注入处理，同样浸入含质粒ＤＮＡ导入
介质中温育，记为ＣＫ１；另１个对照是将种子用与
处理相同的离子束处理，然后浸于不含质粒 ＤＮＡ
的导入介质中温育，记为ＣＫ２，２个对照其他操作均
和处理相同［１１，１２］。
１．２．８ 抗性愈伤组织的筛选培养 处理及２个对
照的羊柴种子接种于愈伤诱导培养基上生长３ｄ
后，移到含有适宜浓度Ｋａｎ的 ＭＳ继代筛选培养基
上筛选２代（２周／代）。
１．２．９ ＧＵＳ组织化学染色分析 参照Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ
等［１３］的方法和王关林［１４］的《植物基因工程》，检测转
化组织的β－葡萄糖苷酸酶活性。将共培养３ｄ的羊
柴种子浸入Ｘ－Ｇｌｕｃ染色反应液（５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１磷
酸钠缓冲液ｐＨ ７．０，０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１铁氰化钾，０．５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１亚铁氰化钾，１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ Ｎａ２ＥＤＴＡ，
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，２０％甲醇，０．５ｍｇ·ｍＬ－１ Ｘ－
Ｇｌｕｃ），３７℃水浴中保温至过夜；取出材料用７５％的
乙醇漂洗３次，显微镜下观察，白色背景上的蓝色斑
点为ＧＵＳ表达位点。
１．２．１０ ＰＣＲ 检测 用已设计的特异性引物
（ｐｒｉｍｅｒ１：５′－ＴＣＴＡ ＧＡＡＡ ＣＡＣＴ ＣＡＴＣ ＡＧＴＣ
ＡＴＣＡ Ｃ－３′，ｐｒｉｍｅｒ２：５′－ＧＧＡＴ ＣＣＣＴ ＡＡＧＣ ＣＡ－
ＣＡ ＧＣＴＣ ＴＣＴＴ Ｃ－３′），以未转入外源基因的羊柴
愈伤组织的基因组ＰＣＲ产物为阴性对照，用已克隆
的大豆球蛋白Ｇｙ３亚基的ｃＤＮＡ序列做阳性对照，
进行ＰＣＲ反应。取灭菌的２００Ｌ扩增管，采用２５Ｌ
反应体系：１０×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５Ｌ；ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ
２Ｌ；ｐｒｉｍｅｒ１ ０．２５Ｌ；ｐｒｉｍｅｒ２ ０．２５Ｌ；模板ＤＮＡ １
Ｌ；Ｔａｑ酶０．５Ｌ；ＭｇＣｌ２１．５１Ｌ；ｄｄＨ２Ｏ １Ｌ；将各种
药品混匀后，放入ＰＣＲ扩增仪中，按以下程序进行
７３０１
草 地 学 报 第１９卷
扩增：９４℃，５ｍｉｎ，ｌ ｃｙｃｌｅ；１０ｍｉｎ，９４℃，１ ｍｉｎ；
５６℃，４５ｓ；７２℃，２ｍｉｎ，３０ｃｙｃｌｅｓ；７２℃，１０ｍｉｎ；反
应完毕，取５Ｌ扩增产物在含ＥＢ的０．７％琼脂糖胶
中电泳，紫外观察照相。
１．３ 数据统计
各项数据统计均采用Ｅｘｃｅｌ ２００３和ＳＰＳＳ １１．５
统计软件进行。
２ 结果与分析
２．１ 植物表达载体的构建
构建好的植物表达载体的酶切和ＰＣＲ检测结
果如图１所示。
图１ 植物表达载体ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３的酶切和ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．１ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３
注：Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：植物表达载体ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３的酶切和ＰＣＲ检
测；２，３：植物表达载体ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３；４，５：植物表达载体ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３
分别经Ｘｂａｌ和ＢａｍＨ１单酶切；６：植物表达载体ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３分别
经Ｘｂａｌ和ＢａｍＨ１双酶切
Ｎｏｔｅ：Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３；２，３：Ｅｘｐｒｅｓ－
ｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３；４，５：ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｅｎ－
ｚｙｍｅ；６：ｐＢＩ１２１／Ｇｙ３ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅｓ
２．２ 离子束注入剂量－存活率曲线
成熟种子的注入剂量－存活曲线如图２所示
（多次注入的平均值）。
２．３ 差异显著性分析
经离子束处理后的羊柴种子发芽率差异显著性
分析如表１所示。
经差异显著性测定表明，羊柴（０（ＣＫ），１００，２００，
３００，４００，５００，６００，７００）×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２剂量
图２ 羊柴干种子注入的剂量－存活曲线
Ｆｉｇ．２ Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｏｆ Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ
ｄｒｙ ｓｅｅｄｓ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ Ｎ＋ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｄｏｓａｇｅｓ
表１ 羊柴不同剂量间发芽率的差异显著性测验
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｅｓｔｓ ｏｆ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓａｇｅｓ ｏｎ Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ
剂量组／Ｎ＋·ｃｍ－２
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓａｇｅｓ
发芽率／％
Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
０（ＣＫ） ９８．０ａＡ
４００×２．６×１０１３ ９８．０ａＡ
２００×２．６×１０１３ ９７．３ａＡ
６００×２．６×１０１３ ９７．３ａＡ
３００×２．６×１０１３ ９６．７ａＡ
１００×２．６×１０１３ ９５．３ａｂＡ
５００×２．６×１０１３ ９５．３ａｂＡ
７００×２．６×１０１３ ９４．０ａｂＡ
９００×２．６×１０１３ ８３．３ｂＡ
８００×２．６×１０１３ ８１．３ｂＡ
１０００×２．６×１０１３ ５９．３ｃＢ
１１００×２．６×１０１３ ５５．３ｃｄＢ
１２００×２．６×１０１３ ５２．７ｃｄＢ
１３００×２．６×１０１３ ４３．３ｄＢＣ
１４００×２．６×１０１３ ３０．７ｅＣ
１５００×２．６×１０１３ １４．０ｆＣ
注：不同的大、小写字母分别表示差异极显著（Ｐ＜０．０１）和显著
（Ｐ＜０．０５）
Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｐｉｔａｌ ａｎｄ ｓｍａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ０．０１ａｎｄ ０．０５，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
组种子发芽率极显著高于（１０００，１１００，１２００，１３００，
１ ４００，１５００）×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２剂量组（Ｐ＜
０．０１），显著高于９００×２．６×１０１３和８００×２．６×１０１３
（Ｐ＜０．０５）；９００×２．６×１０１３和８００×２．６×１０１３
Ｎ＋·ｃｍ－２剂量组种子发芽率极显著高于（１０００，
１１００，１２００，１３００，１４００，１５００）×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２
剂量组（Ｐ＜０．０１）；（１０００，１１００，１２００，１３００）×２．６
×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２极显著高于（１４００×２．６×１０１３和
１５００×２．６×１０１３ Ｎ＋ ·ｃｍ－２剂量组（Ｐ＜０．０１）；
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第６期 陈玲玲等：应用低能Ｎ＋介导法将大豆外源基因转入羊柴成熟种子的初步研究
（０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００）×２．６×１０１３
Ｎ＋·ｃｍ－２各剂量组之间，９００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２
与８００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２之间，１０００×２．６×１０１３，
１１００×２．６×１０１３，１２００×２．６×１０１３，１３００×２．６×１０１３
Ｎ＋·ｃｍ－２之间，１４００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２与１５００
×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２之间无显著差异。
２．４ 正交多项式回归分析
羊柴干种子经离子束注入后存活率依剂量变化
的正交多项式回归方程为：ｙ＝９４．１８７３５－７．１８７４
×１０－３ ｘ＋５．５７×１０－５ ｘ２－１．１５７５×１０－７ ｘ３ ＋
３．８６３５×１０－１１ ｘ４，ｙ为存活率，ｘ为离子束照射剂
量。对正交多项式回归方程进行Ｆ检验（表２）。
表２ 羊柴干种子发芽率依注入剂量的正交多项式回归的假设检验
Ｔａｂｌｅ ２ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｔｅｓｔｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｏｆ
Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍｄｒｙ ｓｅｅｄｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｎ＋ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｄｏｓａｇｅｓ
变异来源 ｄｆ ＳＳ ｓ２ Ｆ Ｆ０．０５ Ｆ０．０１
回归 ４ １１３８６．０５５７ ２８４６．５１４ １２６．６５４２＊＊ ３．３６ ５．６７
一次分量 １ ９６５３．５９０２ ９６５３．５９０２ ４２９．５３１４＊ ２２５ ５６３
二次分量 １ １７１４．７１０５ １７１４．７１０５ ７６．２９５２ ２２５ ５６３
三次分量 １ １．１５５ １．１５５ ０．０５１４ ２２５ ５６３
四次分量 １ １６．６０ １６．６０ ０．７３８６ ２２５ ５６３
离回归 １１ ２４７．２２１８ ２２．４７４７
总变异 １５ １１６３３．２７７
注：＊和＊＊分别表示差异显著（Ｐ＜０．０５）和极显著（Ｐ＜０．０１）
Ｎｏｔｅ：＊ａｎｄ＊＊ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ０．０５ａｎｄ ０．０１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
Ｆ检验表明，一次分量达显著水平，四次正交多
项式回归达极显著水平，可见配合四次正交多项式
是合适的。其回归估计标准误为：
Ｓｙ／ｘ，ｘ２，ｘ３，ｘ４＝
Ｑ４
ｎ－ｋ槡 －１＝４．７４０８
离子束注入剂量和羊柴存活率的相关指数为：
Ｒ４＝０．９８９３＞Ｒ０．０１（０．６８４），故ｙ和ｘ 的四次正交
多项式的相关为极显著。对于决定系数，则有：Ｒ４２
＝０．９７８７，这表明，羊柴发芽率总变异有９７．８７％可
由注入剂量的四次正交多项式说明。
图２和表１，２的结果表明羊柴种子在离子注入
处理时存活率的剂量效应是很明显的，从总体上来
看，离子注入羊柴种子的剂量－存活率关系是先降
再升再降低的“马鞍型”曲线［１５］。在剂量７００×２．６
×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２以内时发芽率较高，在８００×２．６
×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２剂量处，存活率达到了“鞍桥”前
的最小值，为８１．３％，随后存活率随剂量增加有所
回升，在９００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２处达到了半致
死剂量附近存活率的最大值，为８３．３％，在这个剂
量以后，存活率随着剂量的增加持续下降，直到接近
于零，半致死剂量在１２００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２附
近。在传统的辐射研究中，诱变的最佳作用点为半
致死剂量，低能离子束作用的剂量－存活率的“马鞍
型”关系己经在许多生物材料上得到验证，这充分说
明了离子束与生物材料作用的复杂性和作用机制的
独特性。所以对离子束注入羊柴存活率－剂量的特
殊关系，本研究基于这样的一个考虑，在半致死剂量
附近存活率的最大值８３．３％出现在９００×２．６×
１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２剂量，在８００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２
剂量处，存活率达到了“鞍桥”前的最小值，为８１．３％。
表明低能离子己经作用到了羊柴的胚部位，意味着
在该剂量下羊柴的种皮上“通道”己经形成，具备了
外源全ＤＮＡ转化的条件。随着注入剂量的增加，
可能启动了某些修复机制，导致了存活率的回升，损
伤也越来越严重，可能超出了修复机制的作用限度，
引起存活率重新下降［１６］。这就是说，在较低的剂量
下，外源全ＤＮＡ向羊柴胚细胞转化的条件己经具
备，在存活率的最高点，某些修复机制对内部的一些
损伤进行了一定程度的修复。因此，最终转化剂量
范围应该在（８００，９００，１０００）×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２
之间，在这个范围内，外源全ＤＮＡ转化的条件己经
形成，损伤又得到了部分修复，而更严重的损伤点
（半致死剂量）还没有到来。
２．５ 卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）敏感性检测
在遗传转化中，除了有效的外源基因导入方法
和组织培养体系外，转化个体筛选是一个十分关键
的步骤，选择适宜的抗生素筛选条件是转基因工作
顺利进行的前提。试验取生长状态一致的新鲜愈伤
组织各５０枚，接种于添加梯度浓度 Ｋａｎ的 ＭＳ愈
伤继代培养基上，２周继代１次，统计培养继代２次
后愈伤组织的相对增长量（图３）。没有加入卡那霉
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草 地 学 报 第１９卷
素的对照组，继代２次后所有的愈伤组织块均正常
生长，在Ｋａｎ浓度为２０ｍｇ·Ｌ－１的培养基上，它们
的愈伤相对重量增长率是２４．７４％，在Ｋａｎ浓度为
４０ｍｇ·Ｌ－１ 的培养基上，愈伤相对增长率为
２０．１２％，在Ｋａｎ浓度为６０ｍｇ·Ｌ－１的培养基上，
愈伤相对增长率为１０．５３％，当 Ｋａｎ浓度为８０
ｍｇ·Ｌ－１时愈伤相对增长率为５．２６％，才能完全抑
制其愈伤组织的生长，在Ｋａｎ浓度为１００ｍｇ·Ｌ－１
的培养基上，愈伤相对重量增长率是２．３８％。结果
表明Ｋａｎ浓度的增加对愈伤组织生长有很强的抑
制作用，且在较高Ｋａｎ浓度的培养基上愈伤组织大
部分褐化，不易成活。８０～１００ｍｇ·Ｌ－１的抑制效
果虽然很高，但考虑到过高的浓度同样会抑制转化
克隆子的生长，因此本研究选用６０ｍｇ·Ｌ－１的卡那
霉素作为转化试验的筛选浓度。
图３ 愈伤组织对抗菌素的敏感性
Ｆｉｇ．３ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃａｌｕｓ
２．６ ＧＵＳ染色结果
取共培养３ｄ的羊柴成熟种子做ＧＵＳ活性检
测，所试验的１００块处理样品均显不同程度的蓝色，
结果，在试验中设置的２组对照，一组为接受同样的
离子束注入处理，但未经过质粒ＤＮＡ处理的对照，
没有获得染出蓝色的种子，说明转化后代的变化不
是由于离子注入诱变引起的；而另一组未接受注入
处理，直接用质粒ＤＮＡ溶液浸泡种子，在本试验体
系下同样未获得染出蓝色的种子，说明离子注入与
浸泡转化法相比具有相当的优越性。剂量为８００×
２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２处理组检测到的ＧＵＳ基因的
瞬间表达率为８％，剂量为９００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２
处理组检测到的ＧＵＳ基因瞬间表达率为１３％，剂
量为１０００×２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２处理组检测到的
ＧＵＳ基因瞬间表达率为５％，但种子染色程度不同，
有的全部染成蓝色，而有的只有胚部染成了蓝色（图
４）。这也许与受辐照的面积、质粒ＤＮＡ浓度、温育
时间等有关。吴丽芳［１７］用离子束介导ＧＵＳ基因直
接导入小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）成熟胚的过程中发
现，种子消毒后，如果用镊子撕去胚部种皮，使胚部
能够直接接受离子注入，虽然在无菌条件下生长的
剥皮种子存活率低于接受相同剂量注入的完整种子
存活率，但外源ＧＵＳ基因的表达效果却与之相反，
剥皮种子有蓝色反应个体的比例高于完整种子，看
来胚部没有种皮的存在，离子注入刻蚀的效果是不
同的。因此，在转化试验中，可采用低于处理完整种
子的剂量对胚部剥皮种子进行注入处理，来改善外
源基因的导入效果。虽然本试验得到了ＧＵＳ基因
瞬间表达的结果，但转化效率仍然很低，需要继续多
次重复试验，以得到比较理想的转化结果。
２．７ 转化体的ＰＣＲ检测结果
按照博大泰克基因组小提试剂盒提取培养基上
筛选出的抗性愈伤组织和未转入外源基因的羊柴愈
伤组织的基因组ＤＮＡ，进行ＰＣＲ反应，得到的ＰＣＲ
检测结果图５所示。
图４ 羊柴愈伤组织ＧＵＳ染色结果
Ｆｉｇ．４ ＧＵＳ ｄｙｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍｃａｌｕｓ
注：ａ：阴性对照ＣＫ１，ｂ：阴性对照ＣＫ２，ｃ：阳性转化
Ｎｏｔｅ：ａ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＣＫ１，ｂ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＣＫ２，ｃ：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
０４０１
第６期 陈玲玲等：应用低能Ｎ＋介导法将大豆外源基因转入羊柴成熟种子的初步研究
转化体的ＰＣＲ检测结果表明，５个样品中有３
个样品（电泳结果中的泳道４，５，８）扩增出与阳性对
照（泳道３）相同的１５２０ｂｐ Ｇｙ３亚基的ｃＤＮＡ基因
片段，而其余２个样品（泳道６，７）和阴性对照（泳道
１，２）均未能扩增出预期大小的片段。初步证明大豆
基因已整合到羊柴基因组中。
图５ ＰＣＲ检测结果
Ｆｉｇ．５ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ
注：Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（λＤＮＡ／ＥｃｏＲⅠ＋ＨｉｎｄⅢ ｍａｒｋｅｒ）；
１，２：阴性对照；３：阳性对照；４，５，６，７，８：转化体
Ｎｏｔｅ：Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１，２：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；
３：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；４，５，６，７，８：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ
３ 讨论与结论
通过用不同剂量的 Ｎ＋离子处理羊柴种子，在
发芽率上表现出２种效应：低剂量的促进效应和高
剂量的抑制作用、损伤效应。转化剂量是离子束介
导外源全ＤＮＡ转化试验成败的关键，在保证外源
ＤＮＡ片段能转化进受体细胞的基础上，应尽量减少
转化过程中离子注入本身产生的诱变效应［１８］。依
据这一原则，本试验首先根据离子注入羊柴干种子
剂量－存活率曲线选择一个剂量范围。干种子合适
的转化剂量范围是（８００，９００，１０００）×２．６×１０１３
Ｎ＋·ｃｍ－２，通过比较实际转化试验中瞬间表达率
随剂量增加的差异，选定最佳的转化剂量为９００×
２．６×１０１３ Ｎ＋·ｃｍ－２。对羊柴种子发芽率的方差
分析可知，所选择的 Ｎ＋离子注入剂量之间存在差
异。因此，在离子束注入过程中，应针对不同品种、
不同的处理目的灵活设计合适的剂量范围、剂量梯
度，并采取不同处理方式。
羊柴的干种子接受离子注入后经过质粒ＤＮＡ
处理，ＧＵＳ染色得到最高的瞬间表达率在１３％左
右。而接受同样的离子束注入处理，但未经过质粒
ＤＮＡ处理的对照，没有获得染上蓝色的种子，说明
转化后代的变化不是由于离子注入诱变引起的；而
另一组未接受注入处理，直接用质粒ＤＮＡ 溶液浸
泡种子，在本试验体系下同样未获得染上蓝色的种
子，说明离子注入与浸泡转化法相比具有相当的优
越性。ＰＣＲ鉴定结果显示，选用Ｎ＋为注入离子，能
将克隆的大豆Ｇｙ３亚基基因转入羊柴中。研究结
果表明，离子束介导转基因是可行的。低能离子束
介导的转化效率与离子注入能量、剂量、离子种类等
参数有关，有效的阳性转化个体筛选体系是转化成
功的前提。通过优化注入条件来稳定和进一步提高
转化效率有待于更深入地进行研究。
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（责任编辑 吕进英）
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